Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс] Петухова Галина Дмитриевна

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1. Морфология МАЛТ верхнего дыхательного тракта 11

2. Локальный гуморальный иммунный ответ к вирусам гриппа в МАЛТ верхнего отдела респираторного тракта 16

3. Характеристика и механизм продукции секреторных антител 17

4. Роль секреторных lgA-антител в защите от гриппа 19

5. Продукция SIgA-антител при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации 20

6. Данные обследования людей 22

1.3 Локальный клеточный иммунный ответ к вирусам гриппа в МАЛТ верхнего
отдела респираторного тракта 25

7. Экспериментальные данные 25

8. Данные обследования людей 3 0

1.4 Вирус гриппа и апоптоз 31

9. Молекулярные механизмы апоптоза, индуцированного вирусом гриппа 32

10. Индукция вирусом гриппа апоптоза неиммунных клеток, способных поддерживать его репликацию 40

11. Индукция вирусом гриппа апоптоза клеток иммунной системы 43

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46

12. Животные 46

13. Модель экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации 46

14. Вакцинируемые контингента и вакцина 47

15. Сыворотки крови мышей 50

16. Смывы нижних и верхних дыхательных путей мышей 50

17. Выделение лимфоцитов НАЛТ мышей 51

18. Выделение лимфоцитов селезенки мышей 52

19. Сыворотки крови и секреты верхних дыхательных путей людей 52

20. Мононуклеары периферической крови людей 52

10. Антигемагглютинирующие сывороточные антитела 52

11. Антитела секретов дыхательных путей и сыворотки крови мышей 53

12. Авидность секреторных IgA-антител людей 54

13. Пролиферативная активность лимфоцитов 55

14. Распределение лимфоцитов по мембранным маркерам 56

15. Количественное определение цитокинов 56

16. Апоптоз лимфоцитов НАЛТ и селезенки мышей и МНПК волонтеров 57

17. Статистические методы 58

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 59

3.1 Локальный и системный гуморальный иммунный ответ при гриппозной
инфекции и вакцинации 59

1. Динамика продукции сывороточных антител у мышей 59

2. Локальный гуморальный иммунный ответ у мышей в верхних и нижних отделах дыхательного тракта

3. Авидность локальных IgA-антител у иммунизированных ЖГВ людей 62

3.2 Локальный и системный клеточный иммунный ответ при гриппозной
инфекции и вакцинации 67

4. Динамика пролиферативной активности общего пула лимфоцитов НАЛТ и селезенки 67

5. Поствакцинальные и постинфекционные изменения уровней различных субпопуляций лимфоцитов НАЛТ и селезенки 69

6. Продукция ТМ/Тп2-цитокинов в НАЛТ и селезенке 72

7. Уровни CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов в периферической крови волонтеров до

и после вакцинации ЖГВ 79

3.3 Апоптоз и пролиферация лимфоцитов при гриппозной инфекции и
вакцинации 85

8. Апоптоз и пролиферация лимфоцитов НАЛТ 87

9. Апоптоз и пролиферация стеноцитов 91

10. Апоптоз МНПК людей, иммунизированн ых ЖГВ 95

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 100
ВЫВОДЫ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112

Введение к работе

Актуальность проблемы. Грипп, наряду с ВИЧ-инфекцией и вирусными гепатитами, остается одной из центральных проблем вирусологии. Особое место в защите от гриппа занимает местный (локальный, мукозальный) иммунитет, формирующийся во входных воротах инфекции, то есть в слизистой оболочке верхнего отдела дыхательного тракта. В вирусологической иммунологии изучению локального иммунитета отводится ведущее значение [59, 131,164].

У людей первым и наиболее действенным барьером на пути проникновения в организм возбудителей респираторных инфекций, в том числе и вируса гриппа, является мукозоассоциированная лимфоидная ткань (МАЛТ) лимфоглоточного кольца Пирогова-Вальдейера [98, 161]. Поэтому изучение локального противогриппозного иммунитета сводится, в основном, к получению информации о механизмах развития постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа в этом участке слизистой оболочки. Однако у людей прямое изучение роли МАЛТ в формировании локального иммунитета сопряжено с большими трудностями, поскольку это возможно только путем иммунологических исследований эктомированных или биопсинизированных участков слизистой оболочки органов лимфоглоточного кольца Пирогова-Вальдейера у больных гриппом или вакцинированных лиц. Подобная ситуация резко тормозила получение исчерпывающих знаний о клеточном локальном иммунитете к возбудителям гриппа и других респираторных инфекций.

