Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Трансформирующий фактор раста бета (ТФР-бета)... 9
1.2. Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа)... 16
1.3. Молекулярные механизмы активации мононуклеарных фагоцитов... 21
1.4. Молекулярные события, индуцируемые ионизирующей радиацией. Роль макрофагов и монокинов ТФР-бета и ФНО-альфа в процессе развития пострадиационного фиброза... ...27
Глава 2. Методы
2.1. Режим воздействия ионизирующей радиации ...32
2.2. Оценка функциональной активности макрофагов 33
2.3. Исследование синтеза протеинов 36
2.4. Исследование экспрессии генов 41
2.5. Статистическая обработка 52
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Экспрессия ТФР-бета и ФНО-альфа активированными макрофагами мыши 53
3.2. Динамика ответа перитонеальных макрофагов мыши и моноцитов периферической крови человека на активацию ЛПС 57
3.3. Экспрессия ТФР-бета и ФНО-альфа после воздействия ионизирующей радиации. 65
3.3.1. Влияние ионизирующей радиации на моноциты и макрофаги 65
3.3.2. Экспрессия ТФР-бета в коже свиней после воздействия ионизирующей радиации 76
Глава 4. Обсуждение результатов исследования .81
Выводы 91
Практические рекомендации 93
Список работ, опубликованных по теме диссертации 94
Список литературы
- Трансформирующий фактор раста бета (ТФР-бета)...
- Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа)...
- Режим воздействия ионизирующей радиации
- Экспрессия ТФР-бета и ФНО-альфа активированными макрофагами мыши
Введение к работе
Актуальность исследования. В последние годы макрофаг (МФ) вновь привлекает к себе внимание исследователей как клетка с чрезвычайно широким спектром биологической активности. Известно, что МФ является ключевой клеткой воспаления, антиген-презентирующей клеткой, участвует в противовирусной, противомикробной, противоопухолевой защите, в регенерации, репарации тканей и координирует функции различных звеньев иммунной системы. Показано, что активированный МФ продуцирует свыше 100 биологически активных веществ, от простейших по составу молекул -свободных радикалов кислорода до высокомолекулярных белковых соединений, среди которых протеолитические ферменты и ростовые факторы с разнонаправленными эффектами (Nathan С, 1991). Поэтому активация МФ может приводить как к стимуляции, так и к подавлению роста опухоли, что стало особенно очевидным после всесторонних исследований трансформирующего фактора роста бета (ТФР-бета) и фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) - противоположных по эффектам цитокинов, синтезируемых активированными МФ. Именно этим соединениям отводят первостепенную роль в эффектах МФ как in vivo, так и in vitro (Grotendorst R.G. et al., 1989). ФНО-альфа обладает сильным провоспалительным и катаболическим действием, антимикробной и противоопухолевой активностью (Nacy С.A et al., 1991). Напротив, ТФР-бета ускоряет заживление ран, обладает противовоспалительным эффектом, предотвращает или ослабляет септический шок, способен усиливать опухолевый рост как путем непосредственного влияния на пролиферацию опухолевых клеток, так и посредством иммуносупрессивной активности (Wahl S.M. et al., 1988). Кроме того, важным событием, способствующим прогрессии опухоли, является усиление неоангиогенеза и пролиферации фибробластов, что в значительной степени зависит от ТФР-бета (Roberts А.В. et al., 1986). Поэтому считается, что ТФР-бета является основным причинным фактором в фиброзировании тканей при локальном облучении, часто используемом для лечения новообразований. Поскольку имеющиеся в литературе сведения, касаются преимущественно поздних эффектов
5 ионизирующей радиации на экспрессию ТФР-бета, данные о его экспрессии на ранних сроках после облучения представляются важными с точки зрения той роли, которую играет данный фактор в инициации процессов фиброзирования.
Изучение динамики ответа МФ на облучение представляет особый
интерес, поскольку различные виды облучения применяются при лечении
многих патогенетических процессов, что нередко приводит к
неограниченному разрастанию соединительной ткани. Данные литературы, касающиеся изменения функциональной активности МФ под действием радиации, немногочисленны и противоречивы. Согласно данным одних авторов, изучавших влияние ионизирующей радиации на МФ в условиях in vitro, общее облучение мышей усиливает фагоцитарную и цитотоксическую активности МФ (Е.И. Хлоповская и соавт., 1993); по данным других авторов -ионизирующая радиация подавляет цитотоксическую активность МФ (Keller R., 1979; Kubota Y. et al., 1994). Уточнение ответа на этот вопрос представляется необходимым для выяснения того влияния, которое оказывают опухолеассоциированные МФ при проведении курса лучевой терапии на рост опухоли. С этой точки зрения вызывает интерес сравнение влияния ионизирующей радиации и действия классических иммуномодуляторов на функциональный статус МФ, в том числе на экспрессию ТФР-бета и ФНО-альфа.
