Введение к работе
Актуальность исследования. Легкие, помимо своей основной функции газообмена между кровью и воздухом, выполняют в организме многообразные и сложные, так называемые «нереспираторные» функции, которые играют роль в экзо- и эндогенной защите организма в норме и при развитии различных патологических процессов (Зайко Н.Н., 1996; Максумова З.Х., 2006). Легкие обеспечивают очистку воздуха и крови от вредных примесей, осуществляют детоксикацию, ингибирование и депонирование многих биологически активных веществ, выполняют фибринолитическую, антикоагулянтную, выделительную функции, являются основным органом образования тромбоцитов (помимо красного костного мозга) и секвестрации нейтрофилов, а также биологическим фильтром, выполняющим функции защиты от респираторных инфекционных агентов (Сыромятникова Н.В., 1987; Седов А.А., 2011; Gebb S.A., 1995; Hogg J.C., 1995; Baskaran H., 2000; Zucker- Franklin D., 2000; Doerschuk C.M., 2001; Burns A.R., 2003; Pascual J.L., 2003; Campbell I., 2005; Fuentes R. et al., 2010; Reems J.A., 2010; Rohan K.A., 2011).
В формировании резистентности организма к вирусам, в том числе вирусу гриппа А, большую роль играют факторы врожденного, или антиген- неспецифического, иммунитета в органах дыхания: внеклеточные (термолабильные P- липопротеины, компоненты слизи и сурфактанта) и клеточные, к которым относятся макрофаги (Мф*), нейтрофилы (Нф) и естественные киллеры (ЕК) (Медуницын Н.В., 2004; Пак С.Г., 2008; Kamps B.S., 2006; Mayer G., 2006). При этом Мф и Нф представляют собой первую линию противовирусной защиты, препятствуя размножению вируса гриппа (ВГ) в клетках-мишенях, тогда как ЕК распознают и уничтожают уже вирус-продуцирующие клетки (Медуницын Н.В., 2004; Мейл Д., 2007; Hawgood S., 2004; Mayer G., 2006). Позже, по мере развития инфекционного процесса подключаются антиген-специфические факторы иммунитета - лимфоциты (Лф) и антитела (АТ) (Абатуров А.Е., 2006; Мейл Д., 2007; Mayer G., 2006).
Резистентность организма к вирусам зависит от функционального состояния его основных физиологических систем, в регуляции которого принимают участие глюкокортикоидные гормоны. Известно, что глюкокортикоиды являются необходимым действующим началом при возникновении стрессовых ситуаций, требующих мобилизации адаптационных возможностей организма (Килесса В.В., 2010; Chrousos G.P., 2005; Grbovic L., 2005; Lowenberg M., 2008).
* Список сокращений - на обороте автореферата.
Однако на фоне стресса в организме человека и животных наблюдается подавление первичного и вторичного иммунного ответа, активизация латентных вирусных инфекций и более тяжелое течение инфекционных заболеваний, в том числе гриппа (Фролов Б.А., 1991; Похилько А.В., 1995; Машковский М.Д., 2010; Villard J., 2006). Полагают, что все эти эффекты могут быть обусловлены повышением уровня циркулирующих глюкокортикоидных гормонов, но при значительном дефиците этих гормонов в организме гуморальный иммунный ответ ингибируется или вообще не развивается (Воробьев А.И., 2005; Насонов Е.Л., 2011; Sheridan J.F., 2000; Frustaci A., 2003).
Глюкокортикоиды широко используются в клинической практике в качестве средств неотложной терапии, для коррекции ряда гипериммунных состояний, а также в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся агранулоцитозом (Воробьев А.И., 2005; Машковский М.Д., 2010; van der Velden V.H., 1998; Ozkiris A., 2005; Barczyk K., 2010). В отличие от цитостатиков иммуносупрессивные свойства глюкокортикоидов не связаны с митостатическим действием (Дейл М.М., 1998; Машковский М.Д., 2010; Barnes P.J., 1998; Barczyk K., 2010).
Их эффект является результатом подавления разных этапов иммуногенеза: миграции стволовых клеток, взаимодействия Т и В Лф, торможения высвобождения цитокинов из Лф и Мф и других реакций иммунной системы (Фрейдлин И.С., 1998; Машковский М.Д., 2010; Насонов Е.Л., 2011). При этом глюкокортикоиды в высоких дозах могут вызывать ряд побочных эффектов, в том числе понижение сопротивляемости организма различным инфекциям (Машковский М.Д., 2010; Borghetti P., 2009; Kumar D., 2010).
