Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
Особенности воспалительного процесса при инфаркте миокарда 14
Особенности воспалительного процесса при гипертонической болезни 15
Нейтрофильные гранулоциты и их функции 17
Активация нейтрофилов человека 20
Праймирование и его механизмы 21
Роль праймирования в патогенезе различных заболеваний 22
Ответы, вызываемые при праймировании ....24
Потенциальные механизмы праймирования 25
Депраймирование фагоцитов 30
Биологическая роль активных форм кислорода (АФК) 30
Образование активных форм кислорода 31
Повреждающее действие активных форм кислорода на клетки 33
Антиоксидантная защита клетки 34
Активные формы кислорода, как вторичные мессенджеры 35
НАДФН-оксидазный комплекс 37
Компоненты НАДФН-оксидазного комплекса 39
Механизмы активации НАДФН-оксидазного комплекса 40
Регуляция активности НАДФН-оксидазного комплекса 41
НАДФН-оксидаза нефагоцитирующих клеток 43
Хемилюминесцснция (ХЛ) и ее усилители 44
Методы усиления хемилюминесценции химических реакций 44
Цикл аутоокисления люцигенина 46
Проверка гипотезы окислительно-восстановительного цикла люцигенина 48
Механизм действия формилпептида (fMLP) 50
Адренокортикотропный гормон, его производные, и аналог АКТГ4.ю-51
Механизм действия лекарственного препарата предуктал 54
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ 56
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57
Объект исследования 57
Реактивы 57
Оборудование 58
Выделение клеток 59
Разделение эритроцитов и плазмы, обогащенной клетками белой крови. ..59 Применение одноступенчатого градиента плотности для разделения
мононуклеарных клеток и нейтрофилов 59
Удаление эритроцитов из суспензии гранулоцитов 60
Оценка жизнеспособности выделенных клеток 60
Определение количества клеток в суспензии 61
Детектирование ХЛ суспензии клеток 61
Хемилюминометр 61
Измерение ХЛ цельной крови и суспензии клеток 61
Измерение концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме
нейтрофилов 62
Обсчет результатов 63
РЕЗУЛЬТАТЫ 65
Концентрационная зависимость хемилюминесценции люцигенина 65
Изучение функционального состояния фагоцитов крови при остром
инфаркте миокарда (ОИМ) 66
Выявление различий в функциональной активности фагоцитов крови
здоровых людей и больных острым инфарктом миокарда 66
Динамика образования радикалов кислорода у больных острым
инфарктом миокарда 69
Изучение изменения функционального состояния фагоцитов крови под
влиянием различных лекарственных и химических агентов 78
Влияние формил пептида (fMLP) на функциональную активность
нейтрофилов человека 78
Влияние аналога АСТПно и его производных на функциональную
активность нейтрофилов человека 80
Особенности влияния пептида Pro-Gly-Pro на функциональную активность
фагоцитов крови 94
Влияние лекарственного препарата предуктал на функциональную
активность фагоцитов крови человека 98
Роль внеклеточного кальция в дыхательном взрыве, вызываемом
различными агентами 105
Различия в функциональном состоянии фагоцитов крови больных
острым инфарктом миокарда и эссенция ль ной гипертонией 106
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 109
Использование метода хемилюминесцентного анализа образования свободных радикалов кислорода для выявления функционального
состояния фагоцитов крови 109
Различия в функциональном состоянии фагоцитов крови здоровых людей и
больных острым инфарктом миокарда 110
Действие аналога АКТГ4.10 на функциональную активность фагоцитов
крови 111
Влияние кальция на дыхательный взрыв фагоцитов крови 113
Действие предуктала на функциональную активность фагоцитов крови.. 114 Различия в функциональном состоянии фагоцитов крови больных острым
инфарктом миокарда и эссенциальной гипертонией 116
Динамика образования радикалов кислорода при остром инфаркте
миокарда 117
ВЫВОДЫ 120
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТГ - адренокортикотропный гормон;
АГ — артериальная гипертензия;
АД — артериальное давление;
АФК — активные формы кислорода;
ИМ - инфаркт миокарда;
Лаг фаза - лаг фаза кривой ответа на РМА до предуктала;
Лаг фазаР - лаг фаза кривой ответа на РМА после предуктала;
ЛЗХЛ - люцигенин-зависимая хемилюминесценция;
ОИМ - острый инфаркт миокарда;
Пептид 3 - Pro-Gly-Pro;
Пептид4 - Phe-Pro-Gly-Pro;
Пептид5 - His-Phe-Pro-Gly-Pro;
Пептидб - Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro;
СОД - супероксид дисмутаза;
ХЛ - хемилюминесценция;
ФЭУ — фотоэлектронный умножитель;
ЭГТА - этиленгликоль-бис(р-аминоэтиловый эфир)-М,М,М,М'-тетрауксусной
кислоты; АА - арахидоновая кислота;
[Са ]j - внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция; CSF - колония - стимулирующий фактор; DAG - диацил глицерин;
