Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время инфекции, передающиеся воздушно-капельным путем занимают лидирующие позиции среди всех инфекционных заболеваний человека. Вирус гриппа (ВГ) А/H5N1 наиболее патогенный среди других вирусов гриппа. По данным ВОЗ уже за 2010-2011 гг, в эпизоотию, вызванную ВГ А/H5N1, были вовлечены страны Африки, Азии и Европы и летальность среди людей остается по-прежнему высокой – от 60 до 73%; среди детей – до 15 лет – до 89% (www.who.int/ru/, 2010-2011).
Постоянная «эволюция» вирусов гриппа А/H5N1, возможность их реассортации с адаптировавшимися в человеческой популяции штаммами вируса гриппа А и лекарственная полирезистентность к имеющимся противовирусным препаратам являются факторами, обусловливающими опасность появления нового высокопатогенного и высококонтагиозного антропозоонозного вируса гриппа А/H5N1 и его распространения как пандемичного (ВОЗ, 2010; Shortridge K.F. et al., 2000; Ilyushina N.A. et al., 2010). Несмотря на высокую актуальность проблемы гриппа ряд аспектов патогенеза данного заболевания у млекопитающих и человека остается малоизученным.
Наиболее выраженные патологические изменения при вирусе гриппа А/H5N1 проявляются в дыхательных путях млекопитающих и человека, что связано с пневмотропностью вируса (Свирщевская Е.В. и др., 2005; van Riel D. et al., 2006). Поэтому ведущее значение в иммунопатогенезе гриппа А/H5N1 принадлежит альвеолоцитам, эндотелиоцитам сосудов легких и клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) – легочным макрофагам, как первой линии защиты, которые имеют свои функциональные особенности. Благодаря своей фагоцитозной и секреторной активности, макрофаги выполняют функцию барьера на пути проникновения в организм возбудителя, способствуя ограничению распространения вируса в организме, и играют ключевую роль в инициации и регуляции иммунного ответа при гриппе. Количественная и функциональная недостаточность исследуемых клеток является основой возникновения ряда тяжелых осложнений при инфекционных заболеваниях, в том числе и при вирусных инфекциях (Шкурупий В.А. и др., 1999; Li N. et al., 2008).
Комплексная иммуноморфологическая оценка структурно-функциональных особенностей исследуемых клеток при гриппе А/H5N1 позволит не только улучшить диагностику вирусных инфекций, научно обоснованно осуществить прогнозирование развития болезни и её осложнений, но и одновременно осуществить принципиально новые подходы к профилактике и лечению гриппа, направленные на снижение риска заболеваемости гриппом людей и уменьшение частоты и тяжести его осложнений.
Цель исследования: изучить морфофункциональные и количественные изменения клеток легких (альвеолоцитов, эндотелиоцитов сосудов и макрофагов) мышей линии С57Bl/6 в процессе формирования противовирусного ответа на инфицирование вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.
Задачи исследования:
1. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких у интактных мышей линии С57Bl/6.
2. Методами иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии исследовать топологию вируса в клетках легких мышей линии С57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 на разных сроках заболевания.
3. Изучить структурно-функциональные изменения легких мышей линии С57Bl/6 в динамике развития вирусной инфекции.
4. Изучить морфофункциональные особенности клеток легких мышей линии С57Bl/6 после инфицировании вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 и их вероятную регуляторную роль в развитии вирусной инфекции.
Научная новизна. Впервые на интактных мышах-самцах линии С57В1/6 методами морфометрии и иммуногистохимии было показано, что альвеолоциты, эндотелиоциты и макрофаги легких вне зависимости от специализированных функций клеток первых двух типов представляют собою единую структурно-функциональную систему поэлементно способную дополнять друг друга в выполнении функции поддержания гомеостаза в организме своими развитыми системами лизосомальных протеаз, NO-синтаз, экспрессией полипотентных провоспалительных цитокинов TNF- и IL-6.
Впервые методами иммунофлуоресцентной микроскопии было показано персистирование вируса гриппа А/H5N1 штамма A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в альвеолоцитах, эндотелиоцитах сосудов легких и макрофагах мышей линии C57Bl/6. Было установлено, что первыми в противовирусную «борьбу» включаются и инфицируются альвеолоциты в связи с анатомическим расположением и наличием у них на клеточной поверхности сиаловых кислот, затем эндотелиальные клетки сосудов, что свидетельствует о диссеминации вируса и легочные макрофаги.
