Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 16
1. 1. Грипп: этиология и эпидемиология 16
1.2. Иммунный ответ при гриппозной инфекции 24
1.3. Вакцинопрофилактика гриппа 33
1.4. Генетические вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа 59
1.5. Использование рекомбинантного аденовируса для создания универсальной противогриппозной вакцины 62
Глава II Собственные исследования 66
2.1. Материалы и методы 66
2.1.1. Материалы 66
2.1.2. Методы 70
Глава III Результаты собственных исследований 86
3.1. Оптимизация аминокислотных последовательностей антигенов М2 и NP 86
3.2. Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, эффективно экспрессирующих гены антигенов М2 и NP вируса гриппа А 90
3.3. Изучение экспрессии генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов (Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST) в экспериментах in vitro 105
3.4. Изучение иммуногенности полученных препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST 110
3.5. Исследование протективных свойств препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST 118
Обсуждение результатов 127
Выводы 143
Список использованной литературы 144
- Иммунный ответ при гриппозной инфекции
- Генетические вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа
- Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, эффективно экспрессирующих гены антигенов М2 и NP вируса гриппа А
- Исследование протективных свойств препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST
Иммунный ответ при гриппозной инфекции
Клиническая картина заболевания гриппом имеет такие общие признаки как повышение температуры, кашель, слабость и миалгия. У каждого конкретного больного грипп может иметь свои особенности связанные с социальным статусом и наличием вакцинации. Как правило, сезонный грипп ограничивается мягкой формой и вышеперечисленными симптомами, однако могут встречаться и более тяжелые формы сопровождающиеся бронхитом, пневмонией и осложнениями в виде вторичных бактериальных инфекций. Кроме того, тяжелая форма заболевания гриппом может привести к осложнениям в виде сердечно-сосудистых заболеваний (Estabragh Z.R., 2013). В России наблюдается высокий уровень смертности, связанный с гриппом и его осложнениями (Слепушкин А.Н., 2003). Высоко патогенные штаммы вируса гриппа, такие как штаммы птичьего гриппа H5N1 способны приводить к тяжелым поражениям органов дыхания и полиорганной недостаточности (Hui D.S., 2008). Штаммы вируса гриппа H7N9 являются слабопатогенными для птиц, но высоко патогенными для человека. У инфецированных H7N9 людей обычно развивается пневмония и синдром респираторного дистресса. Нетипичные формы гриппа могут проявляться в виде поражений желудочно-кишечного тракта и нервной системы, как часто наблюдалось при пандемии 2009 года (Bautista E., 2010). Кроме того, клиническая диагностика гриппа А(H1N1)/California/04/2009 осложнялась наличием синдрома общей инфекционной интоксикации, острой фебрильной лихорадки постоянного типа и респираторного синдрома, в то время как такой характерный респираторный синдром гриппа, как трахеит, встречался только в 28 % случаев (Жданов К. В., 2010). Основными причинами смеретельных исходов при пандемии 2009 года являлись геморрагическое поражение легких с интерстициальным отеком (пневмонит), развитие острой дыхательной и полиорганной недостаточности (Жданов К. В., 2010).
Вирус гриппа относится к РНК-содержащим вирусам семейства Orthomyxoviridae, его геном представлен одноцепочечной сегментированной антисмысловой молекулой РНК. Семейство Orthomyxoviridae включает в себя 3 рода: А, В и С, принадлежность определенного штамма вируса к тому или иному роду зависит от свойств его внутренних белков М1 и NP, а также количества РНК-сигментов и структуру кодирования ими вирусных белков. Штаммы вируса рода А инфицируют млекопитающих и птиц, они имеют наибольшее эпидемическое значение, так как вызывают ежегодные эпидемии, а через неравные промежутки, времени пандемии. Штаммы вируса гриппа, относящиеся к роду А, разделяются на подтипы в зависимости от свойств поверхностных антигенов – гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). На сегодняшний день идентифицировано 18 подтипов гемагглютинина и 11 подтипов нейраминидазы, с минимальной перекрестной активностью в серологических реакциях (Львов Д.К., 2006a), новые антигенные варианты гемагглютинина НА 17, 18 и нейраминидазы NA 10, 11 были идентифицированы у летучих мышей (Tong S., 2012; Wu Y., 2014). Базируясь на степени сродства различных субтипов НА, вирус гриппа А был разделен на две филогенетические группы: группа 1 (H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 и H18) и группа 2 (H3, H4, H7, H10, H14 и H15). В настоящее время среди людей циркулируют вирусы двух подтипов гемагглютинина (Н1, Н3) и двух нейраминидазы (N1—N2) (Седова Е.С., 2010; Шмаров М.М., 2010). Филогенетические древа гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А представлены на рисунке 1. Штаммы вирусов гриппа рода В, так же циркулируют в человеческой популяции но не вызывают пандемии и носят более локальный характер. Род В включает в себя линии Victoria и Yamagata. Род С является наименее изученной, штаммы этого рода инфецируют только человека, но не вызывают эпидемии и проявляются лишь в виде легких спорадических инфекций у детей (Moriuchi H., 1991). Рис.1. Филогенетические древа гемагглютинина (А) и нейраминидазы (Б) (Wu Y., 2014). - недавно идентифицированные подтипы.
