Введение к работе
Актуальность темы.
Известно, что катионы меди и цинка оказывают существенное влияние на основные процессы иммунопоэза и иммуногенеза.
Медь обеспечивает нормальное развитие миелоидного и лимфоидного ростков кроветворения, реализацию механизмов противоинфекционной защиты, регулирует фагоцитарную активность нейтрофилов и пролиферацию Т-лимфоцитов, влияет на синтез антител, продукцию цитокинов, определяет активность тимуса [Hopkins R.G., Failla M.L., 1997, 1999; Percival S.S., 1995, 1998]. Участие металла в иммунных реакциях во многом связано с его способностью ослаблять активацию фактора транскрипции NF kappa В и генерацию свободных радикалов, обеcпечивать транспорт железа.
Цинк обусловливает биологическую активность тимулина, контролирует ранние стадии созревания Т-лимфоцитов, апоптоз, играет важную роль в обеспечении выработки и рецепции иммуноактивных цитокинов, непосредственно участвует в основных иммунных реакциях [Bao B. et al., 2003; Carpentieri U. et al., 1988; Flynn, 1984; Hopkins R.G., Failla M.L., 1997; Lukasewycz O.A. et al., 1985; Percival S.S., 1995, 1998; Rink L., Kirchner H., 2000; Rink L., Haase H., 2007; Ventura M.T. et al, 1986].
Процессы обмена катионами цинка или меди между биомакромолекулами в окружении лимфоцита имеют большое значение для регуляции функции клетки, так как в ходе такого обмена содержание металла в примембранном пространстве может изменяться. Одновременно, связывающие или донорствующие металл белки будут претерпевать конформационные преобразования, что может сказываться на реализации их эффекторных функций в отношении клеток иммунной системы.
Работами лаборатории межклеточных взаимодействий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи обнаружена способность катионов меди и цинка связываться с белками -глобулиновой фракции плазмы крови [Бабаева Е.Е. и др., 2006; Чекнёв С.Б. и др., 2006]. Установлено, что это связывание приводит к изменениям конформации белковой глобулы [Чекнёв С.Б. и др., 2005]. Получены первые указания на то, что преимущественным изменениям при этом подвергаются Fc фрагменты молекул антител [Чекнёв С.Б. и др., 2006, 2007]. В результате, меняется их взаимодействие с Fc рецепторами (FcR) на поверхности клеток, что приводит к изменению способности индуцировать выработку интерферона (ИФН). Эти изменения оказываются металлоспецифическими, а пул индуцируемого ИФН, по результатам биологического тестирования, характеризуется преимущественным содержанием ИФН- [Чекнёв С.Б. и др., 2008].
Поскольку выработка ИФН связана с индукцией каскада ассоциированных с ней иммуноактивных цитокинов, определяющих Th1/Th2 направленность иммунного ответа, изучение механизмов и оценка возможностей регуляции цитокинового каскада на уровне физиологических реакций, определяемых вектором транспорта и обмена катионов металлов в микроокружении лимфоцита, представляют не только теоретический, но и практический интерес.
С таких позиций эффекторные свойства белков -глобулиновой фракции плазмы крови, хелатирующих металлы из периглобулярного пространства, до сих пор не исследовались; закономерности выработки ИФН и ассоциированных цитокинов в условиях индукции -глобулинами, конформационно измененными связыванием катионов металлов, остаются не изученными.
Целью работы явилось: изучение конформационных преобразований белков -глобулиновой фракции плазмы крови при взаимодействии с катионами меди и цинка, получение образцов модифицированного металлом белка и оценка эффекторных функций трансформированных связыванием меди и цинка -глобулинов в индукции выработки основных иммуноактивных цитокинов.
Решались следующие задачи:
1. Изучить взаимодействие человеческого сывороточного -глобулина с катионами меди и цинка в растворе; оценить оптические эффекты связывания металлов с белками; определить параметры связывания.
2. Получить образцы человеческого сывороточного -глобулина, модифицированного связыванием катионов меди и цинка; оценить конформационное состояние белка.
3. Оценить антигенные характеристики металлокомплексов -глобулина в реакциях иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием низких концентраций образцов.
4. Оценить эффекторные свойства трансформированных металлами белков в отношении клеток периферической крови (КПК) человека, вырабатывающих ИФН-, ИФН-, интерлейкин-1 (ИЛ-1) и ИЛ-2.