Вирус индуцирует в этих клетках процессы деструкции апоптозом, их пролиферацию, активацию экспрессии внутриклеточных энзимов (лизосомальные гидролазы – lysozyme, cathepsin D и myeloperoxidase, NO-синтазы – eNOS и iNOS), а также цитокинов. Показано, что кроме цитопатического действия вирусов на эти клетки после интернирования в них, на увеличение масштаба деструктивных процессов в легких оказывают влияние развивающаяся патогенетически поэтапно – системная гипоксия и ишемия вследствие: деструкции сосудов с развитием геморрагических и тромбоэмболических осложнений, повышения проницаемости и развития отечного синдрома в интерстиции и альвеолах, деструкции альвеолярного эпителия и острой диффузной эмфиземы, активации синтеза оксида азота и создания условий для лабилизации мембран лизосом с последующей стимуляцией репаративной регенерации по типу substitucio, усугубляющей нарушение процессов газообмена. Впервые показано, что инфицирование этих клеток кроме деструкции сопряжено с выраженной активацией процессов пролиферации, восстанавливающей нарушенный структурный гомеостаз в легких, но расширяющих трофическую базу для вируса. Показано, что инфицирование вирусом гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с существенной активацией клеточного звена иммунитета, резкого увеличения экспрессии провоспалительных полипотентных цитокинов TNF- и IL-6, способных также усилить как процессы пролиферации и деструкции так и фиброзирования органа. Изучены масштабы и динамика экспрессии каждого из этих цитокинов клетками трех вышеупомянутых типов.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные дополняют известные сведения о патогенезе гриппа А H5N1 в легких млекопитающих (Шаркова Т.В. и др., 2008; Шестопалов A.M. и др., 2008; Uiprasertkul M.P. et al., 2007; Zeng H. Et al., 2012).
Масштабы, характер и динамика исследованных деструктивных последствий в легких после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 свидетельствуют о необходимости максимально ранних профилактики и лечения данного заболевания. Полученные результаты о роли альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов легких в патогенезе деструкции легких после инфицирования вирусом гриппа А могут быть использованы для разработки средств профилактики заболевания и лечения осложнений.
Полученные данные существенно дополняют плохо изученный патогенез вирусной инфекции, вызываемой новым штаммом вируса гриппа А/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, что может быть внедрено в процесс преподавания, патологической физиологии, патологической анатомии, клеточной биологии, курса «инфекционные болезни», послужить основой для разработки средств и способов патогенетической профилактики и терапии в соответствии с формирующимися синдромами заболевания.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. ВГ АН5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 способен инфицировать альвеолоциты, эндотелиоциты сосудов и макрофаги легких, что сопряжено с их гибелью и персистенцией вируса в них на протяжении всего эксперимента. Инфицирование этим вирусом гриппа индуцирует развитие каскада патологических процессов, итогом, которых является создание условий для развития острой системной гипоксии и ишемии, следствием которых являются масштабные процессы деструкции, доминирующие в проявлениях ответной реакции организма (в частности легких) на вирус.
2. Инфицирование мышей ВГ А/H5N1 сопряжено с активацией репаративных процессов, проявляющихся пролиферацией альвеолоцитов, эдотелиоцитов сосудов и макрофагов легких, способствующих восстановлению утраченных структур, но расширяющих трофическую базу для вируса. Они проявляются заместительным, и постгипоксическим фиброзированием легких, ухудшающим условия для газообмена в интерстиции.
3. Альвеолоциты и эндотелиоциты вне связи с их специализированными функциями вместе с макрофагами легких формируют единую систему сохранения внутренней среды организма за счет высокой экспрессии ими протеаз и NO-синтаз, способности резко усиливать экспрессию TNF- и IL-6. Вместе с тем, в условиях острой гипоксии, эти проявления защитной функии вышеуказанных клеток могут усугубить деструкцию легких в связи с возможной пермеабилизацией лизосом, усилением образования активированных метаболитов кислорода. Инфицирование мышей вирусом гриппа А/Н5N1 сопряжено с активацией клеточного звена иммунитета, однако недостаточной для его эффективной элиминации.
Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в практику преподавания на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрав России в раздел «Иммунопатологические процессы и «Инфекционные болезни».
Апробация работы. Материалы исследований доложены на XLIX Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2011); IV Международной научно-практической конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, список цитированной литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 321 источник, в том числе 267 работ зарубежных авторов.