Вирион вируса гриппа А имеет сферическую или вытянутую форму, диаметр составляет около 0.13 мкм (Львов Д.К., 2006). В середине вириона находятся частицы рибонуклеопротеина, представляющие собой сегменты вирусной РНК и комплекс вирусных полимераз (PA, PB1, PB2), упакованные мономерами белка нуклеопротеина (NP) (Neumann G., 2004; Resa-Infante P., 2011). Схематичное изображение вириона вируса гриппа представлено на рисунке 2.
Внутри каждой рибонуклеопротеиновой частицы, молекулы вирусной РНК имеют «закрытую» конформацию, благодаря взаимодействию обоих концов сегмента РНК с вирусной полимеразой. Транскрипция и репликация каждого сегмента происходит независимо в ядре клетки, оба процесса происходят при помощи гетеротримерного полимеразного комплекса. В свою очередь, частицы рибонуклеопротеина упакованы молекулами матричного белка М1, который является одним из мажорных белков вириона (Compans R.W., 1975) и выполняет функцию «цементирования» рибонуклеопротеина с липидной мембраной, покрывающей вирион снаружи. Кроме того, он играет важную роль при сборке и отпочковывание вирусной частицы (Yasuda J., 1994). Липидная мембрана вируса гриппа состоит в основном из липидов клетки хозяина, обогащенных холестерином и гликосфинголипидами. В липидную мембрану погружены три белка - гемагглютинин, нейраминидаза и белок М2 (ионный канал), играющие основную роль в инфекционном процессе. Гемагглютинин имеет тримерную структуру, каждый мономер заякорен в мембране и состоит из двух субъединиц, одна из которых обеспечивает первичный контакт с клеткой-мишенью, другая отвечает за слияние вирусной и клеточной мембран. Верхние части белка имеют участки, связывающие сиаловою кислоту, входящую в состав рецепторов клетки хозяина. В часности, рецепторами для вируса гриппа А человека являются альфа-2,6 сиаловые кислоты, присутствующие у человека в верхнем и нижнем отделе респераторного тракта. Для вируса гриппа птиц раецепторами в свою очередь являются альфа-2,3 сиаловые кислоты, находящиеся у птиц в кишечнике. Наличие определенных рецепторов в тех или иных системах органов хозяина объясняет симптоматические проявления и механизм распространения вируса в различных видовых популяциях. Однако, необходимо отметить, что альфа-2,3 сиаловые кислоты, также присутствуют у человека на пневмоцитах второго типа, альвеолярных макрофагах и клетках кубического эпителия нижних отделов респераторноготракта, что объясняет вспышки заболевания людей высокопатогенными штаммами птичьего гриппа H5N1 (Van Riel D., 2006).
Генетические вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа
В работе были использованы коммерческие препараты специфических эндонуклеаз рестрикции и других ферментов фирм Fermentas MBI (Литва), Promega (США) и NE BioLabs (США). Для проведения ДНК-электрофореза в агарозном геле использовали коммерческие маркеры фирмы Fermentas MBI (Литва). Для приготовления буферных и других растворов использовали соли и другие реактивы фирм Serva (Германия), Sigma (США), Merck (Германия) а также соли производства Реахим (Россия) маркировки х.ч. и о.с.ч. Для выращивания клеток E.coli использовали бакто-триптон, бакто-агар и дрожжевой экстракт фирмы Difco (США). Клеточные линии культивировали с использованием сред DMEM (HyClone, США) с 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота (HyClone, США) в присутствии глутамина и смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ПанЭко, Россия), MEM (HyClone, США) с 0,2% БСА и трипсином в концентрации 1 мкг/мл и с 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (HyClone, США) в присутствии глутамина и смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ПанЭко, Россия), а также среду RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с 5% сыворотки интактных мышей, 6 ед. акт./мл IL-2 в присутствии глутамина и смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ПанЭко, Россия). Для приготовления разведений вируса гриппа использовали среду Хенкса с гидролизатом лактальбумина и антибиотиком гентомицином (ПанЭко, Россия). Для трансдукции культуры клеток вирусами гриппа использовали среду DMEM без добавления эмбриональной сыворотки КРС.
