Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 14
1.1. Экссудативно-геморрагические поражения сетчатки 14
1.2. Процессы перекисного окисления липидов при экссудативно- геморрагических поражениях-сет-чатки
1.3. Содержания про- и противоспалительных цитокинов при заболеваниях глаз 31
1.4. Состояние системы комплимента при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки 43
1.5. Биологические эффекты пептидных биорегуляторов 46
Глава II. Материалы и методы исследований 54
2.1. Методы получения биологических материалов 55
2.2. Методы изучения врожденного и адаптивного иммунитета 56
2.3. Методы исследования коагуляционной активности крови и слезной жидкости 58
2.4. Методы изучения показателей липидного обмена и системы «ПОЛ-антиоксиданты» 59
2.5. Методы исследования зрительных функций больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатой оболочки 62
2.6. Статистический анализ 66
2.7.Характеристика больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатой оболочки 67
Глава III. Особенности врожденного и адаптивного иммунитета при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки 73
Глава IV. Содержание некоторых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у пациентов с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки 85
Глава V. Состояние сосудисто-тромбоцитарного, коагуляционного гемостаза и фибринолиза у больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки 114
Глава VI. Процессы свободнорадикального окисления при экссудативно^геморрагических заболеваниях сетчатой оболочки 119
Глава VII. Морфофункциональные изменения при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатой оболочки 149
Глава VIII. Зрительные функции у пациентов с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатой оболочки глаза 174
Глава IX. Отдаленные результаты применения пептидных биорегуляторов 213
Глава X. Корреляционный и многофакторный анализ в прогнозе развития экссудативных поражений сетчатой оболочки 221
Обсуждение результатов исследования 229
Выводы 267
Список литературы
- Процессы перекисного окисления липидов при экссудативно- геморрагических поражениях-сет-чатки
- Методы изучения врожденного и адаптивного иммунитета
- Особенности врожденного и адаптивного иммунитета при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки
- Содержание некоторых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у пациентов с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одно из первых мест по причине возникновения слепоты и слабовидения занимает поражение сетчатой оболочки глаза, которое является осложнением, часто наблюдаемым при таких заболеваниях, как атеросклероз, сахарный диабет и артериальная гипертензияя. Общим для всех них в конечном итоге является слабовидение или полная слепота (Аветисов С.А., 2008; Нероев В.В., 2010; Киселева Т.Н., Иванишко Ю.А., 2010; Mones J., 2011). Сетчатая оболочка служит мишенью при различной соматической патологии, но прямая зависимость между тяжестью общего заболевания и изменениями на глазном дне не всегда выявляется. Патологические сдвиги на сетчатке могут предшествовать клиническим проявлениям общей патологии (Либман Е.С., Теплинская Л.Е., 2010).
В мире возросла доля пожилого населения, и на первое место по инвалидности в связи с утратой зрения выходит диабетическая ретинопатия (ДР), макулярная дегенерация (МД) и глаукома. По данным ВОЗ (2008), в XXI столетии дистрофические поражения сетчатки, наряду с онкологическими заболеваниями, окажутся ведущей причиной, приводящей к инвалидности.
Вместе с тем, до последних дней остаются мало изученными патогенетические механизмы экссудативно-геморрагических поражений сетчатки. Не приходится сомневаться, что в зависимости от основного заболевания, предшествующего развитию патологического процесса в сетчатой оболочке глаза, пути подхода к терапии должны быть различны. Более того, большинство исследователей, изучая вопросы патогенеза деструктивных процессов в сетчатке, обращали внимание, главным образом. на общие сдвиги в иммунитете, процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), состоянии системы комплемента и гемостаза и др. (Заангирова Г.Г., 2008; Edvards A.O., Miyazaki О., 2005). Работ, посвященных комплексному исследованию этих систем и местных процессов, протекающих непосредственно в сетчатой оболочки глаза, практически нет (Лысенко Н.Л., 2007; Сдобникова С.И., Астахов Ю.С., 2009). Без решения же этих задач вряд ли можно разобраться в сложных механизмах патогенеза экссудативно-геморрагических проявлений в сетчатке и, следовательно, рассчитывать на улучшение эффективности терапии.
Известно, что стабилизация патологического процесса при заболеваниях сетчатки наблюдается крайне редко, чаще ретинальная патология неуклонно прогрессирует, все больше нарушая зрительные функции и приводя пациента к необратимой их утрате (Максимов И.Б., Бойко Э.Б., 2008; Щуко А.Г., Малышев В.В., Алпатов С.А., 2011).
Многочисленные работы, связанные с поиском новых, более современных методов терапии, свидетельствуют о том, что нет достаточно эффективного лечения, которое могло бы значительно повысить зрительные функции или предотвратить резкое прогрессирование процесса. Это возможно объяснить полиэтиологичностью процессов в сетчатке и разнонаправленностью механизмов повреждения. В то же время недостаток эффективных способов лечения поражений сетчатки делает эту проблему для офтальмологии особенно актуальной (Мошетова Л. К. и соавт., 2011; Kanski J.J., 2006; Koskas G., 2007).