Продукция и синтез ТФР-бета и ФНО-альфа тесно взаимосвязаны и регулируются посредством положительной и отрицательной обратной связи, в том числе по аутокринному принципу. Поэтому любая попытка индуцировать противоопухолевую активность МФ путем усиления экспрессии и синтеза ФНО-альфа будет сопровождаться секрецией "проопухолевого" цитокина ТФР-бета. Ситуация осложняется тем, что активация МФ наступает вследствие практически любого экзогенного воздействия (цитостатиками, иммуномодуляторами, облучением), а также под воздействием эндогенных факторов - продуктов распада опухолевых клеток, вторичного инфицирования некротических участков и т.д.
Имеющиеся в литературе данные по экспрессии и синтезу ТФР-бета и ФНО-альфа активированными МФ относятся, главным образом, к реакциям, ограниченным 2-3 днями (Assoian R.K. et al., 1987). С онкологической точки зрения значительно большую важность имеют отдаленные последствия активации МФ, а точнее - динамика продукции этих полифункциональных цитокинов в процессе ответа МФ на активацию, что более адекватно отражает патогенез опухолевого процесса. Изучение этой проблемы представляется актуальным для последующего исследования возможностей направленной модуляции активированных МФ с целью рационального вмешательства во многие патологические процессы, в том числе в опухолевый рост.
Целью работы является установление закономерности динамики экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа в процессе ответа МФ млекопитающих на активацию модуляторами биологического ответа и воздействие ионизирующей радиацией в связи с проблемой злокачественного роста.
В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:
Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ мышей после воздействия вакциной БЦЖ in vivo.
Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ после воздействия бактериального липополисахарида (ЛПС) in vitro.
Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ после общего однократного гамма-облучения ионизирующей радиацией.
Определить экспрессию ТФР-бета при местном воздействии ионизирующей радиации на кожу животных in vivo.
Научная новизна работы. Принципиально новым является
комплексный анализ ранних и отсроченных по времени последствий
7 активации МФ модификаторами биологического ответа и ионизирующей радиацией на функциональном, биохимическом и молекулярном уровнях.
Установлено, что ионизирующая радиация является активатором функциональной активности МФ и способна усиливать его рост-стимулирующее действие на опухолевые клетки.
Установлена одновременная экспрессия противоположных по основным биологическим эффектам на ткани цитокинов ТФР-бета и ФНО-альфа после воздействия на МФ различных активаторов.
Научно-практическое значение. Сведения о последствиях активации МФ на ранних и последующих этапах после воздействия представляют практический интерес, т.к. именно они имеют наиболее существенное значение для роста опухоли. Это особенно актуально в связи с продемонстрированной в работе активацией рост-стимулирующей активности МФ под воздействием ионизирующей радиации, как одного из основных компонентов комплексного лечения больных со злокачественными опухолями. Выявленная повышенная экспрессия ТФР-бета на ранних сроках после действия гамма-радиации доказывает участие МФ в патогенезе пострадиационного фиброза.
Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на научных лабораторных конференциях НИИ онкологии им. проф. Петрова, материалы диссертации были доложены на 4-й Международной конференции «Спид, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1996), на 1-ом съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), 10-ом симпозиуме по молекулярной биологии гемопоэза (Гамбург, 1997) и международной конференции по макрофагам (Париж, 1998).
На защиту выносятся следующие основные положения:
Стимуляция цитотоксических свойств макрофагов классическими активаторами Л ПС, БЦЖ сопровождается не только повышением экспрессии цитотоксического фактора ФНО-альфа, но и экспрессией ТФР-бета -цитокина, обладающего отчетливым рост-стимулирующим эффектом на злокачественные клетки и способным подавлять противоопухолевые цитотоксические эффекты макрофагов.
Ионизирующая радиация является активатором цитотоксической и рост-стимулирующей активности макрофагов. При облучении опухолевых клеток и макрофагов in vitro макрофаги способны защищать злокачественные клетки от действия радиации.
3. Экспрессия ТФР-бета, являющегося основным медиатором
послерадиационного фиброза, выявляется на ранних сроках после
локального и общего облучения.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов, результатов собственных исследований,
обсуждения, выводов и списка литературы ( 206 источников, в том числе 18 отечественных). Работа проиллюстрирована 12 рисунками, содержит 7 таблиц. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Трансформирующий фактор раста бета (ТФР-бета)...
В 1981 году А. В. Roberts и М.В. Sporn идентифицировали пептид, индуцирующий рост и образование колоний нормальных фибробластов крысы в мягком агаре. Как правило, в мягком агаре образуют колонии только вирус-инфицированные или трансформированные клетки. Благодаря способности индуцировать признаки трансформированного фенотипа пептид получил свое название - трансформирующий фактор роста.