Вместе с тем, известные иммунодепрессивные и противовоспалительные эффекты глюкокортикоидов не дают однозначного и полного ответа, почему они понижают резистентность организма к инфекционным агентам, в том числе к ВГ, и вызывают осложнения инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно в органах дыхания. Считают, что восприимчивость клеток-мишеней респираторных органов к ВГ определяет развитие инфекционного процесса (Wijburg O.L., 1997; Herold S., 2006, 2008). Однако неизвестно, каким образом повышенный уровень глюкокортикоидов влияет на течение гриппозной инфекции, в целом, и на восприимчивость клеток-мишеней в органах дыхания к ВГ, в частности.
Показано, что количество альвеолярных макрофагов (АМф) и Нф в легких увеличивается в ответ на размножение ВГ в клетках-мишенях (Пак С.Г., 2008; Fujisawa H., 2001; Wareing M.D., 2007; Teske S., 2008). Однако остаются практически
не изученными роль АМф и Нф в развитии осложнений, часто возникающих на фоне повышенного уровня глюкокортикоидов в организме, в том числе в понижении резистентности организма к ВГ. Вместе с тем, давно установлено, хотя и остается без должного внимания исследователей, что глюкокортикоиды вызывают ускорение созревания и выход Нф из синусов костного мозга, способствуя возникновению нейтрофилеза в крови (Машковский М.Д., 2010; Страчунский Л.С., 2011; Fukakusa M., 2005). При этом есть доказательства, что избыточное количество циркулирующих Нф удаляется из организма, главным образом, через легкие, которые являются одним из мест их секвестрации и метаболизации (Cohen A.B., 1983; Suwa T. et al., 2001; Burns A.R., 2003; Pascual J.L., 2003; Rohan K.A., 2011).
Что касается роли Нф в защите организма от ВГ и в развитии инфекционного процесса в легких, то до сих пор она считается спорной и неоднозначной (Пак С.Г., 2008; Fujisawa H., 2001; Tumpey T.M., 2005; Wareing M.D., 2007; Wang J.P., 2008; Silva M.T., 2010). Кроме того, остается неясным, как изменяется под влиянием глюкокортикоидов численность и функциональная активность АМф и Нф в легких, особенно при последующем заражении ВГ. Важной проблемой является также возможность коррекции с помощью иммуностимуляторов пониженной после введения глюкокортикоидов резистентности организма к ВГ. Также неизвестно, какую роль играет изменение численности и функциональной активности АМф и Нф после введения иммуномодуляторов в разных схемах и дозах до момента инфицирования на формирование резистентности организма к ВГ. В связи с этим, в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.
Цель исследования. Изучить патогенетическую роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии гриппозной инфекции после предварительного введения экспериментальным животным иммунодепрессантов или иммуностимуляторов.
Задачи исследования:
-
Изучить изменение функциональной активности макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства и перитонеальной полости у крыс под влиянием глюкокортикоидов (на примере преднизолона и кеналога).
-
Определить основные патогенетические параметры осложненного развития инфекционно-воспалительного процесса в модели понижєншй рєзистєнтшсти организма к вирусу гриппа, воспроизводимой посредством предварительного введения мышам глюкокортикоида пролонгированного действия кeнaлoгa.
-
Исследовать функциональную активность альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, восприимчивость легких и трахеи (in vivo), а также клеток легких и трахеи (in vitro) к штамму вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа после введения кеналога.
-
Исследовать возможности коррекции функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов и пониженной резистентности мышей к вирусу гриппа, возникающей после введения кеналога, с помощью иммуностимулятора хитокарбоксиметилгликана.
-
Изучить резистентность мышей к вирусу гриппа и изменение численности и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов при аэрогенном введении препаратов полипренолов, обладающих иммуномодулирующей активностью.
Научная новизна работы
Впервые исследованы и проанализированы особенности популяционного состава клеток, численности и функциональной активности макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства крыс при введении глюкокортикоидов. Доказано, что глюкокортикоиды в высоких дозах усиливают миграцию нейтрофилов в легкие способствуя накоплению в них нейтрофилов, обладающих высоким провоспалительным потенциалом.
Впервые обнаружено разнонаправленное действие глюкокортикоидов на макрофаги и нейтрофилы в разных компартментах организма: усиленное рекрутирование нейтрофилов в легкие, создающее их численное и функциональное преимущество над альвеолярными макрофагами, и уменьшение численности макрофагов и нейтрофилов в перитонеальной полости, что происходит на фоне глюкокортикоид-индуцированного нейтрофилеза в крови.
Впервые обнаружено, что предварительное введение мышам кеналога не повышает восприимчивость легких и трахеи (in vivo) и первичной суспензионной культуры клеток легких и трахеи (in vitro) к вирусу гриппа, то есть не понижает соответствующие 50 %-е инфицирующие дозы вируса гриппа. Установлено, что продукция вируса гриппа в легких у животных, предварительно получавших кеналог, на ранних стадиях гриппозной инфекции повышена, но на более поздних и к моменту гибели понижена относительно контроля из-за ускоренного истощения пула клеток- мишеней для вируса гриппа в начале инфекционного процесса.