При любом патологическом процессе происходит нарушение переноса информационных молекул, представляющих по своей структуре полипептиды, от клетки к клетке (Хавинсон В.Х. и соавт., 1998-2010; Коркушко О.В. и соавт., 2003, 2006; Анисимов В.Н., 2008). Вот почему мероприятия, направленные на усиление синтеза регуляторных пептидов в организме или введение их извне, могут способствовать ликвидации патологического процесса и восстановлению утраченных функций (Морозов В.Г. и соавт., 2000, 2006; Кузник Б.И. и соавт., 2008). Актуальным остается изучение ретинопротекторных механизмов действия препаратов, определяющих структурную и функциональную специализацию клеток сетчатки, с целью патогенетического лечения (Трофимова С.В., 2008).
Решение этих проблем служит основанием для изучения механизмов развития патологического процесса в сетчатке.
Исходя из вышесказанного, нами были сформулированы следующие цель и задачи исследования.
Цель исследования. Изучить патогенетические закономерности развития экссудативно-геморрагических поражений сетчатой оболочки глаза и на основании полученных данных обосновать применение ретинопротекторной терапии.
В связи со сказанным нами решались следующие задачи:
-
Изучить состояние врожденного и адаптивного иммунитета в крови и слезной жидкости у больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки.
-
Установить, какие сдвиги происходят в содержании провоспалительных (IL-1, IL-1, IL-8, TNF) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов и ростовых факторов (TGF, TGF) в крови и слезе в зависимости от различных клинических вариантов поражения сетчатки.
-
Проследить, как изменяется состояние сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза в крови, а также показателей прокоагулянтной и фибринолитической активности в слезной жидкости при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки.
-
Исследовать параметры системы ПОЛ-антиоксиданты в крови и слезной жидкости при различных экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки.
-
Изучить с помощью когерентной томографии и электроретинографии закономерности морфологических и функциональных сдвигов, влияющих на изменение центрального и периферического зрения у больных с поражениями сетчатки.
-
Оценить характер корреляционных взаимосвязей между уровнем цитокинов, продуктов системы ПОЛ-антиоксиданты в крови и слезной жидкости и степенью пролиферативных реакций. На основе полученных данных разработать прогностические критерии исходов воспалительного процесса при экссудативно-геморрагических заболеваниях сетчатки.
-
Патогенетически обосновать применение ретинопротекторной терапии пептидными биорегуляторами ретиналамином и кортексином и оценить её результаты в динамике многолетних наблюдений.
Научная новизна. Впервые установлено значение дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов слезной жидкости в патогенезе экссудативно-геморрагических поражений сетчатки. Выявлено, что у пациентов с препролиферативной стадией диабетической ретинопатии в крови и слезной жидкости преимущественно возрастает уровень TNFa. При прогрессировании процесса и перехода в пролиферативную стадию его концентрация резко падает. При экссудативной форме макулярной дегенерации в большей степени в слезной жидкости повышается содержании IL-8. При острых нарушениях кровообращения в сосудах сетчатки в слезе значительно увеличивается содержание всех исследуемых цитокинов. При атрофии диска зрительного нерва и посттромботической ретинопатии в слезной жидкости превалирует содержание IL-4 и IL-10.
Концентрация TGF и особенно TGFb в слезной жидкости повышена и находится в прямой зависимости от вида и стадии заболевания. Экссудативно-геморрагическая форма макулодистрофии по сравнению с контролем характеризуется увеличением в слезной жидкости TGF в 2,3, а TGF в – 1,7 раза. При препролиферативной и пролиферативной формах ДР уровень TGF в слезе возрастает в 2, а TGF – в 37 раз. У больных с тромбозом вен сетчатки в слезной жидкости содержание TGF повышается в 36 раз. При возникновении посттромботической неоваскулярной глаукомы локальный уровень TGF увеличивается в 14, а TGF – в 40 раз, тогда как у больных с тромбоэмболией центральной артерии сетчатки и ее ветвей содержание как TGF, так и TGF повышалось приблизительно в 12 раз.
В слезной жидкости больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатой оболочки независимо от характера патологического процесса наблюдается активация альтернативного пути системы комплемента, что способствует усилению дегенеративных процессов. Одновременно у таких больных увеличивается содержание С1-ингибитора.
У больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки наблюдается усиление агрегации тромбоцитов и развитие гиперкоагуляции. При МД и препролиферативной ДР фибринолитическая активность возрастает, а при тромбозах и их последствиях – тормозится. В слезе при дегенеративных поражениях сетчатки увеличивается концентрация прокоагулянтов и ингибиторов фибринолиза, что способствует развитию тромботических осложнений.
При экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки в слезной жидкости повышается содержание ТБК-активных продуктов и снижается уровень факторов антиоксидантной защиты. Эти сдвиги выражены тем сильнее, чем интенсивнее протекает патологический процесс.
Впервые установлено, что увеличение концентрации ТБК-активных продуктов в слезной жидкости больных по сравнению со здоровыми более чем в 2 раза является неблагоприятным прогностическим признаком, свидетельствующим об усилении экссудативно-геморрагических проявлений в сетчатой оболочке (патент на изобретение № 2291433).
