Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 13
1.1. Грипп птиц - общая эпидемиологическая характеристика 13
1.2. Структура и функция вириона 18
1.3. Факторы патогенности вирусов гриппа А 23
1.4. Факторы резистентности вирусов гриппа А к противовирусным препаратам 32
1.5. Эволюция вирусов гриппа А 33
1.6. Методы диагностики гриппа птиц 38
1.7. Методы типирования вирусов гриппа птиц 43
1.8. Заключение 48
Собственные исследования 51
2.1. Материалы и методы исследований 51
2.1.1. Разработка тест-систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа птиц методом ПЦР 51
2.1.1.1. Штаммы микроорганизмов,' использованные в работе 51
2.1.1.2. Биологический материал, использованный в работе 52
2.1.1.3. Проведение ПЦР-анализа 53
2.1.1.4. Клонирование РНК в фаг MS22 68
2.1.2. Проведение молекулярно-генетического анализа 75
2.1.2.1. Экстракция РНК 75
2.1.2.2. Проведение реакции обратной транскрипции 76
2.1.2.3. ПЦР-амплификация фрагментов кДНК сегментов вирусов гриппа А 77
2.1.2.4. Очистка фрагментов ПНР 79
2.1.2.5. Секвенирование ДНК 80
2.1.2.6. Проведение филогенетического анализа 80
2.2. Результаты исследований 84
2.2.1. Разработка тест-систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа птиц 84
2.2.1.1. Создание положительных контрольных образцов РНК (ПКО) 84
2.2.1.2. Выбор оптимальных параметров ПНР 90
2.2.1.3. Создание внутреннего контрольного образца РНК (ВКО)...96
2.2.1.4. Оценка аналитических характеристик тест-систем 100
2.2.1.5. Определение диагностической чувствительности тест-систем : 115
2.2.1.6. Сравнительная характеристика разработанных тест-систем и методик, рекомендуемых ВОЗ 119
2.2.2. Молекулярно-генетический анализ штаммов вируса высоко патогенного гриппа птиц 122
2.2.2.1. Анализ маркеров патогенности 122
2.2.2.2. Анализ резистентности к противовирусным препаратам... 126
2.2.2.3. Проведение молекулярно-генетического анализа родства изолятов вируса гриппа птиц 128
2.2.3. Молекулярно-эпидемиологический анализ вспышки гриппа птиц в частных хозяйствах Московской области 132
Обсуждение 140
Выводы 145
Практические рекомендации 146
Литература 147
Приложения
- Структура и функция вириона
- Методы диагностики гриппа птиц
- Разработка тест-систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа птиц методом ПЦР
- Сравнительная характеристика разработанных тест-систем и методик, рекомендуемых ВОЗ
Введение к работе
Активный эволюционный процесс в некоторых группах возбудителей инфекций в сочетании с активизацией миграционных потоков в человеческих популяциях создает предпосылки для» возникновения и глобального распространения инфекционных болезней. В настоящее время значительную обеспокоенность вызывает распространение в мире эпизоотии высоко патогенного гриппа птиц. Впервые эта проблема привлекла всеобщее внимание в 1997 году, когда масштабная эпизоотия высоко патогенного гриппа* в Гонконге была приостановлена только выбраковкой всей популяции птиц. Большинство экспертов ВОЗ считают, что эти меры, вероятно, помогли предотвратить надвигающуюся пандемию.
Начиная с 1997 г. по настоящее время по» всему миру неоднократно регистрировались эпизоотии* гриппа у домашних и диких птиц, при которых отмечались также случаи инфицирования млекопитающих и человека. Наиболее значительная эпизоотия была зарегистрирована в 2003-2004 гг. в странах Юго-Восточной Азии, где в течение нескольких месяцев были уничтожены более 100 миллионов- домашних птиц. В этот же период отмечались случаи заболевания птиц гриппом в Италии, Голландии, Бельгии и Германии. За время этих вспышек были уничтожены около 50* миллионов домашних птиц. С мая 2005 года в странах Юго-Восточной Азии началась новая эпизоотия, вызванная высоко патогенным вирусом гриппа А субтипа H5N1, которая затем распространилась по* территории Казахстана, России, Украины, Азербайджана и ряда Европейских стран.
До 1997 года считалось, что вирусы гриппа птиц не опасны для людей, так как регистрировались лишь редкие случаи инфицирования людей с клинической картиной конъюнктивита или легких форм ОРЗ в случае
тесного контакта человека с инфицированной птицей. Однако во время эпизоотии в Гонконге в 1997 г., Таиланде и Вьетнаме в 2003-2004 гг., во Вьетнаме в 2005 г. было показано, что вирус гриппа птиц может вызывать у людей тяжелые формы пневмонии, приводящие' к летальному исходу. По данным Всемирной организации здравоохранения с декабря 2003 г. по 11 марта 2008 г. в ряде стран мира (Азербайджан, Камбоджа, Китай, Джибути, Египет, Индонезия, Ирак, Лаос, Нигерия, Таиланд, Турция, Вьетнам) зарегистрировано 372 лабораторно подтвержденных случаев инфицирования людей вирусом гриппа птиц A/H5N1, из них у 235 пациентов заболевание привело к летальныму исходу.