Двумя годами позже те же исследователи выделили ТФР-бета из кровяных пластинок и почек (Roberts А.В. et al., 1983; Assoian R.K. et al., 1983). В 1985 году R. Derynck клонировал первый ген ТФР-бета человека, а в 1993г в нескольких лабораториях одновременно были клонированы рецепторы этого фактора (Ebner R. et al., 1993; Tsushida К. et al., 1993). В результате картирования генетического локуса ТФР-бета было установлено, что ген, кодирующий ТФР-бета, расположен у человека на длинном плече хромосомы 19 в районе 19q 13.1-q13.3, а у мыши на хромосоме 7 ( Fujii D. et al., 1986).
ТФР-бета - член большого "суперсемейства" пептидов и регуляторных факторов, в которое входят активины (Vale W. et al., 1986), ингибины (Mason A.J. et al., 1985), морфогенетические протеины кости (Wozney J.M. et al., 1988), ингибирующая субстанция Меллера (Cate R.L. et al., 1986) и другие факторы. Считается, что эти молекулы произошли от общего предкового гена, т. к. имеются общие черты в их структуре и последовательности аминокислот. К этому суперсемейству также относят ген DPP-C Drosophila Melanogaster, определяющий дорзо-вентральную дифференцировку мухи (Padgett R.W. et al., 1987).
Подсемейство включает пять высокогомологичных изоформ: от ТФР-бетаї до ТФР-бета5. ТФР-бета1, ТФР-бета2, ТФР-бетаЗ присутствуют у большинства видов животных и всех млекопитающих (Derynck R. et al., 1988). ТФР-бета4 обнаружен только у птиц (Jakowlew S.B., 1988), а ТФР-бета5 только у амфибий (Kondaiah P. et al., 1990).
Аминокислотная последовательность молекулы ТФР-бета идентична у цыплят, коров, свиней, обезьян и человека и только у мыши отличается на одну аминокислоту (Roberts А.В. et al., 1988). Активные формы ТФР-бета1, ТФР-бета2 и ТФР-бетаЗ - димерные молекулы весом около 25 кДа, имеющие высокую степень гомологии и состоящие из двух идентичных мономерных субъединиц.
Пропептид ТФР-бета1 состоит из 390 аминокислот, а затем в ходе процессинга протеолитически превращается в 112 аминокислотный полипептид и 278 аминокислотный фрагмент, названный латентно-ассоциированным пептидом (Derynck R. et al., 1987). Активный (зрелый) ТФР-бета формируется дисульфидной связью двух С-концов мономеров. Патентно-ассоциированный пептид затем нековалентно присоединяется к ТФР-бета и формирует латентный ТФР-бета. Инактивация ТФР-бета перед секрецией представляется дополнительным способом регуляции его активности. Следует заметить, что МФ секретируют этот фактор непосредственно в активном состоянии, поэтому его действие проявляется мгновенно. Латентный ТФР-бета активируется в лабораторных условиях закислением среды, нагреванием или добавлением протеаз. В условиях in vivo в этот процесс предположительно вовлечен плазмин (Miyazono К. et al., 1988-1993).
Основным источником ТФР-бета в организме являются кровяные пластинки и мегакариоциты, а у беременных - трофобласт (Assoian R.K. et al., 1983; Thompson L.N. et al., 1989). Существенную роль в синтезе этого фактора могут играть также фибробласты и МФ, как основные компоненты, ответственные за формирование межклеточного матрикса. ТФР-бета1 и ТФР-бета2 обнаружены в почках, плаценте, матриксе костей, они секретируются также эндотелиальными клетками, лейкоцитами и многими опухолевыми клетками (Meager А., 1991).
Для ТФР-бета существует около 6 типов рецепторов. Рецепторы I и II типа являются трансмембранными серин-треонин киназами - проводниками сигналов, а остальные обладают связывающей активностью (Massaque J., Like В., 1985).
ТФР-бета имеет множество регуляторных функций, при реализации которых различные изоформы этого фактора дублируют друг друга. В основном, изоформы ТФР-бета проявляют сходную активность in vitro, но их действие не идентично in vivo. В частности, разрушение или выключение гена ТФР-бета1 у мыши летально несмотря на функционирование генов ТФР-бета2 и ТФР-бетаЗ (Kulkarni А.В. et al., 1993).