Впервые предложены схемы комплексного применения пептидных биорегуляторов кортексина и ретиналамина в лечении экссудативно-геморрагических поражений сетчатой оболочки глаза, эффективность которых подтверждена многолетними наблюдениями.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволили оценить роль иммунных, биохимических и молекулярных механизмов в патогенезе экссудативно-геморрагических поражений сетчатой оболочки глаза. Установлено значение нарушений врожденного и адаптивного иммунитета, про- и противовоспалительных цитокинов, трансформирующих факторов роста, коагулологических сдвигов и процессов ПОЛ в особенностях течения воспалительных реакций при экссудативно-геморрагических заболеваниях глаз. Разработана схема комплексного применения биорегуляторов – кортексина и ретиналамина – при различных вариантах экссудативно-воспалительных заболеваний сетчатки. Предложен способ прогнозирования течения воспалительного процесса при экссудативно-геморрагических заболеваниях глаз (патент на изобретение № 2291433).
Внедрение результатов
Результаты исследований внедрены в практическую работу офтальмологических отделений Краевой клинической больницы, Краевой детской клинической больницы, Дорожной больницы, 321 Окружного военного госпиталя, 1-й Городской клинической больницы, а также вошли в инструкцию Фарм. комитета РФ по применению ретиналамина в клинической практике (постановление от 02.02.1996) На основании полученных фактов опубликована монография «Слеза при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки». Полученные данные используются в учебном процессе на кафедрах госпитальной терапии и эндокринологии, офтальмологии, патологической физиологии ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия, на кафедре офтальмологии Иркутского государственного медицинского университета
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки выявляются нарушения в клеточном и гуморальном иммунитете, что зависит от характера основного заболевания и тяжести патологического процесса. При поражениях глаз, возникших на фоне сахарного диабета 1 типа, соотношение клеток CD4+/CD8+ повышается, а при сахарном диабете 2 типа, атеросклерозе и артериальной гипертензии не изменяется или снижается. Одновременно при исследуемых заболеваниях сетчатой оболочки отмечается дисбаланс уровня иммуноглобулинов и значительное повышение уровня IL-1, TNF, TGF и TGF. Увеличение концентрации TGF в 20–40 раз при препролиферативной и пролиферативной ДР является фактором риска острых нарушений кровообращения в сосудах сетчатой оболочки.
-
У больных, независимо от клинических вариантов заболевания, выявляется повышение концентрации фактора Н, компонента С5 и фрагментов С3а, С5а системы комплемента, что свидетельствует об активации альтернативного пути системы комплемента и способствует усилению дегенеративных процессов в сетчатке. Кроме того, у этих пациентов отмечается снижение уровня С3 и С4 компонентов комплемента и увеличение содержание С1-ингибитора.
-
У пациентов с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки наблюдается гиперкоагуляция и торможение фибринолиза, а также значительное повышение прокоагулянтной и снижение фибринолитической активности слезной жидкости.
-
У больных с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки в слезе обнаружено усиление процессов ПОЛ при снижении факторов антиоксидантной защиты. Увеличение содержания ТБК-активных продуктов в слезной жидкости является критерием прогрессирования экссудативно-геморрагических процессов в сетчатой оболочке.
-
Морфологические изменения, регистрируемые в сетчатой оболочке глаза в динамике экссудативно-геморрагических поражений, отражают тяжесть патологического процесса.
-
Коррекция экссудативно-геморрагических поражений сетчатки с использованием ретиналамина и кортексина сопровождается улучшением или нормализацией системы ПОЛ-антиоксиданты, что приводит к благоприятному исходу заболеваний.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на конференции «Проблемы прогнозирования в современном мире» (Чита, 1999), «Экологическая патология и ее фармакокоррекция» (Чита, 2002), «Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике» (Чита, 2002), 10-ом Российско-Японском международном медицинском симпозиуме «Якутия, 2003», конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология – достижения и перспективы», посвященной 80-летию проф. Д.Я. Шурыгина (С–Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию образования ГОУ ЧГМА (Чита, 2003), конференции «Федоровские чтения» (Москва, 2003), 3-м Байкальском экономическом форуме Всероссийского конгресса «Человек и здоровье» (Иркутск, 2004), конференциях, посвященных 15-летию филиалов ГУ МНТК «Микрохирургия глаза» (Иркутск, Новосибирск, Оренбург, 2006), Всероссийском съезде офтальмологов России (Москва, 2005), 5 Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2006), 7-й Тихоокеанской конференции (Владивосток, 2006), Всероссийской конференции «Макула-2008, 2010» (Ростов-на-Дону, 2008, 2010), Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию офтальмологической службы Забайкалья (Чита, 2009), Всероссийском съезде офтальмологов России (Москва, 2010), Межрегиональной конференции, посвященной 85-летию офтальмологической службы республики Саха-Якутия (Якутск, 2010), 44-ой научно-практической конференции, посвященной 70-летию образования Курганского областного госпиталя (Курган, 2011), Научно-практической конференции «Восток-Запад» с международным участием (Уфа, 2011), Межрегиональной научно-практической конференции «Байкальские чтения» (Иркутск, 2011).
Публикации. Опубликована 51 научная работа, из них 15 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 326 страницах машинописного текста и состоит из введения, 10 глав, заключения (обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, иллюстрирована 82 таблицами и 27 рисунками. Указатель литературы включает 269 отечественных и 221 зарубежных авторов.
Процессы перекисного окисления липидов при экссудативно- геморрагических поражениях-сет-чатки
В настоящее время известно, что повреждение клеток и нарушение их функции в значительной степени обусловлены нарушением липидного компонента их мембраны [287, 320, 322]. В основе этого процесса может лежать активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящая к изменению состава мембран [339]. Под процессами ПОЛ традиционно понимают свободнорадикальное окисление полиненасыщенных жирных кислот в биологических системах. Преобладание продуктов ПОЛ над стационарным уровнем рассматривается как универсальный механизм повреждения клеточных мембран при различных патологических состояниях [103, 120, 197, 201, 221, 285, 287, 314, 327, 403, 416, 431].
