Содержание к диссертации
Введение
Часть 1 - Макрофаги 11
Происхождение макрофагов 11
Метаболизм макрофагов 14
Рецепторы макрофагов , 15
Функции макрофагов 19
Концепция дихотомии макрофагальной активации ...24
Часть 2 - Канцерогенез и воспаление 27
Регуляция воспаления 27
Связь онкологических заболеваний с хроническим воспалением 30
Часть 3 - Опухоль ассоциированные макрофаги 31
Опухоль ассоциированные макрофаги - маркер плохого прогноза 33
Цитокины определяют функцию опухоль ассоциированных макрофагов 35
Свойства опухоль ассоциированных макрофагов 38
Материалы и методы 43
Выделение макрофагов из лейкоцитарной пленки 43
Цитокины, факторы роста и другие медиаторы 44
Субтрактивная гибридизация 45
Анализ полученных клонов 47
Норзерн блот гибридизация 47
Пробы для гибридизации 48
Синтез кДНКдля ПЦР и количественной ПЦР 48
Анализ альтернативного сплайсинга фибронектина 49
Количественная полимеразная цепная реакция 49
Анализ дифференциальной экспрессии генов при помощи биочипов фирмы Affymetrix 51
Детекция белка фибронектина 52
Анализ экспрессии белков FXIIIa и TGFpRII 53
Анализ фосфорилирования белка Smad2 53
Анализ фагоцитозной активности макрофагов 54
Анализ секреции цитокинов 54
Анализ бактерицидной активности макрофагов 55
Антитела для иммунофлуоресценции 55
Получение стабильно трансфецированных клеточных линий 56
Анализ эндоцитоза 56
Проточная цитометрия 57
Обработка вортманнином 58
Иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия 58
Результаты 61
Маркеры макрофагов второго типа активации , 61
Клонирование человеческого и мышиного стабилина-1 61
Анализ экспрессии стабилина в различных тканях 64
Анализ структуры белка стабилина-1 66
Стабилин-1 отвечает за эндоцитоз acLDL в стабильно трансфецированных клетках СНО 69
Вортманнин вызывает накопление acLDL в ранних эндосомах 75
Вортманнин влияет на локализацию стабилина-1 в человеческих макрофагах 78
Молекулярная гетерогенность популяции макрофагов второго типа 79
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов 80
Анализ экспрессии фибронектина и piG-НЗ в макрофагах 82
Анализ сплайсинга фибронектина 83
Анализ экспрессии белка фибронектина 84
Синтез компонентов внеклеточного матрикса и ферментов для его ремоделлинга стимулируется IL-4 и подавляется дексаметазоном 86
IL-4 запускает, а глгококортикоиды модулируют продукцию цитокинов макрофагами второго типа 90
Глгококортикоиды стимулируют фагоцитоз и экспрессию скавенджер-рецепторов 91
Исследование пластичности макрофагального фенотипа 94
Анализ экспрессии рецепторов к цитокинам на Thl/Th2 поляризованных макрофагах 94
Продукция противовоспалительных цитокинов активируется при вторичной стимуляции ТЬ2-ассоциированными цитокинами и глюкокортикоидами 98
Зрелые макрофаги производят провоспалительные цитокины в ответ на бактериальные продукты, но не ТЫ цитокин IFN-gamma 100
Ответ макрофагов регулируется на уровне мРНК 105
Кинетика продукции цитокинов 106
Анализ фагоцитозной активности макрофагов после вторичной стимуляции 109
Анализ бактерицидной активности макрофагов после вторичной стимуляции 110
Анализ IL17BR - маркера макрофагов второго типа 112
Анализ сплайс-вариантов IL-17BR , 115
Анализ экспрессии белка IL-17BR 117
Активация макрофагов трансформирующим фактором роста бета 120
TGF-pl активирует экспрессию IL-17BR не только в моноцитах, но и в зрелых макроафгах второго типа 122
Анализ дифференциальной экспрессии генов в зрелых макрофагов, стимулированных TGF-pi 123
Подтверждение данных, полученных при помощи биочипов 128
Анализ экспрессии генов «раннего ответа» в M2iu4 стимулированных TGF-pi 129
Дексаметазон регулирует поверхностную экспрессию TGFpRII 130
Дексаметазон приводит к поверхностной экспрессии рецептора KTGF-p 133
Кинетика и дозозависимость действия дексаметазона на поверхностную экспрессию TGFPRII 136
Функциональная активнось TGFpRII 139