Впервые разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа (штамм А/АісМ/2/68 ffiN2), с помощью которой
продемонстрировано, что понижение резистентности к вирусу гриппа у мышей, предварительно получавших кеналог, обусловлено более сильными, чем в контроле, повреждениями легких, связанными с увеличением количества и биоцидной активности нейтрофилов, при понижении доли и функциональной активности альвеолярных макрофагов. Доказано, что именно резкий дисбаланс между популяциями альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, наблюдаемый после введения кеналога и последующего заражения вирусом гриппа, является одной из основных причин более тяжелых патоморфологических изменений в легких, что лежит в основе повышенной гибели животных.
Впервые продемонстрирована возможность восстановления баланса между показателями количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, а также коррекции пониженной кеналогом резистентности мышей к вирусу гриппа с помощью стимулятора макрофагальной активности хитокарбоксиметилгликана.
Впервые показано, что полипренолы пихты сибирской (Abies sibirica) обладают профилактической эффективностью в отношении вируса гриппа в том случае, если инфицирование происходит через 3 суток после их двукратного аэрогенного введения. Однако после двукратного введения полипренолов за 2 суток до инфицирования резистентность организма к вирусу гриппа не изменяется или понижается, что связано с недостаточной стимуляцией функциональной активности популяции альвеолярных макрофагов по сравнению с популяцией нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическое значение работы заключается в открытии феномена направленной миграции нейтрофилов в легкие, возникающей после введения глюкокортикоидов в высоких дозах. При этом на фоне нейтрофилеза и депрессии функций альвеолярных макрофагов в результате действия глюкокортикоидов в бронхоальвеолярном пространстве скапливается огромная масса функционально активных нейтрофилов. Это создаёт угрозу развития острого респираторного дистресс синдрома (ОРДС) или других нейтрофил-зависимых повреждений лёгочной ткани. Настороженность практикующих врачей по поводу возможности возникновения в легких патологических процессов, обусловленных аккумуляцией нейтрофилов, может способствовать более оправданой тактике интенсивной глюкокортикоидной терапии и проведению дополнительных исследований бронхоальвеолярных клеток.
Доказано, что соотношение количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при введении мышам глюкокортикоида кеналога с последующим заражением вирусом гриппа соответствует более выраженным патоморфологическим изменениям легочной ткани. Это отражает тяжесть воспалительного процесса и может иметь диагностическую и прогностическую значимость в пульмонологии для принятия правильной тактики и стратегии в процессе лечения заболеваний легких, в том числе для предотвращения развития ОРДС или других нейтрофил-зависимых повреждений легочной ткани.
Своевременное применение стимуляторов функциональной активности альвеолярных макрофагов на фоне действия глюкокортикоидов в высоких дозах снижает численность нейтрофилов в альвеолах и бронхах и может способствовать уменьшению риска возникновения нейтрофил-зависимых осложнений в легких, а также предотвращению снижения резистентности организма к вирусу гриппа. В связи с этим стимуляторы макрофагов могут быть рекомендованы для профилактики воспалительно-деструктивных процессов в лёгких, ассоциированных с интенсивной глюкокортикоидной терапией, гиперсекрецией коры надпочечников или последствиями хронического стресса.
В данной работе была разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа (штамм A/Aichi/2/68 H3N2), которая воспроизводится при однократном подкожном введении глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога с последующим заражением вирусом гриппа и может быть рекомендована для тестирования иммуномодулирующей, антипротеазной или противовирусной активности препаратов, перспективных для применения в качестве средств патогенетической или этиотропной терапии гриппа.
По результатам обнаруженной нами профилактической эффективности полипренолов пихты сибирской в отношении вируса гриппа получен Патент RU (11) 2189231 (13) Cl от 20.09.2002 «Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций». Вместе с тем, при применении полипренолов или других препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью, обязательно следует учитывать то, что резистентность организма к вирусу гриппа может понижаться, если инфицирование происходит в период преимущественной стимуляции в бронхоальвеолярном пространстве функциональной активности популяции нейтрофилов по сравнению с популяцией альвеолярных макрофагов.
Материалы исследования функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов при введении глюкокортикоидов нашли отражение в монографии «Лекции по клинической патологии: Руководство для врачей» (1997) Д.Н. Маянского и И.Г. Урсова.