При окислительном стрессе происходит усиленное образования активных форм кислорода (АФК) таких, как супероксидный анион-радикала О г, гидроксил-радикала НО , оксида азота NO и потенциальных эндогенных прооксидантов (пероксид водорода, липогидропероксид) и органических свободных радикалов. При этом в повреждении „мембр_ан_играют_роль_ не только первичные продукты ПОЛ, но и образующиеся при окислительной деструкции липидных гидропероксидов вторичные продукты [320, 322]. К ним относятся соединения альдегидной природы: 4 гидроксиноненаль и малоновый диальдегид. Первичные и вторичные продукты ПОЛ оказывают повреждающее действие на биомембраны и молекулы жизненно важных полимеров (белки, нуклеиновые кислоты) и приводят к запуску цитокинового каскада [334,421].
Большое значение при гипоксии и ишемии придается явлению глутоматной нейротоксичности. Это ведет к развитию каскада реакций, включая нарастание уровня внутриклеточного Са2+, нарушение работы митохондриальных ферментов, активацию перекисного окисления липидов, увеличения синтеза оксда азота (NO). Активация последнего может происходить в результате воздействия различных провоспалительных цитокинов (IL-la, IL-6, IFNy), которые вырабатываются в ответ на повреждение клетки. Синтез NO, в свою очередь, опосредует образование других цитокинов. Взаимодействуя с активными формами кислорода, оксид азота вызывает генерацию восокотоксичных продуктов, в частности, пероскинитрита, что ведет к повреждению клеточных структур, в том числе и ДНК клеток, а также запускает синтез белков апоптоза [17, 108, 114, 219, 308].
Риск свободнорадикального повреждения в сетчатке особенно велик. Это обусловлено тем, что ткани глаза непрерывно подвергаются воздействию света, способного осуществлять фотоинициирование процесса ПОЛ и, тем самым, вызывать деструкцию клеточных мембран, приводящих к помутнению световоспринимающих элементов. Кроме того, липиды сетчатой оболочки по своему составу характеризуются высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, составляющих основной субстрат ПОЛ. Так, в мембранных структурах сетчатки более половины фосфолипидов содержат полиеновые жирнокислотные остатки, восприимчивые к атаке липи-дными-радикалами и активньїми юріушуга ислорода [314 444, 445, 446, 477, 518]. Именно нейросенсорные клетки являются одной из наиболее поражаемых структур сетчатки, как при световом, так и при ионизирующем облучении [145, 488, 521]. Появление очагов дистрофии связано с длительной ишемией отечной сетчатки [12]. В свою очередь, ишемические оптикопатии приводят к нарушению гематоофтальмического барьера и к образованию активных форм кислорода клетками конъюнктивы, роговицы, нейтрофилами и макрофагами, мигрирующими в слезную жидкость.
Продукты ПОЛ накапливаются в сетчатке, нарушают функционально-структурную целостность нейроцитов и снижают чувствительность зрительного анализатора [223, 419, 452]. В сетчатой оболочке глаза функцию физиологической антиоксидантной системы осуществляют хромотофоры и, благодаря наличию меланосом в клетках пигментного эпителия (ПЭС), оказывают мощное антиокислительное действие. Оно проявляется при развитии процессов ПОЛ, индуцируемых различными повреждающими факторами. Клетки ПЭС богаты микропероксисомами, которые обладают каталазной активностью. Эти органеллы участвуют в детоксикации Н202. Именно пероксидазная активность была обнаружена в гомогенатах и в субклеточных фрагментах ПЭС, причем ее величина сопоставима с пероксидазной активностью лейкоцитов [116, 350, 419, 522, 557].
В организме существуют регуляторные механизмы, ограничивающие накопление продуктов перекисного окисления липидов [14, 22, 190, 216]. К ним относятся антиоксидантные высокомолекулярные ферменты: супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатионпероксидаза (ГП), глутатион-Б-трансфераза, NAD(P)H", глутатион - и аскорбатзависимые ферментные системы биогенерации антиоксидантов и окисленного глутатиона [96, 129, 182, 221, 557] .
Защита представлена СОД и каталазой, которые предотвращают образование гидроксил-радикала из О г и Н2С 2. Если образование НО произошло, то этот активный радикал индуцирует окисление полиеновых липидов с образованием липидных радикалов [320]. На следующем этапе эти радикалы взаимодействуют с природным антиоксидантом а-токоферолом (витамин Е), функционирующим как «ловушка радикалов» [322. 326]. Третья линия защиты представлена глутатионпероксидазами и глутатион-S-трансферазами, а также ферментными системами биогенерации окисленного глутатиона. Поврежденные ткани подвержены перекисному окислению липидов в гораздо большей степени, чем здоровые [191, 246]. Причинами этого, вероятно, являются инактивация некоторых биоантиоксидантов, утечка антиоксидантов из поврежденных клеток и выделение ионов металлов (особенно железа и меди).