Влияние дексаметазона на негативную обратную связь Smad-зависимого сигнального пути 142
Обсуждение результатов 146
Разнообразие макрофагальных фенотипов 147
Модель опухоль ассоциированных макрофагов 149
Сложность системы мононуклеарных фагоцитов 153
Комплексная система внутриклеточной передачи сигнала 155
Процессы везикулярного транспорта в макрофагах 161
Математическое моделирование 170
Математические модели путей передачи сигнала 171
Построение моделей везикулярных процессов 174
Калибровка модели 175
Заключение 175
Выводы 178
Список литературы
- Рецепторы макрофагов
- Связь онкологических заболеваний с хроническим воспалением
- Выделение макрофагов из лейкоцитарной пленки
- Анализ экспрессии белков FXIIIa и TGFpRII
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время, масштабные исследования, проводимые по всему миру, позволяют утверждать, что все органы и ткани организма находятся под постоянным контролем иммунной системы, активность которой регулируется ее врожденным компонентом. Основными клетками врожденного иммунитета являются макрофаги, развивающиеся из моноцитов периферической крови и имеющиеся во всех органах и тканях. В здоровом организме макрофаги отвечают за поддержание гомеостаза ткани, а так же за своевременный ответ на вторжение патогена, повреждение или появление трансформированных клеток. Нарушение функций макрофагов приводит к развитию хронических воспалений, аутоиммунных заболеваний, а также к инициации и прогрессии опухолей. Последнее десятилетие было отмечено учащающимися попытками разработать клеточную иммунотерапию для лечения злокачественных опухолей. Наиболее часто предпринимались попытки инициировать противоопухолевый иммунный ответ при помощи антигенпрезентирующих клеток. Однако до сих пор ни одна из этих попыток не увенчалась успехом и не привела к разработке надежно работающей терапии. Так почему же используемые антигенпрезентирующие клетки не способны активировать требуемый иммунный ответ? Опухоль развивается при постоянном взаимодействии с иммунной системой организма и способна не только пассивно избегать узнавания, но и активно влиять на иммунную систему. Растворимые факторы, производимые опухолевыми клетками, способны привлекать моноциты, которые в результате контакта с опухолевыми клетками и под воздействием опухолевого микроокружения развиваются в особый тип опухоль ассоциированных макрофагов, которые способны локально подавлять противоопухолевый иммунный ответ. Таким образом, для успешного использования потенциала иммунной системы при лечении опухолей необходимо учитывать активность и индивидуальные особенности опухоль ассоциированных макрофагов. Проводимые исследования опухоль ассоциированных макрофагов выявили их схожесть с макрофагами второго типа активации, обладающими противовоспалительными и иммуносупрессорными свойствами. Однако, недостаточная изученность свойств макрофагов второго типа активации пока не позволяет использовать их в качестве мишени для разработки противоопухолевой иммунотерапии.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы было исследование гетерогенности и пластичности фенотипа первичных человеческих макрофагов в культуре in vitro. В ходе работы были решены следующие задачи:
-
Описана функция маркера макрофагов второго типа активации - многофункционального скавенджер рецептора стабилина-1.
-
Уточнена концепция молекулярной и функциональной гетерогенности популяции макрофагов второго типа на примере макрофагов, стимулированных IL-4 и дексаметазоном.
-
Проверена гипотеза о способности макрофагов изменять свое функциональное состояние в зависимости от изменения условий внешней среды. Показана способность различных популяций макрофагов отвечать на бактериальные стимулы (LPS и MDP), Th1 цитокин IFNg, Th2 цитокин IL-4 и дексаметазон.
-
Выявлены маркеры макрофагов второго типа стимулированных трансформирующим фактором роста бета (TGF-b).