ERK - киназы, регулируемые внеклеточными сигналами; fMLP - формил пептид, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; GM-CSF — гранул оцит-макрофаг колония стимулирующий фактор; Imax - амплитуда ответа на РМА до предуктала; ImaxP - амплитуда ответа на РМА после предуктала;
ІРз — фосфатидилинозитол 3,4,5-трисфосфат;
JNK- c-Jun амино-терминальные киназы;
LPS - липополисахарид;
LTB4 - лейкотриен B4;
Luc — люцигенин;
Luc*4" — катион радикал люцигенина;
МАРК - митоген активируемые протеинкиназы;
МЕК-1 и МЕК-2 - MAP/ERK киназы;
МЕКК-1 - MAP/ERK киназа киназы-1;
NOS - синтетаза оксида азота;
PAF - фактор активации тромбоцитов;
PDGF - фактор роста тромбоцитов;
Р1Р2 - фосфатидилинозитол 4,5-бис-фосфат;
PLC - фосфолипаза С;
PLD - фосфолипазы D;
РЬАг - фосфолипаза А2;
PI3K - фосфоинозитид 3-гидрокси киназа;
РКА - протеинкиназы А;
РКС - протеинкиназа С;
РМА - форболовый эфир, форбол-12-миристат-13-ацетат;
Tga - тангенс угла наклона кривой ответа на РМА до предуктала;
TgaP — тангенс угла наклона кривой ответа на РМА после предуктала;
Ттах - время достижения максимума ответа на РМА до предуктала;
ТтахР - время достижения максимума ответа на РМА после предуктала;
TNF-a - a-фактор некроза опухоли;
S - площадь под кривой ответа на РМА до предуктала (за 400 сек);
SE - стандартная ошибка;
SP - площадь под кривой ответа на РМА после предуктала (за 400 сек);
а- и P-MSH — а- и Р" меланоцитстимулирующие гормоны.
Введение к работе
Сердечно-сосудистые заболевания и особенно инфаркт миокарда занимают первое место по смертности в экономически развитых странах [10]. Заболевания системы кровообращения не только основная причина преждевременной смерти, но и инвалидизации трудоспособного населения [13]. В этих условиях чрезвычайно важной остается проблема разработки новых способов оценки состояния клеток крови, участвующих в воспалительных реакциях. Такие подходы позволили бы объективно оценивать активность фагоцитов крови, участвующих в воспалительных реакциях, протекающих при сердечно-сосудистых заболеваниях. Подобная информация имеет важное значение для выяснения патофизиологической роли фагоцитов крови в развитии нарушений функциональной активности и структурных изменений клеток сердечно-сосудистой системы.. Кроме того, в изучении патофизиологии сердечно-сосудистой системы, особенно актуальным становится поиск методов индивидуализации лечения: новых маркеров прогнозирования исхода и течения болезней, влияния лекарственных препаратов на клетки крови конкретного больного.
В развитии воспалительного процесса, сопровождающего инфаркт миокарда [5, 23, 108, 134] и эссенциальную гипертонию [38, 135, 148, 177] важную роль играют фагоциты крови [47, 86, 113, 171]. Среди фагоцитов крови преобладают нейтрофилы. В основе проявления функциональной активности фагоцитов лежит активация, которая сопровождается адгезией клеток, их миграцией, секрецией ферментов и дыхательным взрывом, то есть образованием активных форм кислорода (АФК) [21]. Активация фагоцитов может вызываться различными стимулами, в том числе бактериальной природы, цитокинами, активированными компонентами комплемента, их фрагментами, экзогенными химическими веществами, а также адгезией к различным поверхностям [13]. Эти агенты изменяют
функциональное состояние фагоцитов крови, и привлекают их в зону воспаления [167, 178].
Величина ответа на активирующий агент зависит от исходного
состояния нейтрофилов. Нейтрофилы в организме могут находиться в 3-х
функциональных состояниях: покоящемся, праймированном
(предактивированном) и активированном [165]. При праймировании происходит изменение функционального статуса нейтрофила праймирующим агентом, который вызывает изменения в метаболизме нейтрофила, приводящие к выраженному потенцированию ответа на последующее действие активирующего агента. К праймирующим веществам относятся агенты различной природы, в том числе образующиеся при гибели клеток. [56]. Следует отметить, что праймирующие агенты сами по себе могут не вызывать конечного ответа, действуя в очень низких концентрациях. При праймировании, в нейтрофила, образование АФК способно увеличиваться в несколько десятков раз [56].
Известно, что большое количество заболеваний связано с АФК [6, 36, 52, 56, 86, 136, 157, 159]. Несмотря на то, что с дыхательным взрывом связан бактерицидный механизм действия, образование чрезмерных количеств АФК вызывает повреждение собственных тканей, и может приводить к воспалению [42, 48, 68, 147]. В последние десятилетия была доказана важная роль АФК в возникновении и развитии сердечнососудистых патологий [36, 52, 86, 159]. Так, например, при инфаркте миокарда, в результате реперфузии, происходит опосредуемое нейтрофилами повреждение кардиомиоцитов [36, 86]. Вероятно, что немаловажную роль при этом играет праймирование [48, 68, 144].