Положения, выносимые на защиту:
После применения глюкокортикоидов в высоких дозах усиливается направленная миграция циркулирующих нейтрофилов в легкие, что приводит к повышению численности и биоцидного потенциала популяции нейтрофилов и создает угрозу нейтрофил-зависимой деструкции легочной ткани.
Предварительное введение глюкокортикоидов в высоких дозах приводит к снижению резистентности организма к вирусу гриппа, о чем свидетельствует увеличение летальности мышей, обусловленное усугублением нейтрофил-зависимых повреждений легких после заражения вирусом гриппа, а не повышенной восприимчивостью клеток-мишеней к вирусу гриппа. С помощью стимуляторов функциональной активности макрофагов возможна коррекция пониженной резистентности организма к вирусу гриппа за счет уменьшения дисбаланса между популяциями альвеолярных макрофагов и нейтрофилов.
Повышение или понижение резистентности организма к вирусу гриппа после применения иммуномодуляторов в разных дозах и в разные сроки до момента инфицирования детерминировано соотношением функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов. При этом для пониженной резистентности к вирусу гриппа характерно доминирование стимуляции функциональной активности популяции нейтрофилов, тогда как повышенная резистентность к вирусу гриппа достигается при преимущественном увеличении биоцидного и фагоцитарного потенциала популяции альвеолярных макрофагов.
Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены на 35 отечественных и международных конференциях: All Union Symposium with the participation foreign scientists, 1990, Novosibirsk, Russia; Constituent Congress Int. Soc. Pathol., 1991, Moscow, Russia; Международный симпозиум «Патогенез хронического воспаления», 1991, Новосибирск, Россия; Joint Meeting Soc. Leuk. Biol. «The phagocyte molecular and clinic aspects», 1996, Verona, Itali; XIII Российская научная конференция «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», 1997, Челябинск, Россия; XXX Всеросс. Научно-практическая конференция «Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии», 1997, Санкт-Петербург, Россия; 7 Научно-практическая конференция врачей «Актуальные вопросы современной медицины», 1997, Новосибирск, Россия; Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера», 1998, Новосибирск, Россия; Вторая научная конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс», 1998, Саратов, Россия; 18th Annual AAAR' 99 Conference, 1999, Tacoma, Washington, USA; 1999 European Aerosol conference, Praque, Czech republic; Advanced research workshop «Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium», 1999, Novosibirsk, Russia; VI Рабочая группа «Аэрозоли Сибири», 1999, Томск, Россия; International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors, 2000, Smolenice, Slovakia; 19th Annual AAAR Conference, 2000, Adam's Mark Hotel, St. Louis, Missouri, USA; XIV Российская научная конференция «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», 2000, Челябинск, Россия; II Всероссийский симпозиум «Хроническое воспаление», посвященный памяти засл. Деятеля науки РФ, проф. Д.Н. Маянского «Фундаментальные и клинические аспекты хронического воспаления», 2000, Новосибирск, Россия; 3-rd International Conference on Emerging Zoonoses, 2001, Noordwijkerhout, Holland; 2-я научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2002, Новосибирск, Россия; Х Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине экологии», 2002, Ялта-Гурзуф, Крым, Украина; Всероссийская конференция «Компенсаторно-приспособительные процессы: Фундаментальные и клинические аспекты», 2002, Новосибирск, Россия; Biological Medical Conference «Prophylaxis and treatment of BW health disorders», 2003, Munich, Germany; Biological Medical Defense Conference, 2004, Munich, Germany; Всероссийской конференции «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», 2004, Новосибирск, Россия; V Сибирский физиологический съезд, 2005, Томск, Россия; 2-я Международная конференция «Наука-Бизнес-Образование Биотехнология- Биомедицина-Окружающая среда», 2005, Пущино, Россия; 2-я Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2005, Москва, Россия; XIII International Congress of Virology, 2005, San Francisco, California, USA; Biological Medical Defense Conference, 2005, Munich, Germany; Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 2006, Ульяновск, Россия; III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2006, Новосибирск, Россия; 3-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2007, Новосибирск, Россия; Международная научно-практическая конференция «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития», 2008, Алматы, Казахстан; 4-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2009, Новосибирск, Россия; 5-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно- приспособительных процессов», 2011, Новосибирск, Россия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 научных статьи, из них 30 - в отечественных журналах из списка ВАК и 4 - в зарубежных изданиях, а также 48 тезисов в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях. По результатам диссертации получено 2 патента Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 36 рисунков и 61 таблицу. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 110 отечественных и 490 зарубежных источников.
![Комплексное обследование больных ВИЧ-инфекцией с использованием современных методов лучевой диагностики [Электронный ресурс]](/i/i/4427/203696.png "Комплексное обследование больных ВИЧ-инфекцией с использованием современных методов лучевой диагностики [Электронный ресурс] Бурова Надежда Владимировна")