-
Исследована способность зрелых макрофагов отвечать на трансформирующий фактор роста бета. Показано, что глюкокортикоиды необходимы для поверхностной локализации рецептора к TGF-b и проведен глобальный анализ экспрессии генов, активированных в зрелых макрофагах TGF-b.
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
В настоящей работе представлены новые маркеры макрофагов второго типа, экспрессирующиеся при стимуляции макрофагов интерлейкином (IL)-4, дексаметазоном, трансформирующим фактором роста бета и их комбинациями. Полученные данные позволяют утверждать, что популяция макрофагов второго типа гетерогенна. Клонирован и описан новый маркер макрофагов второго типа – стабилин-1. Функциональные исследования стабилина-1 показали, что этот белок является многофункциональным скавенджер рецептором, обладающим широким спектром лигандов. Проверена гипотеза о пластичности макрофагального фенотипа. В рамках этой части работы впервые показано, что макрофаги сохраняют способность отвечать на бактериальные стимулы, независимо от типа дифференцировки, что гарантирует своевременный и эффективный ответ на инфекцию. Исследование влияния TGF-b на молекулярный репертуар макрофагов выявил активацию рецептора IL17RB при комбинированной стимуляции макрофагов IL-4 и TGF-b. Дальнейшее исследование воздействия TGF-b на макрофаги позволило обнаружить физиологические условия, необходимые для сохранения макрофагами способности отвечать на данный ростовой фактор. В опровержение бытующего мнения о неспособности макрофагов отвечать на TGF-b, представленные в работе данные указывают на то, что наличие глюкокортикоидов в культуральной среде является необходимым и достаточным условием для сохранения поверхностной экспрессии рецептора и способности макрофагов отвечать на стимуляцию TGF-b. Эти результаты впервые позволили исследовать фенотип макрофагов, формирующийся под воздействием TGF-b. Описанные маркеры существенно расширяют возможности по выявлению макрофагов в различных онкологических и хронических воспалительных заболеваниях. Обнаруженная пластичность макрофагального фенотипа открывает новые возможности для манипуляции фенотипом макрофагов при лечении различных заболеваний. Обнаруженный эффект глюкокортикоидов указывает на необходимость учитывать данное свойство этого иммуносупрессора при использовании его для терапии, а так же открывает перспективы для дальнейшего изучения механизма действия глюкокортикоидов на внутриклеточный транспорт.
Апробация результатов работы
Основные результаты диссертации были представлены на меджународных научных конференциях и симпозиумах. В том числе на ежегодных конференциях Европейского Общества исследования Макрофагов и Дендритных клеток – European Macrophage and Dendritic Cell Society (2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006 и 2007 г.), на конференциях Германского Иммунологического Общества – Deutsche Gesellschaft fr Immunologie (2004, 2005, 2006 и 2007 г.), на конференциях Общества Билогии Лейкоцитов – Society for Leukocyte Biology (2004, 2005, 2006, 2007 г.), на симпозиумах Keystone (2005, 2006, 2007, 2008 г.).
Структура и объем диссертации
Рецепторы макрофагов
Метаболизм мононуклеарных фагоцитов изменяется в процессе дифференцировки от моноцита к макрофагу. Повышается количество митохондрий, увеличивается активность митохондриальных ферментов и уровень клеточного дыхания (Conn, 1968). В процессе созревания макрофага усиливается уровень окисления глюкозы и продукции лактата. Так же увеличивается количество лизосом и повышается продукция лизосомальных ферментов. Даже будучи не активированными, макрофаги проявляют чрезвычайно высокую метаболическую активность. Так, например макрофаг способен полностью обновить свою плазматическую мембрану в течение 30 минут (Steinman et al, 1983). Моноциты получают энергию в результате аэробного гликолиза (OREN et al, 1963), однако зрелые макрофаги способны использовать для получения энергии как гликолиз, так и окислительное фосфорилирование, причем основной источник энергии, используемый макрофагом, зависит от его локализации в организме. АТФ, образованная в результате гликолиза, хранится в виде запасов креатин фосфата, который является источником энергии для процессов связанных с подвижностью клетки (Loike et al, 1979). Таким образом, большинство макрофагов способно сохранять фагоцитарную активность даже в анаэробных условиях, что необходимо для функционирования этих клеток в таких патологических условиях как гранулёма, абсцесс или слабо васкуляризированная опухоль, когда снабжение кислородом серьезно нарушено. Исключение составляют альвеолярные макрофаги, которые теряют способность к фагоцитозу в анаэробных условиях [Cohen and Cline, 1971; Hocking and Golde, 1979].