Плазмидную ДНК очищали набором JETSTAR 2.0 Plasmid Midiprep Kit (Genomed, США). Трансфекцию клеток линии 293HEK проводили с применением реагента Metafectene Pro (Biontex, Германия). Для выделения РНК применяли набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscription System (Invitrogene, США). Для иммуноблоттинга использовали нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL (Amershem, Великобритания). Детекцию результатов проводили при помощи набора ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham, Великобритания).
Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Секвенирование генов проводилось в НПФ «Литех». Синтез генетической конструкции, содержащей консенсусную нуклеотидную последовательность гена белка М2 вируса гриппа группы А, нуклеотидную последовательность пептида 2А вируса ящура и консенсусную нуклеотидную последовательность гена белка нуклеопротеина вируса гриппа группы А, а также генетической конструкции, содержащей консенсусную нуклеотидную последовательность гена белка М2 вируса гриппа группы А, нуклеотидную последовательность пептида 2А вируса ящура и консенсусную нуклеотидную последовательность гена белка нуклеопротеина вируса гриппа группы А с нуклеотидной последовательностью мотива PEST белка силигериолизина L. seeligeri, был выполнен в ЗАО «Евроген».
Лабораторные животные Эксперименты проводились на мышах линии Balb\c, самках, весом 14-16 г. 2.1.1.7. Лабораторное оборудование При выполнении работы било использовано следующее оборудование: ламинарный шкаф 2-й степени защиты; СО2-инкубатор (Sanyo, Япония); термостат воздушный ТС1/20-СПУ (Россия); аналитические и электронные весы (Sartorius, Германия); морозильная камера -700С (Sanyo, Япония); сосуды Дьюара для хранения жидкого азота СК-25, СЛ-40 (Россия); автоклав настольный (Tuttnauer, Нидерланды); дистиллятор (GFL, Германия); система для очистки воды Milli Q (Millipore, США); электропоратор MicroPulser (BioRad, США); центрифуги фирм Sigma (США), Eppendorf (Германия) с охлаждением, Elmi (Латвия), ультрацентрифуга Beckman L7-55 (Beckman Coulter, США); ледогенератор (Frimont, Италия); магнитные мешалки (Bellco, США); инвертированные микроскопы Olympus IX-71 (фотокамера Olympus, Япония), Биолам (Ломо, Россия); фотосистема Imaging system Gel Logic 200 (Kodak, США); мультиволновый фотометр IEMS Reader (Labsystems, Финляндия); спектрофотометр (Labsystems, Финляндия), спектрофотометр NanoDrop (Thermo, США); амплификаторы РТС-200 MJ Research (Канада) и МС-2 (ДНК-технология, Россия); источники тока «Эльф» (ДНК-Технология, Россия); камеры для горизонтального гель-электрофореза (BioRad, США); камеры для вертикального гель-электрофореза (BioRad, США); источник питания PowerPac Universal (BioRad, США); камера для блоттинга Semi-Dry Transfer cell (BioRad, США); проточный цитофлуориметр FACS Aries II (Becton Dickinson, США); конфокальный микроскоп Nikon Confocal microscope C-1; пипетки автоматические с изменяющимся объемом (Gilson, США); гомогенизатор SilentCrusher S (Heidolph, Германия).