В настоящее время известно лишь феноменологическое действие ТФР-бета на клетки различного происхождения, что касается механизмов, то они раскрыты еще не полностью. Известно, что ТФР-бета связывает комплекс рецепторов I и II типов, активирует серин-треонин протеинкиназный домен рецептора II. Киназная активность рецептора II стимулирует фосфолипазу С, в результате действия последней из инозитолфосфолипидов образуются инозитол трифосфат и диацилглицерол. Инозитол трифосфат стимулирует выход кальция из эндоплазматического ретикулума. Внутриклеточный кальций совместно с диацилглицеролом активируют протеинкиназу С. При этом G протеин также индуцирует активность протеинкиназы A ( Rodland K.D. et al., 1990).
В тех типах клеток, в которых ТФР-бета стимулирует пролиферацию, белок гена ретинобластомы фосфорилируется и подвергается конформационным изменениям транскрипционный фактор E2F, а возможно, и прочие факторы транскрипции. E2F перемещается в ядро, где увеличивает транскрипцию гена с-тус, что приводит к пролиферации клетки. Другие факторы транскрипции стимулируют экспрессию генов "раннего ответа": jun В, c-jun и c-fos (Edwards D.R.et al., 1991).
В тех типах клеток, в которых ТФР-бета ингибирует пролиферацию, подавляется транскрипция гена cdk4, который необходим для активации циклинзависимой протеинкиназы 2. Это приводит к тому, что не образуется СОК2-циклин Е комплекс, необходимый для фосфорилирования белка ретинобластомы, что предотвращает активацию генов раннего ответа и блокирует деление клетки (Koff A. et al., 1993). Делеционный анализ промотора с-тус показал, что c-cis регуляторный элемент (между 100 и 71 позицией) ответственен за супрессорный эффект ТФР-бета (Pietenpol J.A. et al., 1990).
Известно, что экспрессия гена ТФР-бета регулируется по аутокринному принципу. В настоящее время установлены два промоторных региона, ответственных за ауторегуляцию этого цитокина. Данная последовательность расположена на 5 конце выше места начала транскрипции (Kim S.J. et al., 1989). Оба промоторных региона позитивно регулируются АР-1 комплексом, а ТФР-бета, в свою очередь, стимулирует в различных клеточных линиях экспрессию генов jun В и c-jun и c-fos, продукты которых формируют АР-1 комплекс (Edwards D.R. et al., 1991).
Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа)...
Способность иммунной системы осуществлять иммунный надзор за опухолевыми клетками ставится под сомнение тем обстоятельством, что глубокие врожденные иммунодефициты не сопровождаются заметным увеличением частоты возникновения опухолей. В то же время, в некоторых случаях иммунные механизмы могут препятствовать прогрессии опухолей. Одним из наиболее ярких примеров является геморрагический некроз опухоли, наблюдаемый у человека или животных в процессе бактериальной инфекции, в особенности грам-отрицательными микроорганизмами (Coley W.B., 1893).
W.B. Coley, изучавший геморрагический некроз и последующую дегенерацию некоторых опухолей, наблюдаемых у пациентов со стрептококковой инфекцией, попробовал воспроизвести этот феномен. Он вводил животным живые или мертвые бактериальные клетки или фильтраты, полученные из их культур. При таком способе терапии был получен некоторый успех, но токсичность, присущая бактериальным продуктам, не позволила широко применить эту технику на практике.
Другие исследователи пытались изолировать бактериальный продукт, ответственный за индукцию некроза опухоли, и в 1936 году M.J. Shear и коллеги выделили из грам-отрицательных микроорганизмов фактор, который назвали "бактериальный полисахарид". Эта субстанция, ныне известная как липополисахарид (ЛПС), была очень эффективна в индукции некроза опухолей, однако она была не менее токсична, чем культуры клеток, из которых она выделена. Более поздняя работа W. O Malley (1962) свидетельствует о том, что геморрагический некроз скорее может быть приписан продукции эндогенных медиаторов, реализуемых в ответ на ЛПС, чем самому ЛПС.
Сыворотка крови, выделенная из мышей, инъецированных эндотоксином, индуцирует геморрагический некроз опухолей, имплантированных под кожу мышей без предварительного введения эндотоксина. Было установлено, что ответственный за это фактор не эндотоксин, а чувствительный к нагреванию материал, предположительно белок. Медиатор, индуцированный ЛПС и названный "фактор некроза опухолей", стал объектом для исследования в биологии и медицине.
Впоследствии ФНО-альфа человека был очищен и частично секвенирован (Aggarwal В.В., 1985). ФНО-альфа представляет собой белок массой 17 «Да. У человека молекула ФНО-альфа негликозилированна, однако у некоторых других видов животных, в частности у мыши, гликозилирование хотя и встречается, но углеводы не определяют его биологическую активность. Три мономера, нековалентно соединяясь, составляют активный белок (Smith R.A. and Baglioni С, 1987). В средах с денатурирующими агентами, такими как мочевина, додецилсульфат натрия или гуанидин-гидрохлорид, ФНО может быть ренатурирован с востановлением 50% изначальной биологической активности.