Метаболизм макрофагов может существенно меняться в результате взаимодействия различных лигандов с рецепторами на поверхности клетки. Одной из наиболее типичных макрофагальных реакций является кислородный взрыв. В результате кислородного взрыва происходит изменение активности связанных с мембраной оксидазных комплексов и восстановление кислорода до супероксида [Babior, 1984а; Babior, 1984b]. Образованный таким образом супероксид быстро переходит в гидроген пероксид и гидроксил ионы - активные промежуточные соединения кислорода [reactive oxygen intermediates - ROIs], которые отвечают за бактерицидную активность макрофага как внутри фагосом, так и во внеклеточном пространстве [Babior, 1984а; Babior, 1984b]. В процессе дифференцировки макрофаги теряют способность к сильному кислородному взрыву. Тканевые макрофаги способны производить лишь незначительные количества ROI. Но эта их активность может повышаться in vivo в результате воздействия различных стимуляторов, таких как IFN-y или MIF [Nathan et al, 1984; Nishihiraetal, 1998].
Для осуществления своих функций в организме макрофаги обладают широким спектром рецепторов, отвечающих за регуляцию таких процессов как рост, дифференцировка, активация, узнавание лиганда, эндоцитоз, фагоцитоз, миграция, и секреция. Далее будут рассмотрены классы рецепторов, которые наиболее важны для функционирования макрофагов. В числе первых описанных макрофагальных рецепторов стоит отметить Fc рецепторы - рецепторы к Fc фрагменту IgG (Berken and Benacerraf, 1966) и рецепторы к компонентам системы комплемента (Lay and Nussenzweig, 1968). Связывание лиганда с Fc рецептором активирует в макрофагах самые различные процессы от эндоцитоза до перестройки цитоскелета, фагоцитоза и секреции молекул, необходимых для антибактериального ответа. К Fc рецепторам относят рецептор высокой аффинности CD64, а так же рецепторы низкой аффинности CD32 и CD16. Стимуляция макрофагов IL-4 активирует экспрессию еще одного Fc рецептор низкой аффинности - CD23, связывающегося с IgE. Рецепторы к компонентам системы комплемента включают CR1, CR3 и CR4, которые отвечают за узнавание, связывание и интернализацию опсонизированных частиц (Burke and Lewis, 2002].
Макрофаги также экспрессируют большое количество рецепторов к цитокинам и ростовым факторам. Рецепторы к цитокинам подразделяются на семейства в зависимости от гомологии с одним из следующих рецепторов: IL-2R, IL-3R, IL-4R, GM-CSFR, иммуноглобулин-подобный рецептор, TNFR и TGF-BR. Сигнальные системы, активируемые этими рецепторами, зачастую используют киназную активность как первый этап передачи сигнала. Далее происходит активация различных транскрипционных факторов, среди которых стоит отметить NFKB, активируемый в ответ на TNFa и IFNy, транскрипционные регуляторы семейства STAT (signal transducers and activators of transcription), активируемые в результате действия IFNy, IL-4 и IL-10 и белки семейства Smad, активируемые в ответ на стимуляцию клеток ростовыми факторами семейства TGFJ3. Воздействие отдельных цитокинов или их комбинаций на макрофаги способно существенно изменить их функцию. Так IL-2 усиливает противоопухолевую активность макрофагов [Malkovsky and Sondel, 1987], IL-1 приводит к продукции TNF и IL-1, IL-4 и IL-13 приводят к повышению экспрессии маннозного рецептора и повышенной презентации антигена [Stein et al, 1992], IFNy усиливает кислородный взрыв и бактерицидную активность [Gordon et al, 1995].
