Введение к работе
Актуальность проблемы
Аутоиммунные заболевания щитовидной железы1 (АИЗ ЩЖ) являются одной из важнейших и актуальных проблем современной эндокринологии. Не менее 15 миллионов человек, проживающих на территории Российской Федерации, имеют явные или скрытые нарушения со стороны функции щитовидной железы, причём ежегодно увеличивается число людей с АИЗ ЩЖ (Мельниченко Г.А., 2002; Шилин Д.Е., 2002). Главными причинами роста АИЗ ЩЖ являются дефицит йода во многих регионах страны, недостатки в проведении йодной профилактики, неблагоприятная экологическая ситуация, возникшая в результате техногенных катастроф. Совершенствование лабораторных и инструментальных методов диагностики способствовало увеличению частоты выявления заболевания.
Основными антигенами ЩЖ, имеющими значение в развитии аутоиммунных расстройств, являются тиреоглобулин (ТГ), тиреопероксидаза (ТПО) и рецептор тиреотропного гормона (рТТГ). В настоящее время ТПО рассматривается как ведущий аутоантиген (Portolano et al., 1993, Volpe 2000, Ruf et al., 2006, Ludgate et al., 2000).
Антитела (At) к ТПО выявляются в 90-100 % случаев в сыворотке больных с АИЗ ЩЖ (Marriotti et al., 1990, Feldt-Rasmussen et al., 1991, Volpe, 2000), в 20-35 % с узловым зобом, в 60-70 % с гипотиреозом и при ряде других заболеваний (Шилин Д.Е., 1998). Отмечена корреляция между титром антител к ТПО и гистологическими изменениями щитовидной железы при аутоиммунном тиреоидите (Jeng et al., 1989, Paschke et al., 1993). Эти антитела, в отличие от Ат к ТГ и рТТГ, способны фиксировать комплемент и таким образом участвовать в лизисе тиреоцитов. При этом антимикросомальные антитела по своей цитоток-сичности гетерогенны. Только часть обследованных сывороток крови больных с аутоиммунным тиреоидитом Хашимото (АИТ) обладала способностью лизи-ровать тиреоциты в присутствии комплемента (Кандрор В.И. и соавт., 1997). Антитела к ТПО в сыворотке крови больных с АИЗ ЩЖ направлены к различным участкам фермента. С помощью химерных белков выявлено 3-х кратное превышение количества аутоантител к фрагменту ТПО, сформированному 513-633 а.о., в сыворотке крови пациентов с тиреоидитом Хашимото, по сравнению с сывороткой больных ДТЗ (Berman et al., 1993). Методом проточной цитоф-луорометрии на культуре тиреоцитов было показано, что аутоантитела в образцах сыворотки крови больных с ДТЗ к эпитопу МкАт 64 (Ruf et., 1989) выявляются на 45 % чаще, чем у больных с нетоксичным многоузловым зобом (Bosso-
Использованные сокращения: Аг - антиген; АИЗ - аутоиммунные заболевания; АИТ - аутоиммунный тиреоидит; Ат - антитела; ДТЗ - диффузный токсический зоб; ГТ -гипотиреоз; ИФА - иммуноферментный анализ; МкАт - моноклональные антитела; МФТ -микросомальная фракция тиреоцитов; ОП - оптическая плотность; рТТГ - рецептор тиреотропного гормона; ТГ- тиреоглобулин; ТПО - пероксидаза щитовидной железы; дТПО - денатурированная; нТПО - нативная; УЗ - узловой зоб; ЩЖ - щитовидная железа; CBD - цел-люлозосвязывающий домен эндоглюканазы из Anaerocellum thermophilum - белок носитель; ФСБТ - фосфатно-солевой буферный раствор с 0,05 % твин 20.
wski et al. 2005). Выяснение причин подобной гетерогенности аутоантител у больных с различными нарушениями щитовидной железы может уточнить патофизиологические механизмы развития АИЗ ЩЖ.
