Содержание к диссертации
Список сокращений и условных обозначений 3
Введение 4
Обзор литературы 9
Глава 1 Общая характеристика рода Hantavirus 9
Глава 2 Серологическая диагностика ГЛПС 26
Собственные исследования 37
Глава 3 Материалы и методы исследований 37
Глава 4 Оптимизация условий получения очищенного рекомбинантно-
го нуклеокапсидного белка вируса Пумала 47
Оценка электрофоретических и иммунохимических свойств рекомбинантного нуклеокапсидного белка, продуцируемого трансформированными бактериями Е. coli (штамм М15) 47
Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения НКБ в составе лизата бактериальных клеток 49
Оптимизация условий экстракционной очистки нуклеокапсидного белка из бактерий-продуцентов 55
4.4 Обсуждение результатов 66
Глава 5 Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики
ГЛПС 73
Тест-система для определения IgG к нуклеокапсидному белку вируса Пумала 73
Тест-система для определения IgM к нуклеокапсидному
белку вируса Пумала 78
5.3 Выявление вирусного антигена в биологических пробах 81
5.4 Обсуждение результатов 85
Выводы 91
Список литературы 92
Список сокращений и условных обозначений
*
а.к.о. - аминокислотные остатки
Аг - антиген
Ат - антитело
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
ИФА - иммуноферментный анализ
МФА - метод флуоресцирующих антител
Р НКБ - нуклеокапсидный белок
ПААГ - полиакриламидный гель
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
УЗ - ультразвук
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ХПС - хантавирусный пульмональный синдром
BSA - бычий сывороточный альбумин
DOB - вирус Добрава
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ
ф HTN - вирус Хантаан
IgG - иммуноглобулин G
IgM - иммуноглобулин М
IPTG - изопропил-тиогалактозид
NY - вирус Нью Йорк
РН - вирус Проспект Хилл
PUU - вирус Пумала
SEO - вирус Сеул
SN - вирус Син Номбре
THAI - вирус Таиланд
Введение к работе
Актуальность проблемы
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является одним из наиболее распространенных в России, а также странах Азии и Европы зоонозных природно-очаговых заболеваний. На Республику Башкортостан приходится около половины всей заболеваемости по России [Хунафина Д.Х., 1998]. Причинным агентом, вызывающим заболевание в Республике и западной части Российской Федерации, является вирус геморрагической лихорадки Пумала, относящийся к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae. Инфекция характеризуется относительно тяжелым течением, поражением почек, сердечно-сосудистой и других систем организма. Эффективность лечения больных, а также предупреждение осложнений во многом зависит от своевременно поставленного диагноза. Достоверная клиническая диагностика ГЛПС связана с несколькими проблемами. Во-первых, многие инфекции в начале заболевания имеют неспецифические симптомы характерные и для ГЛПС. Наряду с этим могут существовать нетипичные или клинически слабо выраженные формы геморрагической лихорадки, плохо диагностируемые даже в разгар болезни [Суздальцев А.А. и др., 2003].
Приведенные данные свидетельствуют о необходимости лабораторной диагностики инфекции. Причем лабораторная диагностика должна использоваться не только для подтверждения диагноза врачей-клиницистов, но иметь самостоятельное значение, особенно, в случае, если она позволяет поставить диагноз в самом начале заболевания.
В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется метод флуоресцирующих антител. К недостаткам метода следует отнести его высокую трудоемкость и то, что он позволяет осуществлять только ретроспективную диагностику заболевания. Использование более производительного и чувствительного метода иммуноферментного анализа всегда было ограничено невозможностью наработки препаративного количества антигена
5 из-за слабой репродуктивной активности вируса в культуре клеток. Только
после того, как удалось получить системы для экспрессии рекомбинантных белков вируса, появились перспективы разработки новых препаратов для диагностики ГЛПС на основе иммуноферментного анализа.
Цель исследования
Разработать иммуноферментные тест-системы для диагностики ГЛПС на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка (НКБ) вируса Пумала и оценить их диагностическую эффективность.
Задачи исследования
Отработать условия получения очищенного рекомбинантного НКБ.