Связь онкологических заболеваний с хроническим воспалением
Данные клинических и экспериментальных исследований показывают, что макрофаги способны поддерживать прогрессию и метастазирование солидных опухолей. Будучи «обученными» опухолевым микроокружением макрофаги приобретают особые свойства, и способствуют ангиогенезу, разрушению внеклеточного матрикса, и метастазированию. В случае активации первого типа макрофаги производят различные мутагенные субстанции (радикалы кислорода и азота), а в случае активации второго типа - ангиогенные факторы. Таким образом, макрофаги все чаще рассматривают как многообещающую мишень для терапии и профилактики опухолей.
Солидные опухоли, как известно, состоят не только из опухолевых клеток, но так же содержать различные типы клеток не опухолевого происхождения. Эти клетки участвуют в создании микроокружения, которое способно серьезно повлиять на злокачественный потенциал опухоли. Однако, до конца 20 века исследования злокачественных опухолей были сконцентрированы, прежде всего, на свойствах опухолевых клеток. Причиной этому явилось обнаружение мутаций, ведущих к злокачественной трансформации, онкогенов и других молекулярных событий, происходящих в эпителиальных клетках при инициации и прогрессии опухолей. Несмотря на это, эксперименты, проведенные на животных, в особенности с опухолями, инициированными в результате активации онкогенов, показали, что стромальные клетки, окружающие опухоль, но не имеющие злокачественного потенциала, вносят немалый вклад в динамику опухолевой прогрессии (Coussens et al, 2000; Coussens and Werb, 2002; Iyengar et al, 2003; Krtolica et al, 2001; Lin et al, 2001). Таким образом, становится все более очевидным, что микроокружение, формирующееся из факторов, производимых как опухолевыми, так и стромальными клетками необходимо для проявления опухолью злокачественных свойств в полной мере и, поэтому, при разработке противоопухолевой терапии необходимо учитывать и активность клеток стромы.
Среди клеток неопухолевого происхождения, но являющихся неотъемлемой частью опухоли можно отметить адипоциты и фибробласты, а так же и большое количество клеток иммунной системы, прежде всего макрофаги, неитрофилы и тучные клетки. Именно эти клетки играют центральную роль в процессах прогрессии и метастазирования опухоли (Balkwill and Mantovani, 2001; Brigati et al, 2002; Coussens and Werb, 2002; Leek and Harris, 2002; Lin et al, 2002). Дальнейшее обсуждение будет сконцентрировано на основных регуляторных клетках иммунной системы -макрофагах.
Считается, что лейкоциты, являющиеся составной частью опухоли были обнаружены уже в середине 19-го столетия (Balkwill and Mantovani, 2001). Несмотря на это, до недавнего времени этому факту уделялось достаточно мало внимания (Normann, 1985). В настоящее время, однако, не подвергается сомнению тот факт, что большинство солидных опухолей содержат значительное количество опухоль ассоциированных макрофагов и что эти клетки влияют на течение заболевания (Mantovani, 1994). В нормальных тканях вторжение патогена или повреждение запускает сложную реакцию, сопровождающуюся продукцией многочисленных ростовых факторов: M-CSF, GM-CSF, TGFpi, а так же хемокинов, включая CCL2, CCL7, CCL8, CCL3, CCL4 и MIF. Эти факторы стимулируют приток моноцитов и запускают их дифференцировку в макрофаги. Макрофаги, в свою очередь, регулируют иммунный ответ, уничтожают патоген, стимулируют ангиогенез и регенерацию ткани (Lingen, 2001; Nathan, 2002).
Выделение макрофагов из лейкоцитарной пленки
Для выделения и культивирования первичных человеческих моноцитов был разработан уникальный протокол (Gratchev et al, 2001а].