Прорывом в данной области послужило открытие [95, 98], а затем и создание метода выделения [37, 39] у лабораторных животных (мыши, крысы, хомяки) так называемой «назоассоциированной лимфоидной ткани» (НАЛТ) - функционального аналога кольца Пирогова-Вальдейера у людей [95]. Считается, что знания об иммунном ответе в НАЛТ дают представление об иммунных процессах в эквивалентной человеческой лимфоидной ткани [95,161]. Все это в совокупности позволило использовать данную методику в наших исследованиях локального противогриппозного иммунитета.

В настоящее время огромное внимание в мире уделяется способности противогриппозных вакцин стимулировать именно локальный иммунитет верхних дыхательных путей [164]. В мировой практике для профилактики гриппа применяются два типа вакцинных препаратов: интраназальные живые аттенуированные реассортантные гриппозные вакцины (ЖГВ) и парентеральные инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ).

Доказано, что парентеральное (традиционное) введение ИГВ практически не стимулирует локальный противогриппозный иммунитет [13, 51, 52]. Поэтому в последние годы предпринята попытка создания ИГВ для интраназальной инокуляции совместно с мукозальными адъювантами. Однако такие вакцины пока не нашли широкого практического применения из-за наличия побочных эффектов, в том числе аллергизирующих свойств [161].

Альтернативой ИГВ является ЖГВ. Она значительно опережает инактивированные гриппозные вакцины по широте спектра индуцируемых факторов противовирусного иммунитета, в том числе и локальной природы [13,15,16,17].

Эталоном иммуногенности любых вакцин служит иммунный ответ, возникающий при естественной инфекции [10]. Поэтому важно установить, в какой степени метод получения вакцинных штаммов влияет на индукцию разных параметров иммунной защиты по отношению к вирулентному циркулирующему вирусу, из которого они приготовлены. Способ создания вакцинных штаммов для ЖГВ основан на генетической реассортации между вирулентным циркулирующим вирусом и холодоадаптированным донором аттенуации [1]. В результате такой реассортации вакцинные штаммы приобретают два гена поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы) от первого штамма и все гены внутренних белков (шесть) от второго. Как следствие, вакцинный штамм становится аттенуированным, то есть неспособным вызывать клинически выраженную инфекцию. Однако чрезмерная аттенуация вирусов гриппа может приводить к снижению их иммуногенности. Поэтому важно знать, насколько оптимально соблюден

баланс между этими двумя признаками. Проверить этот баланс можно путем сопоставления иммуногенной активности вакцинного штамма и его вирулентного родительского вируса. К сожалению, проведение такого исследования доступно только в эксперименте из-за невозможности заражения людей «диким» вирулентным вирусом. Подобные экспериментальные работы по сравнению параметров поствакцинального иммунного ответа на ЖГВ и постинфекционного иммунного ответа ранее не проводились.

Недавно в опытах in vitro показано, что вирус гриппа является индуктором апоптоза лимфоцитов [128]. В этой связи изучение вирусиндуцированного апоптоза клеток лимфоидного ряда становится актуальным с точки зрения оценки последствий как гриппозной инфекции, так и массовой вакцинации гриппозными вакцинами. Однако исследований этого вопроса in vivo до настоящего времени не осуществлялось.

Цель исследования: изучить формирование локального и системного иммунного ответа на патогенный и аттенуированные вирусы гриппа А

Задачи исследования:

1. В эксперименте in vivo сравнить локальный иммунный ответ в НАЛТ мышей на аттенуированный реассортантный вирус гриппа и его генетические родители (патогенный вирус и холодоадаптированный донор аттенуации) по следующим параметрам: выработка вирусспецифических секреторных антител, динамика пролиферативной активности общего пула лимфоцитов, накопление CD4⁺, CD8⁺ и CD19⁺-лимфоцитов и продукция ТЫ- и Th2- цитокинов.

2. Сопоставить эти данные с результатами тестирования системного иммунного ответа в селезенке мышей по тем же параметрам.

3. Изучить апоптоз лимфоцитов при гриппозной инфекции и вакцинации.

4. Оценить у людей способность ЖГВ: (і) стимулировать накопление CD4⁺-и CD8⁺- лимфоцитов в периферической крови; (ii) повышать авидность локальных IgA-антител.

Научная новизна работы.

5. Впервые проведено сравнительное исследование формирования локального иммунитета в НАЛТ мышей при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации мышей аттенуированным реассортантным вирусом гриппа А - экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ. Показано, что аттенуированный реассортант не уступает патогенному родительскому штамму A/PR/8/34 (H1N1) в активности индукции изученных факторов иммунитета.