Ряд исследований свидетельствует о влиянии патологически протекающих окислительно-восстановительных процессов на развитие поражений сетчатки, что связывают с низким содержанием в крови глутатион - редуктазы и пероксидазы [414, 546, 553]. Экспериментально установлено, что при сочетании гиперхолестеринемии с хроническим стрессом и гиподинамией возникающие нарушения энергетического обмена и окислительно-восстановительных процессов в эндотелиальных клетках капилляров приводят к функциональной неполноценности эндотелиоцитов с изменением структуры их мембран, что также сопрововождается нарушением микроциркуляции и развитием хориоретинопатии [382, 407, 421, 422]. Сопряженное с неферментативным гликозилированием аутоокисление глюкозы, а также липидов и белков, сопровождается повышением уровня свободных радикалов - активных форм кислорода, супероксид-аниона, гидроксила. Провоцировать их образование могут недоокисленные продукты гликозилирования и конечные продукты гликолиза [23, 76, 163, 208, 239]. В развитии ДР определенную роль играют изменения, связанные с синтезом оксида азота, который является свободным радикалом. Это подтверждается гиперагрегацией тромбоцитов, снижением фибринолиза, нарушением микроциркуляции, развитием окклюзии сосудов сетчатки, возникающих при прогрессировании диабетической ретинопатии. Однако ишемические процессы в сетчатке активизируют продукцию оксида азота. Многофакторные механизмы действия оксида азота во многом зависят от стадии заболевания. При гипергликемии в состоянии окислительного стресса изменяется содержание супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионредуктазы, глютатионпероксидазы, что приводит к ослаблению системы антиокислительной защиты и усиливает окислительный стресс. В результате этих нарушений возникают и более массивные повреждения клеток и тканей [1, 150, 475, 558].
При сахарном диабете происходит повышение уровня глюкозы в крови. Хроническая гипергликемия приводит к резкому ускорению процессов гликозилирования белков. Продукты гликозилирования являются источниками свободных радикалов и усугубляют оксидативный стресс. Одновременно тканевая гипоксия, развивающаяся при сахарном диабете, сопровождается усилением процессов ПОЛ. Известно, что развитие возрастных МД и ДР сопровождается повышенным образованием свободных радикалов [285, 287, 296, 317], а наиболее интенсивные процессы ПОЛ происходят в рецепторном слое сетчатки и пигментном эпителии [14]. Исследование ТБК - активных продуктов и каталазы в слезной жидкости при ДР и МД выявили более ранние изменения этих показателей по сравнению с группой, в которой определение продуктов ПОЛ проводили стандартными методами[60, 91].
Методы изучения врожденного и адаптивного иммунитета
Содержание отдельных видов лимфоцитов определялось иммунофлюоресцентным методом по Е Reinherz (1979), с использованием моноклональных антител. Кроме того, подсчет основных субпопуляций лимфоцитов произведен на проточном цитометре Epics XL-MCL фирмы Beckman Coulter (реактивы Immunotech, поставка компании «Биохиммакс») с выявлением поверхностных маркеров лейкоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD 14+, CD 16+, CD 19+, CD45+, CD56+, HLA-DR+.
Исследования выполнялись в лаборатории по изучению гемостаза Городской клинической больницы №1 г. Читы. - Концентрацию IgA, IgM, IgG исследовали методом твердофазного ИФА с использованием двойных антител. Моноспецифические антитела против данных иммуноглобулинов иммобилизировали на внутренней поверхности лунок планшета для микротитрования. Второй тип антител против H+L цепей иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазай хрена вносили в лунки после инкубации исследуемых образцов крови или слезы с первыми антителами. Субстратным раствором, служил реактив, содержащий орто-фенилендиамин и перекись водорода. Интенсивность окраски определяли с помощью фотометра для микропланшетов при длине волны 485нм.
Для количественного определения цитокинов (IL-la, IL-1(3, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa) в крови и слёзной жидкости использовали наборы для иммуноферментного анализа (ИФА) ООО «Протеиновый контур» г. Санкт-Петербурга.
Реактивы: Стандартные образцы цитокинов, моноклональные биотинилированные антитела (АТ-2), коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, буфер С для разбавления образцов и коньюгата, буфер В для промывки, IN серная кислота, «реагент», «субстрат».
Ход определения: Количественную-оценку цитокинов-(1Ь-1 Ov-IL-1Р,—IL-4J-I-L-8—I-L-1-0- и TNFot) в слёзной жидкости производили с использованием коммерческих наборов реагентов ТОО «Протеиновый контур-тест» (г. С-Пб). Измерение их уровня определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью двойных антител и применением пероксидазы хрена. Один тип моноклональных антител против IL-la, IL-1J3, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa иммобилизировали на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекул цитокинов применяли в виде коньюгата с биотином. Индикаторным компонентом реакции являлся коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим высокое сродство к биотину. После стандартного режима инкубации образцов слезной жидкости с моноклональными антителами и последующих промывок в лунки микропланшета вносили коньюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубировали и добавляли субстрат с реагентом цветной реакции (3-диметиламинобензонат). После проявления окраски измеряли активность связанной пероксидазы с использованием фотометра для микропланшета с длиной волны 450 нм.
В качестве стандарта для сравнивания в каждой реакции служили рекомбинантные IL-la, IL-1(3, IL-4, IL-8, IL-10 и TNF-a, входящие в состав набора. По данным титрования стандартных образцов строили калибровочные графики для каждого из цитокинов, по которым определяли концентрацию IL-la, IL-ip, IL-4, IL-8, IL-10 и TNF-a в опытных образцах слезной жидкости [30]. - Трансформирующие факторы роста определяли с помощью реактивов фирмы «Биохиммакс» методом твердофазного ИФА.