Клетки выделяли из побочных продуктов приготовления консервов крови лейкоцитной пленки. Материал получали со станции переливания крови города Мангейм, Германия. Леикоцитную пленку разводили буфером PBS не содержащим Са2+ и Mg2+ (Biochrom] в соотношении 1:1. Полученную суспензию (35 мл] наслаивали на 15 мл фикола (Biochrom] в пробирке Leucosep (Greiner]. Образцы центрифугировали 30 мин в свинг аут роторе (Backman Coulter] при 650xg. Мононуклеарную фракцию собирали с интерфазы фикол/сыворотка, переносили в свежие пробирки и два раза отмывали буфером PBS. Во время первого центрифугирования готовили непрерывный градиент на основе перкола (Percoll GE Healthcare]. Для приготовления одного градиента смешивали 13.5 мл перкола, 1.5 мл 10 х минимальной основной среды Эрла, 15 мл среды Спиннера. Полученную смесь помещали в 50 мл пробирку и центрифугировали при 12000xg в течение 10 мин при 20С с отключенными тормозами в роторе F34-6-38 (Eppendorf). Отмытые клетки (5-8х108] ресуспендировали в 5 мл PBS и наносили на полученный градиент. Градиенты центрифугировали при 650xg в течение 30 мин при 20С с отключенными тормозами. В результате центрифугирования популяция клеток разделялась на две фракции. Фракция, находившаяся в верхней части градиента содержала клеточную суспензию обогащенную моноцитами до 60-80%. Эту фракцию собирали, и раза отмывали буфером PBS. Полученная клеточная популяция была использована для некоторых экспериментов напрямую. В этом случае макрофаги культивировали в среде McCoy 5а (Biochrom] с добавлением 15% ФБС (Biochrom]. При необходимости получения популяций клеток, содержащих более 90% моноцитов, обогащенная моноцитами фракция, использовалась для магнитной сортировки CD14+ клеток при помощи набора для выделения моноцитов (Miltenyi Biotech]. Полученная таким образом клеточная популяция содержала 92-95% моноцитов, что контролировалось при помощи анализа поверхностной экспрессии маркера моноцитов CD14. Макрофаги культивировали в концентрации 1х10б клеток/мл в бессывороточной среде X-VIV0 10 (Cambrex], содержащей цитокины и/или дексаметазон. Чистота культуры макрофагов определялась при помощи анализа экспрессии маркеров макрофагов CD163, MMR, FcyRI и достигала 98%.
Все цитокины были получены от фирмы TEBU Peprotech. Человеческий интерферон гамма (IFNy], использовался в концентрации 1000 ед./мл, интерлейкины (IL]-4, IL-10, IL-13 и трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF-B1] использовали в концентрации 10 нг/мл. Дексаметазон (Sigma] использовали в концентрации 1х10 7М, липополисахарид (LPS] (Sigma], использовали в концентрации 2.5 мкг/мл, мурамил-дипептид (Sigma] использовали в концентрации 1 мкг/мл. В случае использования концентрации, отличной от стандартной, она указана в подписи к рисунку.
Тотальную РНК выделяли при помощи реагента RNAclean (Hybaid). Три миллиона клеток ресуспендировали в 1 мл реагента. К лизату добавляли 100 мкл хлороформа. Суспензию перемешивали и инкубировали на льду в течение 10 минут. После этого образцы центрифугировали в течение 10 мин при 22000xg и 4С. Водную фазу отбирали, преципитировали РНК изопропанолом, отмывали 2 раза 70% этанолом и растворяли в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом [DEPC]. Концентрация РНК определялась спектрофотометрически. Тотальная РНК была использована для Норзерн блот гибридизации или для выделения мРНК.
Матричную РНК выделяли из 200 мкг тотальной РНК при помощи магнитных шариков DynaBeads (Dynal). РНК денатурировали 5 минут при 65С. К денатурированной РНК добавляли магнитные шарики, покрытые олиго (Т]25 и инкубировали 5 мин при комнатной температуре и непрерывном помешивании. После этого образцы трижды отмывали и элюировали РНК водой обработанной DEPC. Полученные количества мРНК оценивали при помощи агарозного гель электрофореза.
Субтрактивную гибридизацию проводили при помощи набора PCR-Select (Clontech) в соответствии с рекомендациями производителя. Образец РНК, в котором производился поиск генов с повышенной экспрессией, назывался «тестер», а образец, по отношению к которому искали повышенную экспрессию генов, назывался «драйвер».
