Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп - высококонтагиозное заболевание людей, птиц и млекопитающих вирусной этиологии. В мире каждый год регистрируются сезонные подъемы заболеваемости (вспышки, эпидемии) гриппом, вызванные вирусами типа А или В, сопровождающиеся существенным повышением заболеваемости и высокими уровнями смертности (WHO/CDS/EPR/GIP/2006.2a).
Иммунизация современными гриппозными вакцинами является научно-обоснованным эффективным способом массовой профилактики гриппа. Современные вакцины против гриппа А вызывают образование, главным образом, штамм-специфичных антител к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа: гемагглютинину и нейраминидазе. Однако, вирусы гриппа А способны постоянно модифицировать свою структуру в результате генетических изменений. Антигенные вариации являются результатом молекулярных изменений в поверхностных гликопротеинах. Подобная генетическая вариабельность способствует изменению антигенной структуры настолько существенно, что специфический иммунитет, выработанный на полученную прививку, может быть не эффективен (Webster R.G., 1992).
При разработке новых типов вакцин против гриппа необходимо обеспечить защиту населения от эпидемиологически актуальных циркулирующих штаммов вируса гриппа А. Кроме того на сегодняшний момент большие опасения вызывают вирусы гриппа птиц, случаи заражения которыми фиксируются у людей с 1997 г. Потенциальным кандидатом на следующий пандемичный штамм является вирус гриппа птиц субтипа H5N1. Так по данным ВОЗ с 1997 г. общее количество случаев заболеваний человека этим вирусом составляет 505, из которых 300 - с летальным исходом (данные ВОЗ от 31.08.10). Вирусы гриппа птиц не способны передаваться от человека к человеку, а заболевания людей вызваны контактом с больными птицами. Однако, вирус гриппа птиц может приобрести новые свойства, что может провести к подъему заболеваемости, вызванной вирусом гриппа субтипа H5N1. Поэтому актуальным является разработка вакцины, способной защитить население от вируса гриппа птиц H5N1 для предотвращения подъемов заболеваемости, причиной возникновения которых может стать этот вирус.
Большинство современных вакцин против гриппа вводят в организм парентерально. Как альтернатива инъекционным вакцинам, рассматриваются мукозальные вакцины. Преимуществами мукозальных вакцин являются удобство их применения, исключение риска случайного заражения в процессе иммунизации, формирование иммунного ответа именно там, где находятся «входные ворота» гриппозной инфекции и формирование ответа более широкого спектра по сравнению с парентеральными вакцинами (Wong J.P.,2010).
Итак, для эффективной защиты против гриппозных инфекций необходимо создание интраназальных вакцин, которые способны одновременно защищать от различных штаммов вируса гриппа и обеспечивать напряженный и продолжительный иммунитет, устранив, таким образом, необходимость ежегодных ревакцинаций населения.
Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеописанных проблем является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах (Zaia J.A., 2007). При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены соответствующих патогенов распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа (Карпов А.П., 2007, Knoblich H.V.,2000). На сегодняшний момент наиболее хорошо изученным и часто используемым для генетической вакцинации является рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа (Ад5). Вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбинантные аденовирусы являются решшкативно-дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусов человека пятого серотипа с делегированными Е1 и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе (Hoelscher М.А., 2006, Van Kampen K.R., 2005). Во-вторых, рекомбинантные аденовирусы позволяют проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцируют образование иммунного ответа на слизистой дыхательных путей. В-третьих, на сегодняшний момент разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализацию масштабного производства различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой для создания широкого спектра вакцин против различных патогенов.
В связи с вышесказанным, изучение возможности использования Ад5 для создания препаратов для интраназальной вакцинации против потенциально опасных инфекций, вызванных вирусом гриппа птиц, представляет самостоятельный научный интерес.
Цель исследования. Создание рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц, и изучение их иммуногенности и протективных свойств при интраназальной иммунизации лабораторных животных.
В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:
-
Конструирование репликативно-деффектных рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, содержащих гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц (гемагглютинин и эктодомен М2-белка) и изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов в условиях in vitro.
-
Оценка гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса гриппа птиц у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.
-
Исследование протективных свойств рекомбинантного аденовируса, несущего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц на модели летальной инфекции вируса гриппа.