Оценить активность фагоцитов в пораженных областях сердца и сосудов практически невозможно. Однако, для того, чтобы выполнить свою функцию в месте воспаления фагоциты должны быть предварительно праймированы. Праймирование происходит в крови. Следовательно, выявляя
функциональное состояние фагоцитов крови мы можем судить об активности клеток в месте поражения.
Праймирование представляет собой один из важнейших процессов регулирования функциональных ответов фагоцитов, in vitro и in vivo, и может иметь важное значение в регуляции ответов фагоцитов в местах воспаления. Однако механизмы праймирования остаются до сих пор мало изученными. В связи с этим, изучение функционального состояния фагоцитов крови при различных сердечно-сосудистых заболеваниях (в том числе связанных с повреждениями, вызываемыми активными формами кислорода), а также механизмов праймирования, представляется важной задачей, имеющей большое практическое значение.
Цель исследования
Изучить патофизиологическую значимость феномена праймирования фагоцитов периферической крови при остром инфаркте миокарда и эссенциальной гипертонии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Оценить роль функционального состояния фагоцитов крови как индикатора развития воспалительного процесса при остром инфаркте миокарда и эссенциальной гипертонии.
Оценить патогенетическое значение исходного состояния фагоцитов крови в их последующих функциональных ответах у больных острым инфарктом миокарда и эссенциальной гипертонией.
Изучить возможность праймирования и депраймирования фагоцитов крови под влиянием различных химических агентов и лекарственных препаратов.
Изучить кинетику активации фагоцитов крови во время развития острого инфаркта миокарда.
5. Подобрать метод оценки функционального состояния фагоцитов крови, адекватный поставленным цели и задачам. Адаптировать этот метод для применения в клинической практике.
Научная новизна
Установлено существование патофизиологической связи между функциональным состоянием фагоцитов крови и воспалительными процессами, протекающими при остром инфаркте миокарда (ОИМ) и эссенциальной гипертонии (ЭГ).
Подобраны молекулярные зонды, действующие по разным механизмам, которые позволяют выявлять, и модулировать, праймирование, возникающее в результате воспалительных процессов при остром инфаркте миокарда и эссенциальной гипертонии. В качестве таких веществ были предложены: аналог АКТГ4-ю (семакс) и его производные, формилпептид (fMLP), форболовый эфир (РМА), вызывающие активацию исходно праймированных фагоцитов крови.
Впервые показано, что аналог АКТГ4-10 и его производные вызывают образование супероксида в суспензии нейтрофилов человека и образцах цельной крови, а также обладают праймирующими свойствами.
Выявлена способность препарата предуктал изменять функциональное состояние фагоцитов крови при остром инфаркте миокарда. Показано, что степень влияния данного препарата зависит от исходного состояния фагоцитов крови.
При определении активности фагоцитов крови были выявлены индивидуальные различия в динамике развития воспалительного процесса у больных острым инфарктом миокарда, что позволило разбить больных на несколько групп.
Практическая значимость работы
Выявленная тесная патогенетическая связь между функциональным состоянием фагоцитов крови и воспалительными процессами,
протекающими при остром инфаркте миокарда и эссенциальноЙ гипертонии имеет важное значение с точки зрения диагностики и прогноза данных сердечно-сосудистых заболеваний.
Полученные данные о влиянии лекарственного препарата предуктал на фагоциты крови позволяют индивидуализировать курс лечения.
Лекарственные препараты предуктал и семакс (аналог АКТГ4-10) могут быть использованы для изменения исходного состояния фагоцитов крови при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Предложено использовать метод определения активности фагоцитов крови для косвенной оценки воспалительного процесса у больных острым инфарктом миокарда.
Выявленные индивидуальные различия в динамике развития воспалительного процесса у больных острым инфарктом миокарда позволяют выявлять группы риска.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.
Апробация работы
По теме диссертации сделано 14 научных докладов на Российских и международных симпозиумах по патофизиологии и биофизике.
Материалы диссертации были представлены на Третьем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международной научной конференции в рамках года России в Украине «Гомеостаз: физиология, патофизиология, фармакология и клиника» (Одесса, 2003), X национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2003), Научно-практической конференции
«Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (Москва, 2003), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), International symposium «Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values» (Санкт-Петербург, 2002), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), VIII российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), 5-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пушино, 2001), II российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001).
Диссертация апробирована на совместном заседании лаборатории экстремальных состояний НИЦ, лаборатории функциональных методов диагностики и рациональной фармакотерапии НИЦ ММ А им. И.М. Сеченова и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова.
Часть работы выполнена при финансовой поддержке РФФИ, гранты № 01-04-49169-а (исполнитель); № 02-04-06230-мас (руководитель); № 03-04-06108-мас (руководитель).