ФНО-альфа изначально синтезируется как прогормон, содержащий амино-терминальный пептид, длина которого варьирует в зависимости от вида. Пропептидный сегмент молекулы высоко консервативен. У мышей из 79 аминокислот, предшествующих зрелому цитокину, 86% идентичны 76 аминокислотам, предшествующим зрелому цитокину человека. В зрелом ФНО-альфа содержится 156 аминокислот у мыши и 157 у человека, причем аминокислотная последовательность консервативна на 79% (Caput D. et al., 1986).
Функция пропептида остается неизвестной, однако последние данные свидетельствуют, что он необходим для секреции ФНО, которая может осуществляться через расщепление ФНО на клеточной поверхности (Kriegler М. et al., 1988). Было показано, что существует мембрано-ассоциированная формы ФНО-альфа, однако ее функциональное значение до сих пор не установлено (Decker Т. et al., 1987).
Гены ФНО-альфа и ФНО-бета (лимфотоксина) находятся на расстоянии 1100 полинуклеотидов друг от друга. Оба гена представляют собой участки нуклеотидной последовательности главного комплекса гистосовместимости ( 6 хромосома у человека и 17 хромосома у мыши) и располагаются вблизи D-локуса на расстоянии 70 тысяч пар оснований (Nedwin G.E. et al., 1985; Nedospasov S.A. et al., 1986).
Первоначально считалось, что ФНО-альфа продуцируется только мононуклеарными фагоцитирующими клетками, в то время как лимфотоксин (ФНО-бета) выделяется только Т-лимфоцитами. При более детальном исследовании оказалось, что лимфоциты также способны продуцировать ФНО-альфа при активации форболовыми эфирами в сочетании с ионофорами кальция (Cuturi М.С., 1987). Продукция лимфотоксина МФ так и не была установлена, но наблюдалась продукция ФНО-альфа натуральными киллерами и даже, в незначительных количествах, некоторыми трансформированными клеточными линиями и опухолевыми клетками человека (Cordingley FT. et al., 1988; Degliantoni G. et al., 1985).
Контроль биосинтеза ФНО-альфа осуществляется на этапах транскрипции и трансляции (Beutler В. et al., 1986). В посттранскрипционном контроле играет роль З -нетранслируемый сегмент молекулы РНК, содержащий UA-обогащенные элементы (UUAUUUAU). Этот участок определяет стабильность молекулы, а также препятствует трансляции (Caput D., 1986).
ФНО-альфа взаимодействует с мембранным рецептором, который широко представлен на клетках. Это белок с массой 300 кДа, возможно состоящий из нескольких субъединиц. Непосредственно связывающая субъединица рецептора имеет массу 65 кДа (Creasey А.А. et al., 1987). Установлено, что число рецепторов и их аффинность не коррелирует с цитотоксическим эффектом ФНО-альфа (Beutler В. et al., 1985).
Механизм цитотоксического действия ФНО-альфа был описан только в последние годы, и работы в этом направлении активно продолжаются. На сегодняшний день общепринята нижеследующая точка зрения на эту проблему. После связывания ФНО-альфа с клеточным рецептором мембранный комплекс проходит внутрь клетки, что, по-видимому, необходимо для передачи сигнала (Mosselmans R. et al., 1988). Сигнал, индуцируемый ФНО-альфа, приводит к образованию митохондриями реактивных производных атома кислорода, которые повреждают клетку (Fierss W., 1993). В результате дополнительной активации транскрипции фактором NF-kB синтезируются некоторые протеины, предохраняющие клетку от повреждения, вызванного ФНО-альфа (Schulze-Osthoff К. et al., 1993).
Один из этих защитных протеинов - митохондриальная супероксиддисмутаза (СОД). Этот фермент локализован главным образом в матриксе митохондрий. Он индуцируется ФНО-альфа или ИЛ-1 в клетках различных типов. В опухолевых клетках уровень митохондриальной СОД в основном снижен, чем и объясняют отчасти чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому эффекту этих цитокинов (Wong G. et al., 1992). Окисленный глютатион и другие серосодержащие метаболиты обеспечивают клетке буферные свойства и предохраняют от кислородного повреждения. Если же кислородный радикал быстро не удаляется, то в присутствии перекиси водорода образуется высоко-реактивный гид роксил-рад икал, способный взаимодействовать с протеинами, липидами и ДНК.