Научная новизна исследования.
В работе впервые описаны конформационные преобразования человеческого сывороточного -глобулина, вызываемые связыванием катионов меди и цинка в умеренном молярном избытке металла по отношению к белку, оценены оптические эффекты взаимодействия -глобулина с катионами металлов в растворе, определены параметры связывания.
Получены оригинальные образцы человеческого сывороточного -глобулина, трансформированного связыванием катионов меди и цинка (в автореферате – БМКМ и БМКЦ). Оценено конформационное состояние полученных металлокомплексов.
В целях комплексного исследования конформационных преобразований и антигенных характеристик трансформированных связыванием катионов меди и цинка -глобулинов, в работе впервые использован метод ИФА на низких концентрациях образцов, позволяющий оценить динамику формирования монослоя белком, сорбирующимся на твердой фазе.
В клеточных системах обнаружено, что в пуле иммуноактивных цитокинов, вырабатываемых КПК человека в присутствии металлокомплексов -глобулина с цинком и медью, содержатся ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2. Катионы меди и цинка, связанные белками -глобулиновой фракции, определяют оппозитные свойства БМКМ и БМКЦ в индукции выработки КПК человека ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2.
В работе впервые описана выработка КПК человека, индуцированными в режимах, близких к физиологическим, ранних (24 час инкубации клеток) ИФН- и ИЛ-2.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Процессы комплексообразования с катионами металлов могут служить важным фактором, определяющим и поддерживающим конформацию белков -глобулиновой фракции плазмы крови.
2. В результате хелатирования катионов меди и цинка -глобулины претерпевают металлоспецифические конформационные преобразования, которые преимущественно затрагивают Fc регионы молекул антител.
3. Модификация катионами металлов приводит к изменению эффекторных функций антител, реализующихся в индукции выработки основных иммуноактивных цитокинов.
4. Трансформированные связыванием катионов меди и цинка -глобулины оппозитно регулируют активность клеток; при этом белковый комплекс с медью смещает иммуногенез в направлении Th1.
Теоретическая значимость работы определяется получением данных о возможной локализации сайтов связывания металла в молекулах белков -глобулиновой фракции, об изменениях конформации и антигенных характеристик молекул антител, происходящих в результате хелатирования -глобулинами катионов металлов, которое может осуществляться в ходе нормального, физиологического обмена металлом между биомакромолекулами плазмы крови.
С использованием оригинальной технологии постановки реакций ИФА в работе доказано первичное изменение при связывании металла структуры Fc регионов молекул антител, что формирует основу проявления новых эффекторных свойств белков -глобулиновой фракции, реализующихся через семейство FcR в отношении экспрессирующих FcR клеток иммунной системы.
Реализация новых эффекторных свойств -глобулинов, трансформированных связыванием катионов металлов, металлоспецифически меняет содержание в пуле иммуноактивных цитокинов, индуцированных в присутствии металлокомплексов -глобулина, ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2.
БМКМ и БМКЦ реципрокно регулируют выработку КПК человека ИФН-, ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-2.
В работе получены первые убедительные свидетельства возможности индукции в режимах, близких к физиологическим, выработки КПК человека ранних (24 час инкубации клеток) ИФН- и ИЛ-2.
Практическая значимость результатов состоит в экспериментальном подтверждении принципиальной возможности разработки алгоритмов для получения (путем модификации катионами металлов) иммуноглобулинов с заданными эффекторными функциями, реализующимися на базальных уровнях регуляции активности КПК человека и связанными с индукцией выработки в режимах, близких к физиологическим, цитокинов раннего ответа, значимых в последующей Th1/Th2 поляризации иммуногенеза.
В работе предложена и впервые применена для оценки конформационных преобразований Fc фрагментов молекул антител технология постановки реакций ИФА (прямой и «сэндвич» варианты) с использованием низких концентраций исследуемых образцов белка.
Внедрение полученных результатов.
По материалам исследования подготовлены методические рекомендации «Использование иммуноферментного анализа для оценки конформационных преобразований Fc фрагментов молекул антител». Утверждены на основании решения Совета по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России от 15 ноября 2011 г. (протокол №18).
Апробация работы.
Результаты исследования доложены на Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2009), VII конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009).
Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии и интерферонов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России 29 мая 2012 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура работы.
Диссертационная работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и таблицей, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (191 источник, из которых 62 отечественных и 129 иностранных).