Компетентные клетки получали по методике Маниатиса (Maniatis T., 1989). Для трансформации клеток E. coli штамма DH5 плазмидной ДНК использовали метод Hanahan (Hanahan D., 1983). Эффективность трансформации составляла 97 – 98 трансформированных клонов на 1 мкг плазмиды pBluescript II SK(-). 2.1.2.2. Подготовка и трансформация компетентных клеток E. coli штамма BJ5183 Отбирали несколько колоний E.coli, выращенных на LB-агаре в термошейкере при +37оС и 220 об/мин до OD600 равного 0,5-0,7. После этого клетки, перенесенные в стерильные полипропиленовые пробирки, инкубировали на льду 20 мин, суспензию центрифугировали (4000 об/мин при +4С в течение 15 мин). Супернатант сливали, к осадку добавляли 60 мл холодного 10% раствора глицерина. Суспензию центрифугировали (4000 об/мин при +4С в течение 15 мин). Супернатант сливали, к осадку добавляли 40 мл холодного 10% раствора глицерина. Суспензию центрифугировали (4000 об/мин при +4С в течение 15 мин). Супернатант сливали, к осадку добавили 14 мл холодного 10% раствора глицерина. Суспензию центрифугировали (4000 об/мин при +4С в течение 15 мин). После чего осадок клеток ресуспендировали в 4 мл холодного 10% раствора глицерина. Полученную суспензию клеток разливали в стерильные пробирки по 40 мкл. Полученные электрокомпетентные клетки E.coli BJ5183 хранили в холодильнике при температуре -70С. Для трансформации клеток E. coli штамма BJ5183 использовали метод электропорации. Смесь ДНК добавляли к 40 мкл электрокомпетентных клеток E. coli BJ5183, суспензию помещали в 2-мм кюветы для электропорации и пропускали единичный импульс тока длительностью 6,0 мс при 2500 В, 200 Ом и 25 мкФ на приборе Gene Pulser (Bio-Rad, США). После чего к клеткам добавляли 1 мл SOB-бульона, инкубировали при +37C в течение 60 мин. Затем клетки высевали на чашки с LB-агаром, содержащим селективный антибиотик, подращивали в течение 24 часов при температуре +37С. Эффективность трансформации составляла 103–105 трансформированных клонов на 1 мкг плазмиды pBluescript II SK(-).
Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, эффективно экспрессирующих гены антигенов М2 и NP вируса гриппа А
Экспрессия генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST, была изучена при помощи методов иммуноблоттинга и иммуногистохимии. Результаты иммуногистохимии оценивали при помощи конфокальной микроскопии совмесно с к.б.н. Лысенко А.А. (лаб. молекулярной биотехнологии).
Изучение экспрессии генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов методом иммуноблоттинга Для анализа экспрессии генов М2 и NP в составе рекомбинантных аденовирусов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST применяли метод иммуноблоттинга. Клетки линии А549 (карциномы легких человека) рассевали на культуральные чашки диаметром 3см и трансдуцировали полученными рекомбинантными аденовирусами Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, трансдуцированные рекомбинантным аденовирусом Ad5-null, не несущим трансгена, в качестве положительного контроля использовали вирус гриппа A/USSR/90/77 (H1N1) очищенный и сконцентрированный в градиенте сахарозы. Лизаты образцов трансдуцированных клеток подвергали вертикальному электрофорезу в ПААГ, а затем иммуноблоттингу, как описано в главе 2.1.2.17. Результаты иммуноблоттинга представлены на рисунке 16.
Данные, полученные методом иммуноблоттинга показывают значимый уровень экспрессии генов М2 и NP в составе рекомбинантного аденовируса Ad5et-M2NP, так и генов М2 и NP-PEST в составе рекомбинантного аденовируса Ad5et-M2NP-PEST. При этом продуктами экспрессии генов М2 и NP в случае Ad5et-M2NP являются белок M2 (12кДа), белок NP (56кДа) и химерный белок M2NP (69кДа), при синтезе которого не произошло расщепления в последовательности пептида 2А. Продуктами экспрессии в случае Ad5et-M2NP-PEST являются белок M2 (12кДа), белок NP с мотивом PEST(59кДа) и химерный белок M2NP-PEST (72кДа), при синтезе которого не произошло расщепления в последовательности пептида 2А.
Для оценки экспрессии генов М2 и NP в составе рекомбинантных аденовирусов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST применяли метод иммуногистохимии с использованием моноклональных антител мыши к белкам М2 (14C2) и NP (В248М) и вторичных антител, меченных флуоресцентным красителем Dylight 488. Для этого клетки линии А549 (карциномы легких человека) трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, трансдуцированные рекомбинантным аденовирусом Ad5-null, не несущим трансгена, в качестве положительного контроля использовали клетки, инфицированные вирусом гриппа A/USSR/90/77 (H1N1). Через 48 часов после трандукции клетки фиксировали ацетоном и инкубировали с антителами, как описано в главе 2.1.2.15. Оценку результатов иммуногистохимии проводили методом конфокальной микроскопии (рисунки 17 и 18). При помощи антител, меченных флуорисцентным красителем, происходит окрашивание белков М2 и NP в зеленый цвет, при помощи красителя DAPI происходит окрашивание ядер клеток в синий цвет.