Набор реактивов «ИФА-С5а», «ИФА-СЗа», «ИФА-СЗ», «ИФА-С4», «ИФА-С5», «ИФА-СІ-инг» предназначен для количественного определения СЗ, С5, С4 компонентов комплемента человека, С1-ингибитора комплемента и анафилотоксинов С5а и С-За комплемента человека в сыворотке крови человека и исследуемых образцах методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Содержание С1-ингибитора комплемента человека в нормальной плазме крови человека варьирует от 150 до 350 мкг/мл. Набор реактивов «ИФА-фН» предназначен для количественного определения фактора Н комплемента человека в плазме крови человека и исследуемых образцах методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Для определения количества тромбоцитов (метод G.Brecher) использовали гематологический анализатор Sysmex КХ-21 (Япония). Агрегационную функцию кровяных пластинок исследовали турбодиметрическим (фотометрическим) методом по G.V.R. Born (1962) с помощью агрегометра «Биола» (РГНЦ, Москва, 2002). В качестве индуктора агрегации использовали растворы АДФ в дозе 5мкг и 2,5мкг, коллагена и адреналина. Кривую агрегации оценивали по флуктуации светоотражения агрегатов и светопропусканию суспензии. В агрегатограмме определяли амплитуду и наклон кривой агрегации. Рассчитывались следующие параметры: Ттах - время, через которое выявляется максимальное значение показателя агрегации; Tmin - время, через которое выявляется минимальное значение показателя агрегации; А] - значение максимального показателя агрегации; А2 - значение максимального показателя агрегации после стимуляции (при спонтанной агрегации - значение максимального показателя); Ао/о - процент возрастания максимального показателя относительно исходного; А3 - значение минимального показателя агрегации после стимуляции; А4 - значение агрегации по истечении 2-х минут записи агрегатограммы.
Для исследования свертывания крови использовали реактивы и фибринтаймер фирм Behring (Германия), Технология-Стандарт (Барнаул). Применяли следующие методики: MHO; АЧТВ по M.J. Larrien, С. Weilard (1957); тромбиновое время по R.M. Biggs, R.G. Macfarlene (1962); уровень фибриногена устанавливали коагулологическим методом. Содержание антикоагулянтов АТ-Ш выявляли методом радиальной иммунодиффузии; определение РФМК в плазме - ортофенантролиновым тестом по А.П. Момоту (1987). Исследование экспрессии тканевого фактора лейкоцитами осуществляли по методу, предложенному R.A. Santucci et al. (2000). Фибринолиз оценивался по скорости растворения эуглобулинового сгустка по методу Н. Kowarzyk, К. Buluk (1954) и на фибриновых пластинах для определения фибринолитической активности для слезной жидкости. Прокоагуляционную активность слезы определяли по методу Сомова-Бржевского.
Особенности врожденного и адаптивного иммунитета при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки
В патогенезе глазных заболеваний, как и при многих других, важная роль принадлежит изменениям отдельных звеньев иммунной системы. Глаз является «забарьерным органом» и процесс формирования глазного яблока, как органа, завершается значительно раньше полного развития иммунной системы организма и поэтому, вследствие разобщения белков тканей глаза и иммунной системы, поддерживается возможность восприятия белков отдельных оболочек глазного яблока, как чужеродных. Наиболее патогенетически активным является S-антиген. Он известен как белок, вызывающий аутоиммунные увеиты у животных и участвующий в патогенезе воспалительных заболеваний сосудистой оболочки. Антиген сетчатки принадлежит к Т-зависимым и имеет общие антигенные детерминанты с антигенами сосудистой оболочки и базальной мембраны эндотелия сосудов микроциркуляторного русла. Нарушение клеточного иммунитета при сахарном диабете известно и может быть наследственно обусловлено при 1-ом типе и вследствие недостаточности инсулина при 1-ом и 2-ом типах диабета. Как изменяется клеточное звено иммунитета при разных формах диабетической ретинопатии, при ретинопатиях атеросклеротического происхождения, при тромбозах вен сетчатки, тромбэмболиях центральной артерии сетчатки и ее ветвей, при остром нарушении кровообращения в диске зрительного нерва, до конца не изучено, данные противоречивы. Поэтому мы сочли необходимым провести исследования показателей иммунитета.
Макулярная дегенерация экс-гемор. 12 6400±160 2110±55 1200±70 710±40 550±25 ! 808±15 1,3±0,2 Тромбоз вен сетчатки 24 6650±150 2000±65 1140±50 690±45 550±50 740±25 1,2±0,2 Посттромботическая ретинопатия 10 6590±180 2150±80 1230±75 650±72 580±25 798±30 1,2±0,1 Посттромбатическаянеоваскулярнаяглаукома 9 6120±170 2050±85 1190±75 640±72 580±30 820±35 1,1±0,1 Тромбэмболия ЦАС 10 6150±200 2020±60 1030±85 670±58 510±55 800±55 1,2±0,1 Нарушения кровообращения в ДЗН 10 6000±150 1850±90 1160±40 695±65 515±49 817±25 1,3±0,1 значимость различий по сравнению с контролем: р 0,05; р 0,01 Проведенные исследования показали, что содержание лейкоцитов при поражениях сетчатой оболочки не отличалось от контроля. Содержание лимфоцитов снижено у больных с тромбозами вен сетчатки на 12% (р 0,05) и нарушениями кровобращения в ЦАС на 14-16% (р 0,05). Концентрация лимфоцитов с маркером CD3+ падала на 13,5% (р 0,05) при острых нарушениях кровообращения в сосудах сетчатки. Содержание субпопуляций лимфоцитов с маркером CD4+ у всех пациентов составляло 71-83%) от нормы, но наиболее низкими они были у больных с тромбозом вен сетчатки и острыми нарушениями кровообращения (67,6% и 61,4% соответственно).