-
Изучение перекрестного иммунного ответа против разных подтипов вируса гриппа птиц при генетической иммунизации лабораторных животных рекомбинантными аденовирусом, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.
-
Изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин на основе различных антигенов вируса гриппа с помощью оценки протективных свойств генетической иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген эктодомена белка М2 вируса гриппа птиц, против различных субтипов вируса гриппа птиц.
-
Оценка влияния предсуществующего иммунного ответа против аденовируса человека пятого серотипа на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантными аденовирусами против вируса гриппа птиц.
Научная новизна. С помощью эффективной технологии получения рекомбинантных Ад5, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, был получен набор рекомбинантных аденовирусов, несущих поверхностные антигены вируса гриппа птиц: Ad5-HA5-2, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, Ad5-HA5-1, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 и Ad5-M4-Fl, несущий ген эктодомена белка М2 вируса гриппа птиц. При этом для конструирования аденовируса Ad5-HA5-2 впервые использовался ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, адаптированного для млекопитающих.
Для создания рекомбинантного Ад5, позволяющего при иммунизации против вируса гриппа птиц получить иммунный ответ широкого спектра действия, в качестве антигена был выбран эктодомен консервативного трансмембранного М2-белка (М2е) вируса гриппа. Для достижения наиболее широкого спектра защиты от различных субтипов вируса синтезирована искусственная нуклеотидная последовательность белка М2е, консенсусная
между различными штаммами вируса гриппа птиц. Для повышения иммуногенности эктодомена М2-белка вируса гриппа птиц в созданную конструкцию включен ген лиганда для Толл-подобного рецептора 5 флагеллин (F1). Впервые сконструирован рекомбинантный аденовирус Ad5-M4-F1, несущий генетическую конструкцию, экспрессирующую слитный (фъюжн) белок, состоящего из четьфех М2е белков и флагеллина.
Показана на культуре клеток активность рекомбинантного флагеллина, входящего в состав слитного белка, экспрессируемого аденовирусом Ad5-M4-F1, на линии клеток, несущих Толл-подобный рецептор 5.
Определен уровень экспрессии рекомбинантных гемагглютининов НА5-2 и НА5-1 в пермиссивных клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-HA5-2 и Ad5-HA5-1.
Показана индукция длительного как гуморального, так и клеточного иммунного ответа против вируса гриппа птиц H5N2 при интраназальной иммунизации лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом Ad5-НА5-2.
Показана защита мышей, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-2, экспрессирующим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, при заражении летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 (5ОЛД50) и продемонстрирована ее длительность в течение 24 недель.
Впервые показана индукция перекрестного гуморального иммунитета против вируса гриппа птиц H5N2 при иммунизации мышей рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1. Так же показана длительная (24 недели) перекрестная защита животных, иммунизированных аденовирусом Ad5-HA5-1, против летальной дозы вируса гриппа птиц H5N2 (50J%0).
Впервые продемонстрирована возможность использования
рекомбинантного Ад5, как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин с различными антигенами вируса гриппа А. Показана индукция перекрестного иммунного ответа, возникшего при иммунизации лабораторных мышей аденовирусом Ad5-M4-Fl, несущим ген консенсусного между вирусами гриппа птиц белка М2е, против вируса гриппа птиц H5N2 и вируса гриппа птиц H2N3 (ЗОЛДяї).
Впервые продемонстрировано незначительное влияние
предсуществующего иммунного ответа к Ад5 на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным Ад5 против вируса гриппа.
Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Полученные в результате работы рекомбинантные
аденовирусы могут служить основой для создания кандидатных вакцин против вируса гриппа птиц.
Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Оптимизация параметров наработки рекомбинантных аденовирусных векторов в полупрепаративных количествах», М.-2010, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, протокол №13 от 15.10.10.
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патенты Российской Федерации 2326942 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии» и 2326943 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1».
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» (Москва, 2009) и Международной конференции Koch Metschnikow Forum (Марбург, Германия, 2010). Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии и генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 12 октября 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 патента, 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК и 4 в сборниках международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (213 источников, из которых 13 отечественных и 200 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 28 рисунков.
![Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс]](/i/i/4286/206226.png "Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс] Петухова Галина Дмитриевна")