Как видно на снимках, сделанных при помощи конфокальной микроскопии, помимо цитоплазматической локализации белка М2 наблюдается его локализация на цитоплазматической мембране, что имеет важное значение при использовании белка М2 как компонента, стимулирующего гуморальный иммунный ответ. Возможно, что цитоплазматическая локализация белка М2 связана с наличием химерного белка M2NP, в то время как отдельные формы М2 локализуются трансмембранно, Кроме того, снимки конфокальной микроскопии показывают, что локализация белка NP в клетках, трансдуцированных полученными рекомбинантными аденовирусами, является цитоплазматической в отличие от положительного контроля, где белок NP локализуется в ядре. Цитоплазматическая локализация белка NP свидетельствует об успешном удалении из его последовательности неканонического сигнала ядерной локализации, что делает белок NP доступным для деградации в цитоплазме через 26S протеосому и эффективной презентации в комплексе с молекулами МНС I класса. 3.4. Изучение иммуногенности полученных препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST
Иммуногенность полученных препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST оценивали путем изучения их способности индуцировать гуморальный и клеточный иммунный ответ у иммунизированных лабораторных животных. Изучение гуморального иммунного ответа проводили путем детекции антител к антигенам М2 и NP в сыворотке крови лабораторных животных, однократно интраназально иммунизированных полученными рекомбинантыми аденовирусами. Изучение клеточного иммуннного ответа проводили методом ELISPOT. При помощи данного метода определяли количество спленоцитов, секретирующих IFN- в ответ на специфическую реактивацию дендритными клетками, презентирующими антигены М2 и NP, у мышей, однократно интраназально иммунизированных препаратами Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST.
Исследование протективных свойств препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST
При втором варианте эксперимента, для специфической реактивации спленоцитов, использовали дендритные клетки трансдуцированные Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST. В данном варианте, согласно классическим представлениям иммунологии, процессинг антигенов М2 и NP должен происходит в цитоплазме, а презентация эпитопов в составе МНС I класса. Однако, нельзя исключать презентацию антигенов в составе МНС II класса, вследствии гибели одних трансдуцированных дендритных клеток, выхода антигенов во внешнюю среду и их фагоцитоз другими дендритными клетками. Кроме того, существуют данные генерации эпитопов в цитоплазме, презентирующихся в составе МНС II класса (Tewari M.K., 2005) Недостатком данного варианта эксперимента, является отсутствие возможности оценки уровеня иммунного ответа к каждому антигену в отдельности. В результате, было детектировано значимое количество IFN--секретирующих клеток, как при специфической реактивации дендритными клетками, трансдуцированными Ad5et-M2NP, так и при специфической реактивации дендритными клетками, трансдуцированными Ad5et-M2NP-PEST. Причем, при вычитании контрольных значений, количество детектированных IFN--секретирующих клеток было достоверно выше, чем в первом варианте постановки эксперимента. Данное явление может быть объяснено тем, что при втором варианте эксперимента, в иммунологических реакциях задействованы Т-лимфоциты специфичные как к антигену М2, так и к антигену NP, тогда как в первом варианте задействованы Т-лимфоциты, специфичные к одному из антигенов. Во втором варианте постановки эксперимента, также была выявлена кореляция между дозой иммунизации и уровнем иммунного ответа.
Кроме того, общим для обоих экспериментов являлось детекция более высокого количества IFN--секретирующих спленоцитов, при иммунизации мышей Ad5et-M2NP. Более низкая иммунногенность Ad5et-M2NP-PEST может быть объяснена падением титра препарата непосредственно перед иммунизации, а также более сильных разбавлением при диализе. Влияние мотива PEST на понижение иммуногенности мало вероятно, поскольку самое большое различие между группами мышей иммунизированных Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST, наблюдадось при реактивации спленоцитов дендритными клетками, презентирующими антиген М2, аминокислотная последовательность которого идентична. Тем не менее, повышения иммуногенности антигена NP при его модификации мотивом PEST показано не было. Данные полученные A. D. Altstein et al., также не продемострировали повышения иммуногенности антигена NP при его модификации мотивом PEST, взятым от мышиной орнитин декарбоксилазы (Altstein A.D., 2006). Кроме того, P. Ilyinskii, при попытке создания высокодеградабельных мутантных форм белка NP, смог добиться этого лишь внеся 10 вставок двух повторов аспарагиновой кислоты (DD-инсерции) в его последовательность (Ilyinskii P.O., 2008). Также, P. Ilyinskii продемостровал, что фьюжен полипептиды NP–M1–NS1, NP–M1–NS1–M2 и NP–M1–M2–NS1 имеют разную степень деградабельности (Ilyinskii P.O., 2008). В данном случае, это имеет значение, поскольку анализ экспрессии генов М2 и NP в составе препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST выявил наличие недорасщепленных фьюжен полипептидов M2NP и M2NP-PEST. Таким образом, наличие последовательностей белка М2 и пептида 2А на N-конце белка NP, может влиять на скорость деградации NP и нивелировать влияние модификации мотивом PEST, что в конечном итоге может выражаться в одинаковом уровне иммуногенности полипептидов M2NP и M2NP-PEST.