Оптимизировать параметры иммуноферментного анализа IgM и IgG к НКБ вируса Пумала в сыворотках больных ГЛПС.
Исследовать возможность выявления вирусного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью высокочувствительного иммуноферментного анализа с повышенной чувствительностью.
4. Провести оценку чувствительности и специфичности полученных
тест-систем на основе исследования сывороток больных ГЛПС, больных дру
гими инфекционными заболеваниями и сывороток здоровых доноров.
Научная новизна
Разработан новый способ экстракции рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса из бактерий-продуцентов, позволяющий существенно повысить степень чистоты препарата. Установлено, что использование высоко-очищенного НКБ увеличивает специфичность диагностики заболевания.
Впервые разработаны четыре типа иммуноферментных тест-систем на основе нуклеокапсидного белка эндемичного для Башкортостана вируса Пумала штамма «CG-Иглино 12». Установлено, что созданная на его основе тест-система для определения IgM позволяет осуществлять эффективную диагностику ГЛПС на самых ранних этапах заболевания. Предложен новый метод оценки титра IgG к вирусному антигену у больных ГЛПС и реконвалес-
центов по одному разведению сыворотки. Метод существенно увеличивает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость.
Впервые показана возможность выявления нуклеокапсидного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью высокочувствительного иммунофер-ментного анализа с усилением сигнала.
Научно-практическая значимость работы
В процессе выполнения исследований был предложен новый способ экстракционной очистки рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС, позволяющий существенно повысить степень его гомогенности. Вы-сокоочищенный белок может использоваться не только для производства ди-агностикумов, но и служить основой для создания вакцинных препаратов. Разработанные автором на основе НКБ четыре типа иммуноферментных тест-систем могут найти самое широкое применение в практике здравоохранения. Иммуноферментная тест-система для количественного определения НКБ используется в научном отделе ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СЗ РФ «Иммунопрепарат» для мониторинга рекомбинантного НКБ в процессе его экстракционной очистки из бактерий-продуцентов и выявления антигена в органах инфицированных грызунов. Кроме того, она будет совершенно необходима для стандартизации вакцинных препаратов на основе нуклеокапсидного антигена. Тест-системы для определения IgM и IgG к НКБ позволяют осуществлять эффективную серологическую диагностику ГЛПС и проводить сероэпидемиологические исследования. Высокочувствительная иммуноферментная тест-система с усилением сигнала способна обнаруживать предельно низкие концентрации вирусного антигена в сыворотках больных ГЛПС. Это свойство может оказаться полезным при изучении патогенеза заболевания, а также при испытании вакцинных препаратов на животных.
Внедрение результатов исследования в практику
На основе результатов исследований, представленных в диссертации, составлена нормативно-техническая документация на иммуноферментную тест-систему для определения IgM к нуклеокапсидному белку вируса ГЛПС
7 «ИФА-ГЛПС-IgM» и приготовлены три экспериментально-производственные серии препарата. Производство препарата предполагается осуществлять на базе ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СЗ РФ «Иммунопрепа-рат».
Основные положения, выносимые на защиту
Использование комбинированной экстракции рекомбинантного НКБ из бактерий-продуцентов позволяет повысить чистоту конечного продукта.
Иммуноферментный метод определения IgG к НКБ по одному разведению сыворотки обладает более высокой диагностической эффективностью по сравнению с методами, основанными на последовательном разведении сыворотки.
Иммуноферментная тест-система для определения IgM к рекомби-нантному НКБ позволяет осуществлять диагностику ГЛПС на ранних стадиях заболевания.
С помощью иммуноферментного анализа с усилением сигнала удается выявлять НКБ в сыворотках больных ГЛПС.
Апробация работы
Полученные результаты были представлены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), на Республиканской научной конференции молодых ученых «Медицинская наука 2002» (Уфа, 2002), на конференции «Практикующий врач» (Сочи, 2002), на IV Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2003) и на I Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.
Объем и структура диссертации
8 Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа изложена на 116 страницах, содержит 15 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 250 источников (31 отечественных и 219 зарубежных).