Режим воздействия ионизирующей радиации
Для изучения экспрессии исследуемых цитокинов - ТФР-бета и ФНО-альфа были использованы молекулярно-биологические и биохимические методы, в частности in situ гибридизация и иммуноферментный анализ. Оценка экспрессии ТФР-бета в коже была проведена при помощи «Northern» и «Western» блот анализа. Для определения функциональной активности МФ мы пользовались стандартным радиометрическим методом, основанным на определении количества включения 3Н-тимидина клетками-мишенями.
Объектами исследования служили перитонеальные МФ мышей и моноциты периферической крови человека, выделенные из крови здоровых доноров. В работе использовались самцы мышей линии BALB/C в возрасте 1-1,5 месяца и массой 18-20 г (питомник «Рапполово», РАН). Лейковзвесь донорской крови была получена на отделении переливания крови в НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ. Изучение экспрессии ТФР-бета после локального облучения проводилось в коже свиней (mini pig).
Для локального облучения кожи свиней использовался источник 1921г (мощность дозы 14 Гр/мин). Клеммы источника диаметром 2 см были закреплены на поверхности кожи на боку анастезированных животных, локальная доза облучения кожи для каждого животного составила 64 Гр.
Животные были подвергнуты общему однократному облучению в дозе 4 Гр на рентгеновской установке ИГУР-1 (137Cs, мощность дозы 1,34 Гр/мин). Облучение МФ в модели in vitro для изучения их функциональной активности производили на установке ИГУР-1 в дозе 8 Гр.
Для изучения влияния облучения на пролиферативную активность перитонеальных МФ клетки облучали после 18 часов культивирования в дозах 0; 0,1; 0,2; 1,2; 4; 8; 12 Гр на той же установке.
Радиометрический метод позволяет с высокой точностью определить изменение пролиферативного потенциала клеток-мишеней под воздействием различных факторов МФ. Метод применялся для оценки рост-ингибирующей и рост-стимулирующей активности МФ после активации in vivo, in vitro или облучения ионизирующей радиацией. Кроме того, метод использовался для оценки интенсивности пролиферации самих МФ после облучения.
В качестве клеток-мишеней служила клеточная линия KB (карцинома ротовой полости человека), а также линии трансформированных фибробластов мыши ЮТ 1/2 и L929.
Живую вакцину БЦЖ (Bacillus Calmett-Guerin) мышам вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида.
МФ извлекали из перитонеальной полости мышей в стерильных условиях и переносили в центрифужную пробирку, охлажденную до 0 С на тающем льду. Затем МФ промывали культуральной средой RPMM640 (Serva, USA) и высевали в 96-луночные культуральные платы в количестве 1 105 /мл в среду RPMI-1640 (Serva, USA), содержащую 2% эмбриональной сыворотки, глутамин и антибиотики. После 18 часов культивирования в стерильных условиях культуральную среду собирали и сохраняли при температуре минус 70 С. Контролем служили перитонеальные МФ мышей, которым вакцина не вводилась.
При проведении экспериментов in vitro перитонеальные МФ высаживали в 96-луночные планшеты и активировали ЛПС (Sigma; USA) в конечной концентрации 1 мкг/мл. В течение 10 дней супернатанты отбирали каждые сутки и исследовали на функциональную активность.
Перитонеальные МФ собирали с 1 по 10 дни после облучения мышей или в нечетные дни с 1 по 29, а затем на 35 и 40 дни после введения мышам вакцины БЦЖ. МФ культивировали в 96-луночных планшетах в 200 мл среды RPMI-1640 (Serva, Germany) с 2% телячьей эмбриональной сыворотки, глутамином и антибиотиками при 37 С, в атмосфере с 5% содержанием С02. Через 18 часов супернатанты собирали и определяли их влияние на пролиферацию клеток-мишеней. В серии экспериментов с МФ мышей, не подвергавшихся никаким специальным воздействиям, клетки были выделены и культивировались в описанных выше условиях, а через 18 часов облучены в дозе 8 Гр. Через 6 часов после облучения (в 0 день) и с 1 по 10 дни супернатанты были собраны и исследованы in vitro на рост-стимулирующую и цитотоксическую активности.
Цитотоксическую и рост-стимулирующую активности супернатантов МФ оценивали радиометрическим методом (Lewis J.G., Adams DO., 1987). Все эксперименты проводили в 5 или 6 параллельных пробах. Клетки-мишени высевали в 96-луночный планшет в концентрации 1 #103 в 50 мкл культуральной среды. Через 18 часов инкубации в стандартных условиях в платы вносили супернатанты активированных или облученных МФ в количестве 150 мкл и 3Н-тимидин в концентрации 1 мкКи на 100 мкл культуральной среды. Затем планшеты помещали на 18 часов в те же условия, после чего среду удаляли и каждую лунку дважды промывали раствором Хенкса. После промывки в плату вносили раствор 0,2% SDS на дистиллированной воде в количестве 50 мкл. После растворения клеток и высвобождения изотопов раствор из каждой лунки переносили во флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость ( 1л диоксана; 4г 2,5-дифенил оксазола; 100мг 1,4 Ди/5фенил 2-оксазоли/бензола). Индекс метки оценивался на счетчике радиоактивности Delta 300 (Austria).