Анализ экспрессии белков FXIIIa и TGFpRII
Проточная цитометрия проводилась при помощи прибора FACS Calibur [BD] с использованием стандартных протоколов.
В случае флуоресцентно меченых лигандов клетки отмывали 3 раза в 1 мл буфера для проточной цитометрии (3% раствора БСА в PBS) и ресуспендировали в 500 мкл того же буфера. Центрифугирование клеток во время отмывок проводилось при 500 g в течение 10 мин при 4С. Для мечения моноцитов/макрофагов антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями, плашки с культурами клеток помещали на лед на 15 мин. После этого клетки аккуратно соскребали с подложки пластиковым скребком и переносили в 1.5 мл пробирки. Образцы центрифугировали 10 мин при 500 g и 4С. Полученные клетки отмывали в 1 мл буфера для цитометрии. Клетки разделяли на порции для мечения в соответствии с количеством используемых антител и контролей изотипа.
Ресуспендировав клетки из расчета 5х105 на 100 мкл буфера, к каждому образцу добавляли соответствующие антитела или их комбинацию. После мин инкубации при 10С, клетки отмывали 2 раза в 1 мл буфера для цитометрии. Полученный после последней отмывки клеточный осадок ресуспендировали в 300 мкл буфера и переносили в пробирки для цитометрии.
Данные, полученные при помощи проточной цитометрии, визуализировали и анализировали при помощи программы WinMDI 2.8. Статистический анализ проводили при помощи статистических функций программы Excel программного пакета MS Office 2000.
Перед началом работы были протестированы 2 концентрации вортманнина: 200 пМ и 1 иМ. Концентрация 1 цМ оказалась более эффективной как в случае клеток СН0-К1, так и в случае макрофагов, поэтому данная концентрация использовалась во всех экспериментах. В случае стабильно трансфецированных клеток СНО для обработки вортманнином культуральную среду заменяли средой содержащей вортманнин и другие необходимые компоненты. В случае макрофагов вортманнин добавляли в культуральную среду. Все инкубации проводили при 37С. В случае анализа эндоцитоза обработку вортманнином начинали за 30 минут до добавления acLDL. В этом случае вортманнин присутствовал в среде на протяжении всего времени обработки.
Плашки с макрофагами помещали на лед на 20 мин. Клетки соскребали силиконовым скребком и использовали для приготовления цитоспинов из расчета 4х104 клеток на препарат. Фиксирование и окраска проводились при комнатной температуре. Клетки фиксировали 10 мин в 2% растворе PFA в PBS, пермеабилизировали 15 мин в 0.5% растворе Triton Х100 в PBS и еще раз фиксировали 10 мин в 4% растворе PFA в PBS. После тщательной отмывки в PBS, цитоспины высушивали и хранили при -80С. Окраску проводили, как описано [Kzhyshkowska et al, 2004а]. Неспецифичное связывание блокировали 3% раствором БСА в PBS, после чего препараты инкубировали с комбинацией первичных антител в течение 1 ч 15 мин; окрашенные препараты отмывали и инкубировали с комбинацией вторичных антител. Антитела F4 к стабилину-1 использовали в разведении 1:1600; антитела к ЕЕА1 использовали в разведении 1:500; анти-мышиные меченные Су2 антитела использовали в разведении 1:100; анти-мышиные меченные Су5 антитела использовали в разведении 1:400; анти-кроличьи меченные СуЗ антитела использовали в разведении 1:400. Препараты готовили для исследования в среде для иммунофлуоресценции (DakoCytomation). Образцы исследовали при помощи конфокальной микроскопии.
Микроскопию проводили при помощи конфокального лазерного сканирующего спектрального микроскопа Leica TCS SP2. Для получения всех изображений использовался иммерсионный объектив 63x1.32. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм, криптоновый лазер с длиной волны 568 нм и гелий/неоновый лазер с длиной волны 633 нм. Данные получали и анализировали при помощи программного пакета Leica Confocal Software. Все двух- и трехцветные изображения получали, используя метод последовательного сканирования для исключения перекрестного засвечивания каналов.