Количество лимфоцитов с маркером CD8+ у пациентов с макулярной дегенерацией составляет 85,7%) от нормы. Низкое содержание CD8 зарегистрировано при тромбэмболии ЦАС (79,65%) и неоваскулярной глаукоме (90,6% ). Такие показатели указывают на миграцию Т-киллеров в очаг поражения .
Содержание В-лимфоцитов (CD20+) колебалось незначительно. При тромбозе вен сетчатки - 91,2%) от контроля. Незначительное снижение содержания CD20+ при ТВС возможно объяснить малой лимфопенией и активизацией образования антител.
Соотношение CD4+/CD8+ у всех обследуемых групп оказалось на 0,5-0,2 ниже контроля за счет выраженного снижения CD4+ при незначительном уменьшении числа CD8+. Такой низкий индекс указывает на скрытый вторичный иммунодефицит. Обусловлен он основным заболеванием и возникшим хроническим стрессом вследствие быстро прогрессирующего ухудшения зрения.
Таким образом, у пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов, системными заболеваниями соединительной ткани и имеющих осложнения на сетчатой оболочке глаза, возникают выраженные сдвиги со стороны показателей клеточного иммунитета и дисбаланс в соотношении CD4+/CD8+.
Нами изучено содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови (как показателя общего гуморального иммунитета) и в слезной жидкости (как показателя локального гуморального иммунитета (таблица 4).
Содержание Ig-G в сыворотке крови при экссудативно-геморрагической форме макулярной дегенерации и тромбозе вен сетчатки снижается и составляет 85,5-91,4% (р 0,05) от контроля. При сухой форме МД концентрация IgG в сыворотке не угличалась,СУТ нормы. У больных_с_с_ посттромботической ретинопатией, с посттромботической неоваскулярной глаукомой уровень IgG в слезной жидкости был на 6-8% выше контроля. Таким образом установлено, что у больных с тяжелыми осложнениями при длительном течении заболевания содержание IgG в слезе нестабильно.
Концентрация IgA в сыворотке у всех больных была выше нормы. Значительное повышение уровня IgA (на 43-50%) обнаружено у пациентов с экссудативно-геморрагической формой МД, с тромбозами вен сетчатки. В слезной жидкости содержание IgA также у всех пациентов было выше, чем в контроле: при экссудативно-геморрагической форме макулярной дегенерации - 176%, при тромбозе вен сетчатки - 180%(р 0,001). Содержание IgM в сыворотке крови у всех пациентов было выше, чем у здоровых. При экссудативно-геморрагической форме макулярной дегенерации, тромбозе вен сетчатки и тромбэмболии ЦАС уровень IgM возрастал на 41-75% (р 0,05). Концентрация IgM в слезной жидкости у тех же больных оказалась выше, чем в сыворотке крови, на 25-50%(р 0,05). При сухой форме МД, непролиферативной ДР и посттромбатической неоваскулярной глаукоме содержание IgM в слезе было приблизительно таким же, как и у здоровых людей. Концентрация IgM в слёзной жидкости при тромбозе вен сетчатки возрасла до 192%) (р 0,05), при экссудативно -геморрагической форме макулярной дегенерации - и тромбэмболии ЦАС 78 до 164% (р 0,05) по отношению к контролю.
При посттромботической ретинопатии, нарушении кровообращения в ДЗН, в сыворотке крови отклонения в концентрации IgM от нормы были незначительные, тогда как в слезной жидкости его концентрация, по сравнению со здоровыми людьми, была выше на 21-42%(р 0,05).
Нами не было отмечено влияния пол бЪльных_на показатели иммунологической реактивности. Сдвиги в иммунограмме теснейшим образом зависели от вида патологии сетчатки и течения заболевания. Так, тромбоз вен сетчатки при сочетании с сахарным диабетом и артериальной гипертензией обусловливает более выраженные изменения в клеточном и гуморальном иммунитете.
Таким образом, при экссудативно-геморрагических поражениях сетчатки, возникающих у больных с атеросклерозом, гипертонической болезнью, сахарным диабетом, системными заболеваниями соединительной ткани, наблюдаются существенные сдвиги в исследуемых показателях иммунной системы. При сухой форме МД все показатели клеточного иммунитета оказались незначительно ниже нормы, тогда как гуморального в сыворотке крови соответствовали контрольным цифрам и незначительно были выше в слезной жидкости.
Содержание некоторых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у пациентов с экссудативно-геморрагическими поражениями сетчатки
Исследования проведены в сыворотке крови и в слёзной жидкости у 20 больных с сухой и у 21 - с экссудативно-геморрагической формой МД. Возраст и давность заболевания в обеих группах статистически не отличались. Определение цитокинов осуществлялось при поступлении в клинику и после стабилизации процесса в сетчатой оболочке (таблица 7).