Для изучения влияния ионизирующего излучения на пролиферативную активность самих перитонеальных МФ, клетки облучали в соответствующих дозах после 18 часов культивирования, и сразу после гамма-воздействия в платы вносили 3Н - тимидин в концентрации 1 мкКи на ЮОмкл культуральной среды. Дальнейшие процедуры не отличались от вышеописанных.
Высаженные в полную культуральную среду RPMI-1640 перитонеальные МФ мышей в концентрации 2#104/мл культивировали в 96-луночном планшете в течение 72 часов. После этого культуральную среду полностью заменяли на новую и вносили клетки-мишени в концентрации 1#103/мл. Одновременно в лунки вносили ЛПС в концентрации 1 мкг/мл или облучали в дозе 8 Гр на установке ИГУР-1. Пролиферацию клеток-мишеней определяли через 24 часа кокультивирования по включению 3Н-Тимидина. 3Н-Тимидин вносили в концентрации 1 мкКи на лунку.
В эксперименте по изучению влияния радиации на активность перитонеальных МФ часть клеток облучали предварительно в дозе 8 Гр до внесения клеток-мишеней. Контролем в этих экспериментах служили клетки-мишени, культивировавшиеся совместно с МФ и не подвергавшиеся радиационному воздействию, а также клетки-мишени, которые культивировались изолированно от МФ.
Экспрессия ТФР-бета и ФНО-альфа активированными макрофагами мыши
Для изучения изменений активности перитонеальных МФ мышей под влиянием вакцины БЦЖ были проведены эксперименты в системе in vitro на различных сроках после введения вакцины. Было установлено, что МФ, активированные БЦЖ, продуцируют высокий уровень как рост-ингибирующих, так и рост-стимулирующих субстанций. При воздействии супернатантов культивируемых МФ на клеточную линию KB отмечалось проявление ингибирующих эффектов на 0, 1, 3 и 5 сутки, а действие рост-стимулирующих продуктов МФ начиналось спустя 3 недели с момента активации МФ и было наиболее выражено на 23, 25, 35 и 40 сутки (рис.2а).
На линии фибробластов мыши 10Т1 /2 рост-ингибирующие эффекты супернатантов проявлялись на 3, 5, 7, 15 и 17 дни после активации МФ, а рост-стимулирующая активность была наиболее выражена, начиная с 19 дня после введения БЦЖ (рис.2б). На основании полученных данных можно заключить, что в процессе активации МФ проходят ряд фаз, сопровождающихся сменой их функциональной активности во времени. Полученная нами динамика ответа МФ на активацию вакциной БЦЖ согласуется с работами С.А. Громова и соавт. (1989), доказывающими, что за цитотоксической фазой ответа МФ на активацию следует более продолжительная фаза, в течение которой МФ секретируют преимущественно рост-стимулирующие субстанции. Такой характер ответа МФ на активацию обеспечивает разделение разнонаправленных эффектов во времени, что соответствует изначально двойственной роли МФ в процессах заживления ран. Вместе с тем, разделение фаз раневого процесса - результат системной работы множества звеньев клеточных элементов и гуморальных факторов. На основании этого можно предполагать, что время проявления той или иной активности МФ не детерминировано генетически, а определяется балансом активационных и регуляторных факторов.
На рис. 2а и 26 представлена динамика синтеза ТФР-бета МФ, активированными БЦЖ в сопоставлении с их рост-ингибирующим и рост-стимулирующим потенциалом. Через 6 часов после активации МФ секреция ТФР-бета незначительно увеличивалась и на следующий день достигала максимума, превосходя контрольный уровень в 3 раза. Следует отметить, что увеличение секреции ТФР-бета носило периодический характер, так как и в дальнейшем, на 15 и 25 дни наблюдалось еще два максимума секреции этого фактора. На протяжении всех 40 дней наблюдения уровень ТФР-бета оставался повышенным по сравнению с исходным значением.
При воздействии супернатантов активированных МФ на клеточную линию KB корреляция между их эффектами и синтезом ТФР-бета фактически отсутствовала, что может указывать на относительную резистентность данной культуры клеток к антипролиферативным эффектам ТФР-бета. Возможно, что устойчивость данной культуры клеток связана с экспрессией гена множественной лекарственной устойчивости (MDR), амплификация которого имеет место в клетках этой линии (Shen D.W. et al., 1988). Известно, что продукт гена MDR, Р-гликопротеин предохраняет клетку от ряда токсических субстанций и действия некоторых цитокинов иммунной системы (Johnstone et al., 1998).