6. Впервые исследован апоптоз лимфоцитов НАЛТ и селезенки мышей в процессе развития иммунного ответа при гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным вирусом. Установлено, что в обоих случаях не возникает опасности индукции апоптотического дисбаланса иммунной системы.

7. Впервые проведена оценка ЖГВ по способности: (і) стимулировать накопление CD4⁺- и CD8⁺- лимфоцитов в периферической крови; (ii) изменять авидность локальных антител. Отмечено, что в первом случае ЖГВ повышает уровень CD4⁺ и CD8⁺ в периферической крови лишь незначительно, во втором - активно увеличивает показатели авидности секреторных IgA-антител.

Практическая значимость работы.

8. В экспериментальных исследованиях на мышах оценен способ приготовления вакцинных штаммов для ЖГВ с позиции сохранения способности аттенуированного реассортантного вакцинного штамма индуцировать полноценный локальный иммунный ответ во входных воротах инфекции.

9. Обоснована иммунологическая безвредность ЖГВ с точки зрения опасности возникновения апоптотического дисбаланса иммунной системы.

10. Апробирован способ оценки иммуногенности ЖГВ у людей по авидности локальных IgA-антител.

4. В эксперименте на мышах дана оценка иммуногенности человеческого вируса А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) как кандидата в вакцинные штаммы для ЖГВ в случае угрозы возвращения в эпидемическую циркуляцию вируса гриппа серотипа A (H2N2). Основные положения, выносимые на защиту.

11. Иммунизация мышей аттенуированным реассортантным вирусом гриппа (экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ) не уступает гриппозной инфекции в активности индукции изученных параметров локального иммунитета верхних дыхательных путей (продукция вирусспецифических секреторных антител, пролиферативная активность общего пула лимфоцитов, накопление в НАЛТ CD4⁺-, CD8⁺- и CD19⁺-лимфоцитов и локальная секреция цитокинов).

12. Повторная неосложненная гриппозная инфекция и повторная вакцинация аттенуированным реассортантом не вызывают усиление апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки. При первичном поствакцинальном и постинфекционном иммунном ответе апоптоз лимфоцитов этих органов увеличивается только на раннем этапе репродукции вирусов и продолжается не более суток. Далее показатели апоптоза возвращаются к норме.

13. У людей иммунизация ЖГВ существенно повышает авидность секреторных вирусспецифических IgA-антител. Поэтому данный маркер может рассматриваться в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинации в отношении индукции локального иммунного ответа.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VIII всероссийском форуме с международным участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в. Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004); на I международной конференции "Influenza Vaccines for the World " (Лисабон, 2004); на II всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004); на IX научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005) - доклад занял II

место на конкурсе молодых ученых; на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) - доклад занял I место на конкурсе молодых ученых; на международной конференции молодых учёных Одесского государственного медицинского университета "Вчені майбутнього" (Одесса, 2006).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи ГУ НИИЭМ РАМН 5 марта 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах текста, включающего 21 таблицу и 12 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 191 источник, в том числе 33 отечественных и 158 иностранных.

Похожие диссертации на Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс]

Анализ иммунных реакций на вирус гриппа у мышей с врожденной гриппозной инфекциейКобец, Наталья Викторовна

Гуморальный иммунный ответ к некоторым респираторным вирусам, вирусам семейства Herpesviridae и аутоиммунитет у больных бронхиальной астмойШтерншис Юлия Аркадьевна

Клинико-функциональный статус и иммунный ответ к вирусу гриппа у вакцинированных больных бронхиальной астмой и ХОБЛЧебыкина, Анна Владимировна

Конструирование рекомбинантных аденовирусов и изучение их протективных свойств при иммунизации лабораторных животных против вируса гриппа AСедова, Елена Сергеевна

Иммуногенные и протективные свойства препаратов рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены консервативных антигенов вируса гриппа аЕсмагамбетов Ильяс Булатович

Эпидемиологический мониторинг за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птицШипулин Герман Александрович

Современные особенности эпидемиологии арбовирусных инфекций, экологии арбовирусов и вирусов гриппа в природных биоценозах юга Восточной СибириГорин, Олег Захарович

Роль альвеолоцитов, макрофагов и эндотелиоцитов сосудов в патогенезе поражения легких мышей линии С57Bl/6 после инфицирования вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05Ковнер, Анна Владимировна

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ СИНДРОМА ПОЛИОРГАННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И ПРОГНОЗ ПРИ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГРИППА А (H1N1/09)Вейн, Вера Игоревна

Поражение сердца вирусами гриппа и КоксакиКопелев, Михаил Федорович