На следующем этапе работы, нами было продемонстрировано, что однократная интраназальная иммунизация рекомбинантными аденовирусами Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST обеспечивает защиту мышей от заражения летальной дозой вируса гриппа А различных подтипов. Мышей иммунизировали дозой 108 БОЕ, так как именно эта доза показала более высокий уронь иммунного ответа в ELISPOT. Через месяц после иммунизации, животные были заражены 10ЛД50 вирусов гриппа A/USSR/90/77 (H1N1), . A/BlackDuck/NewJersey/1580/78 (H2N3), A/Aichi/2/68 (H3N2), A/Duck(Mallard)/Pensylvania/10218/84 (H5N2) и A/Swine/Hong Kong/9A-1/98 (H9N2). Использование в качестве моделей летальной инфекции вирусов гриппа А, выше указанных подтипов, позволяет оценить протективные свойства препаратов Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST в отношении разных филогенетических подгрупп, а так же судить о спектре широты протективного иммунного ответа, индуцируемого полученными препаратами. В результате экспериментов была продемонстрирована 100%-ная защита иммунизированных мышей против вирусов гриппа H2N3, H5N2 и H9N2, а так же 90 и 80%-ная защита против вирусов гриппа H1N1 и H3N2 (рис. 25-29). Кроме того, при заражении мышей вирусами гриппа H2N3 и H5N2 вес мышей не снижался. Таким образом, полученные рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие гены консервативных антигенов М2 и NP, способны индуцировать защитный эффект против широкого спектра различных штаммов вируса гриппа А, относящихся к разным подтипам (табл. 4). Усиления протективного эффекта при использование антигена NP c мотивом PEST не наблюдалось, напротив, при заражение вирусами гриппа подтипов H1N1 и H3N2, группы мышей, иммунизированные Ad5et-M2NP-PEST, продемонстрировали выживаемость на 10% ниже чем группы, иммунизированные Ad5et-M2NP. Тем не менее, снижение протективного эффекта при использование мотива PEST не является статистически достоверным. Полученные рекомбинантные аденовирусы Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST, экспрессирующие гены консервативных антигенов М2 и NP вируса гриппа А, способны индуцировать формирование протективного иммунного ответа широкого спектра действия, при однократной интраназальной иммунизации, и могут быть использованы для дальнейшего изучения подхода к созданию универсальной вакцины против вируса гриппа А.
Итак, нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа, несущие гены консервативных антигенов М2 и NP вируса гриппа А под контролем индуцибельного промотора. Впервые были подобраны оптимальные аминокислотные последовательности антигенов М2 и NP наиболее гомологичные между различными штаммами вируса гриппа А. Впервые разработан дизайн генетических конструкций, содержащих гены антигенов М2 и NP связанные между собой нуклеотидной последовательностью саморасщепляющегося пептида 2А. Была показана экспрессия генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов. Была продемонстрирована индукция как специфического гуморального, так и клеточного иммунного ответа к антигенам М2 и NP в организме мышей, иммунизированных полученными рекомбинантными аденовирусами. Была продемонстрирована защита мышей против различных штаммов вируса гриппа А, относящихся к разным подтипам, при помощи однократной интраназальной иммунизации полученными рекомбинантными аденовирусами. Таким образом, препараты Ad5et-M2NP и Ad5et-M2NP-PEST можно рассматривать в качестве инструментов для разработки подхода к созданию новых универсальных противогриппозных вакцин, обладающих широким спектром действия в отношение различных штаммов вируса гриппа А.
![Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс]](/i/i/4286/206226.png "Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс] Петухова Галина Дмитриевна")