На клеточной культуре 10Т1/2 прямая корреляция между макрофагальными эффектами и секрецией ТФР-бета также отсутствовала, но рост-стимулирующие свойства МФ проявлялись более интенсивно, чем на клеточной линии КВ. Возможно, что продолжительная секреция ТФР-бета изменяет активность МФ таким образом, что на поздних сроках после введения БЦЖ их рост-стимулирующие потенции становятся более выражены. Не подлежит сомнению тот факт, что в супернатантах МФ находится множество других регуляторных факторов, суммарная активность которых и определяет наблюдаемую реакцию клеток-мишеней.
Как уже отмечено выше, ТФР-бета относится к универсальным факторам роста и прежде всего его действие направлено на организацию процессов репарации нормальных тканей. Было показано, что кондиционированная среда МФ, находящихся в рост-стимулирующей фазе, ускоряет заживление экспериментальных полнослоиных ран кожи и репарацию дезинтоксикационнои функции печени у мышей с экспериментальным гепатитом (Mikhaleva I.I. et al., 1994). В то же время, в наших экспериментах показано, что увеличение продукции ТФР-бета следует непосредственно за активирующим стимулом и, таким образом, не совпадает по времени с началом репаративных процессов, которые имеют место лишь на заключительном этапе раневой реакции. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что ответ МФ на активацию имеет колебательный характер. Не исключено, что такая флюктуация активности МФ играет роль регулятора межклеточных взаимодействий в процессе заживления ран.
Методом in situ гибридизации было выявлено, что в МФ, активированных БЦЖ, возрастание мРНК ТФР-бета имело место на 5 день после активации (табл. 1). Определенный уровень экспрессии ТФР-бета отмечается также и в контроле, что свидетельствует о его конститутивной экспрессии. По данным Assoian и соавт. (1987), мРНК ТФР-бета экспрессируется в одинаковой степени в интактных и активированных МФ через 24 часа после воздействия ЛПС, однако, более поздние сроки, после активации МФ, в обсуждаемой работе не рассматриваются. Кроме того, этими же исследователями было установлено, что активация ЛПС индуцирует секрецию ТФР-бета уже через 24 часа. В нашем исследовании не наблюдалось увеличения экспрессии мРНК ТФР-бета в первые дни после активации. Полученная динамика экспрессии мРНК ТФР-бета в сравнении с концентрациями ТФР-бета в супернатантах активированных МФ позволяет предположить, что повышение синтеза этого фактора, наблюдаемое в 1 день после введения БЦЖ, осуществляется с использованием белка, депонированного в клетке. Экспрессия гена ФНО-альфа увеличивается в 1 и 3 дни после активации МФ вакциной БЦЖ и практически отсутствует в контроле (табл. 1). В дальнейшем незначительное увеличение присутствия мРНК этого фактора в клетке наблюдалось на 9 день после введения вакцины. Полученный результат согласуется с данными других авторов о индуцибельном характере экспрессии ФНО-альфа (Nacy et al., 1991; Koerner etal., 1987).
Исследование реакций МФ на воздействие бактериального ЛПС проводилось в системе in vitro как в изолированной культуре, так и при кокультивировании МФ с клетками-мишенями.
МФ, активированные ЛПС in vitro, обладали большей рост-ингибирующей активностью по сравнению с интактными МФ, но при этом сохранялся общий профиль динамики функциональной активности интактных МФ (контроль), эксплантированных in vitro (рис. 3). На клетках-мишенях KB рост-ингибирующее действие МФ наблюдалось на 2, 3,4,5 и 6 день после активации ЛПС (рис.За), а на линии фибробластов 10 Т1/2 было отмечено еще и на 8 и 9 дни (рис.36).
Представляется, что последовательность и глубина наблюдаемых фаз активности МФ в значительной степени определяются исходным фоном, на который пришлось воздействие иммуномодулирующим агентом.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в неактивированном состоянии МФ обладают сложным профилем функциональной активности, изменение которой имеет в основе колебательную природу.
Защитная реакция состоит из нескольких последовательных этапов. Обладая широким спектром поверхностных рецепторов, МФ отличают клетки своего вида от чужеродных и опухолевых, т.е. осуществляют первый этап защитной реакции. Не меньшее значение представляют регуляторные функции МФ. В зависимости от активации или торможения внутриклеточных процессов МФ обеспечивают выбор типа защитной реакции, ее направленность и интенсивность. Регуляторный этап имеет определяющее значение, так как все защитные реакции представляют опасность не только для чужеродных объектов, но и для всего организма в целом. Поэтому каждая функция МФ контролируется несколькими факторами одновременно.