Выявлено, что у здоровых людей содержание цитокинов в слезной жидкости было в 2 и более раз выше, чем в сыворотке. При сухой форме МД концентрация IL-8 в слезе повышалась на 69%, a TNFa - на 57% (р 0,05).
При экссудативно-геморрагической форме МД содержание цитокинов в сыворотке практически не отличается от данных, полученных при сухой форме. Показатели прововоспалительных цитокинов в слезной жидкости при экссудативной форме были выше, чем у здоровых (контроль) и у больных с сухой формой. Так, содержание IL-la в слезной жидкости при экссудативной форме по сравнению с сухой, оказалось выше на 40%, IL-1 (3 — на 72%; IL-8 - на 50%; TNF-a - на 272% (р 0,05).
К Контроль n-20 Сухая форма MD n-20 Экссудативно-геморрагическаяформаn-21 сыворотка слеза сыворотка слеза сыворотка слеза IL-la/IL-4 1,1+0,09 1,5±0,1 1,07+0,1 1,8+0,1 1,1+0,2 2,4+0,1 # IL-lp7IL-4 1,9±0,09 2,1+0,08 1,8+0,15 2,7+0,1 2,3+0,1# 4,6+0,15 # IL-8/IL-4 1,3+0,08 1,5+0,07 2,0+0,2 3,0+0,25 2,0+0,1 4,4+0,2 # TNF-a/IL-4 4,4+0,1 5,1+0,1 6,0±0,5 6,6+0,4 6,7±1,0 24,0+1,5 # IL-la/IL-10 1,3+0,07 2,0+0,09 1,0±0,2 1,5±0,1 1,0J:0,2 2,4+0,1 # IL-1(3/IL-10 2,1±0,1 3,3+0,15 1,7±0,1 2,4+0,2 2,0+0,l# 4,5+0,2 # IL-8/IL-10 1,4±0,1 2,3+0,09 1,9+0,1 2,7±0,15 1,6±0,2 4,4+0,1 # TNF-аЛЬ-Ю 4,5+0,2 6,9±0,1 5,6+1,1 6,0±1,0 5,0+1,0 24,0+3,0 # - значимость различий по сравнению с контролем. #- значимость различий между группами.
В слезной жидкости у больных содержание как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов уменьшилось, но оставалось выше, чем в группе сравнения: IL-la снизился на 32%, IL-1J3 - на 36%, IL-8 - на 44%, TNFa - на 51%, IL-4 - на 19% (р 0,05) (таблица 9). Таблица 9 Содержание цитокинов (пг/мл) у больных с макулярной дегенерацией через 1-1,5 месяца после госпитализации в стационар (M+SD).
Представленные нами данные свидетельствуют о том, что у пациентов с макулярной дегенерацией имеется дисбаланс в слезной жидкости в отношении провоспалительных к противовоспалительным цитокинам, боле выраженный при экссудативно-геморрагической форме. Чем больше нарушено это соотношение, тем более неблагоприятно протекает патологический процесс.
Состояние зрения при ДР во многом зависит от стадии и компенсации основного заболевания - сахарного диабета. Исследование цитокинов проведено в сыворотке крови и слезной жидкости при поступлении больного и через 1 месяц после начала терапии. В зависимости от формы ретинопатии больные разделены на группы. Группы больных по длительности заболевания и возрасту были практически однородны.
При препролиферативной форме ДР концентрация провоспалительных цитокинов как в сыворотке крови, так и в слезной жидкости значительно превышала показатели, характерные для здоровых людей. Особенно резко содержание исследуемых цитокинов возрастало в слезной жидкости. При препролиферативной форме ДР по сравнению с непролиферативной уровень провоспалительных цитокинов в слезной жидкости возрастал в 2- 4, a IL-10 -в 1,8 раза.
У больных с пролиферативной формой ДР концентрация противовоспалительных цитокинов в сыворотке оказалась приблизительно такой же, как и у здоровых людей. В то же время у этих больных в слезной жидкости уровень IL-la оказался ниже на 76%, IL-lf3 - на 86%, IL- 8 - на 90%, TNF-a - на 88%. Между тем, концентрация IL- 4 в слезе увеличилась более чем в 2, а IL- 10 - почти в 3 раза (р 0,05).
При пролиферативной форме ДР соотношение про- и противоспалительных цитокинов не отличается или" незначительно превосходит данные, обнаруженные у здоровых людей. Эта закономерность проявляется как в сыворотке крови, так и в слезе. Исключение из этого составляет коэфициент TNFa/IL-Ю, оказавшийся сниженным в слезе по сравнению с контролем более чем в 3 раза.
Повторные исследования концентрации цитокинов у больных диабетическими ретинопатиями проведены через месяц после госпитализации (таблица 13). При непролиферативной форме содержание всех исследуемых цитокинов после курса лечения в слезе приближалось к норме или слегка превосходило её. Противоположные сдвиги наблюдались у больных с пролиферативной формой ДР: после курса лечения концентрация провоспалительных цитокинов в слезе у них возросла, а противовоспалительных - снизилась. Так, содержание IL-1J3, IL-8, TNF-a повысилось приблизительно 2 раза, IL-4 снизилась на 30%, а IL-10 на 13%. Уровень противовоспалительных цитокинов в слезной жидкости оставался в 2 и более раз выше, чем в контроле.