Несмотря на многочисленные усилия в изучении ТПО и её роли в патогенезе АИЗ ЩЖ, остается ряд нерешенных вопросов, в частности, о пространственной структуре ТПО и ее функционировании на внешней поверхности тире-оцита (Nishikawa et al., 1996, Chacko et al., 1996, Chazenbalk et al., 1998, Rapoport et al., 2001, Guo et al., 2002), требующих для своего решения использования новых иммунохимических и молекулярно-биологических подходов. Таких, например, как использование моноклональных антител к ТПО и генно-инженерных пептидов (Ruf et al., 1985, Banga et al., 1986, Portolano et al., 1988). На основе сравнительного анализа специфичности МкАт и выявляемых в сыворотке с АИЗ ЩЖ аутоантител возможно определение тонкой эпитопной направленности аутоантител к ТПО при различных формах заболеваний.
Цель работы: изучение эпитопной структуры пероксидазы щитовидной железы с помощью коллекции моноклональных антител и генно-инженерных конструкций.
Задачи исследования:
Выделить из ткани щитовидной железы высокоочищенный препарат ти-реопероксидазы (ТПО).
Получить панель гибридом-продуцентов моноклональных антител к ТПО; провести клонирование гибридных культур и отобрать технологичные клоны гибридом.
Изучить специфичность моноклональных антител к ТПО в ИФА и в им-муноблоттинге.
Провести сравнительный анализ эпитопной структуры нативной ТПО с помощью панели моноклональных антител и химерных белков, включающих последовательности 599-629 а.о. и 706-720 а.о.
Исследовать эпитопную специфичность аутоантител к ТПО в сыворотке крови доноров и пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы в конкурентном ИФА с применением моноклональных антител и клонированных фрагментов ТПО.
Научная новизна
Создана панель из 36 моноклональных антител, распознающих линейные и конформационные детерминанты ТПО.
С помощью химерных белков выявлен новый линейный эпитоп, расположенный на участке 606-617а.о. ТПО в иммунодоминантной области А, распознаваемый МкАт 1 и аутоантителами.
Обосновано предположение о том, что линейные эпитопы, расположенные на участках 606-617 а.о. и 706-720 а.о. ТПО, распознаваемые МкАт 1, и 706-720 а.о. - МкАт 70, участвуют в формировании нового конформационного эпитопа на молекуле ТПО. Это согласуется с трёхмерной моделью тиреопероксидазы, в соответствии с которой эти участки молекулы пространственно сближены.
Эпитопы, выявляемые МкАт № 1, 70, 88 (линейные) и № 3 (конформацион-ный), распознаются анти-ТПО аутоантителами больных с АИЗ ЩЖ. Антитела к конформационному эпитопу 3 на 30-60 % ингибируют связывание соответствующих моноклональных антител и выявляются в 96 % образцов сыворотки крови больных с диффузным токсическим зобом и во всех исследованных -при аутоиммунном тиреоидите.
Практическая значимость
Полученная панель МкАт к пероксидазе щитовидной железы может быть использована в дальнейших исследованиях с целью выявления эпитопов ТПО, значимых для формирования аутоантител при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы.
Моноклональные антитела могут применяться в процессе выделения, очистки и контроля сохранности структуры ТПО.
Моноклональные антитела могут быть инструментом для проведения имму-ногисто- и цитохимических исследований препаратов щитовидной железы.
Основные положения, выносимые на защиту:
Создана коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител, распознающих линейные и конформационные эпитопы в молекуле пероксидазы щитовидной железы (ТПО).
Линейный эпитоп, распознаваемый МкАт 1, расположен в районе 606-617 а.о в иммунодоминантной области А молекулы ТПО. МкАт 1 реагирует и с де-терминантой, образованной линейной последовательностью 706-720 а.о. Эти линейные последовательности участвуют в формировании пространственного эпитопа, также распознаваемого МкАт 1. Линейный эпитоп, расположенный на участке 706-720 а.о. ТПО, распознается МкАт 70.
МкАт 3 (к конформационному) и 1, 70, 88 (к линейным эпитопам) выявляют в молекуле ТПО детерминанты, распознаваемые аутоантителами человека при различных АИЗ ЩЖ.
Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, доложены на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2004), на III Объединенном съезде иммунологов России (г. Екатеринбург, 2004), на VIII и X Всероссийских научных форумах с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2004, 2006).
Публикации Основные положения диссертации отражены в 7 печатных работах.
Объем и структура диссертации
Диссертация общим объемом22^стр. состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (?5*ист. отечественных и22,зарубежных). Текст диссертации иллюстрирован 17 таблицами и 43 рисунками.