Глобальное распространение высокопатогенного вируса гриппа птиц, а также возрастание числа людей, инфицирующихся при контакте с заболевшей птицей, заставило ВОЗ в 2005 выработать план подготовки к возможной пандемии. В настоящий момент, по мнению экспертов ВОЗ, мы находимся в фазе 3 пандемического процесса, что требует от каждого государства выстраивания своих собственных планов действий на случай возникновения эпидемии.
Опыт борьбы с гриппом птиц, накопленный за последние 10 лет, показал, что для разработки и проведения эффективных противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий, необходимо построение системы постоянного мониторинга за циркуляцией вируса гриппа, основанной на использовании лабораторных методов точной и быстрой идентификации и характеристики циркулирующих штаммов вируса гриппа А, с целью определения их генетического родства, степени патогенности и выявления мутаций резистентности к противовирусным препаратам. Среди лабораторных методов диагностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции (ТЩР). Главными преимуществами ГЩР в сравнении с культуральным подходом
являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для персонала. По диагностической значимости ПЦР более ценный метод, чем серология, поскольку позволяет выявлять вирус на самых ранних стадиях инфекции, задолго до появления антител, что крайне важно для проведения мероприятий, направленных на раннюю карантинизацию больных животных и людей. Кроме явных диагностических преимуществ, метод ПЦР, дополненный методом секвенирования ДНК, является универсальным молекулярно-генетическим подходом к опредлению большинства биологических свойств вирусов гриппа птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность противовирусной терапии.
Цель и задачи исследований
Целью исследований являлось создание системы эпидемиологического мониторинга за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц на основе разработанных нами тест-систем для молекулярной диагностики и генотипирования.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Разработать и стандартизовать диагностические наборы на основе ПНР для обнаружения РНК вируса гриппа А и идентификации наиболее значимых субтипов вируса гриппа птиц.
Разработать молекулярно-генетические методики для выявления маркеров патогенности, устойчивости к противовирусным препаратам, а также для установления степени родства штаммов вируса гриппа птиц.
Провести молекулярно-генетический анализ маркеров патогенности и адаптации к организму человека штаммов вируса гриппа птиц, циркулировавших во время эпизоотии гриппа у диких и домашних птиц 2005-2007 гг. в России и в странах СНГ.
Определить генетические маркеры устойчивости к противовирусным препаратам штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц, циркулировавших в России и в странах СНГ.
На основе разработанных молекулярно-генетических тест-систем и методик охарактеризовать эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию в очагах птичьего гриппа в России.
Научная новизна исследования
На основе разработанных нами тест-систем для диагностики и методик для генотипирования создана система эпидемиологического мониторинга на
молекулярном уровне за циркуляцией высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц.
Впервые в России разработаны ПЦР тест-системы для выявления и дифференциации штаммов вирусов A/H5N1 и А/Н5/Н7, обладающие высокой аналитической чувствительностью (5*10 гэ/мл в варианте электрофоретической детекции, 1*10 гэ/мл в варианте флуоресцентной детекции) и 100% специфичностью.
Проведен молекулярно-генетический анализ родства штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц, циркулировавших на территории России и сопредельных государств в июле 2005 г. - феврале 2007 г., что позволило определить географическое положение очагов инфекции, из которых в июле 2005 г. и в феврале 2007 г. происходил занос на территорию России вирусов высокопатогенного гриппа птиц, а также определить связь штаммов, циркулировавших на территории России, со штаммами, вызвавшими заболевания у людей и животных в ряде стран СНГ.
Разработаны молекулярно-генетические методики для оценки потенциальной патогенности и вирулентности вируса гриппа птиц для домашней птицы, млекопитающих и человека, а также для определения его устойчивости к противовирусным препаратам.
Обнаружен и охарактеризован штамм вируса A/H5N1, имеющий мутацию, обусловливающую его устойчивость к озельтамивиру («Тамифлю»), препарату, используемому для профилактики и лечения птичьего гриппа у людей.
Практическая значимость работы
В результате проведенного исследования установлено, что разработанные нами методы молекулярно-генетического мониторинга за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц позволяют:
оценить эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию по птичьему гриппу в России и ряде стран СНГ;
своевременно провести адекватные профилактические и противоэпидемические мероприятия, направленные* на предотвращение распространения заболеваемости птичьим гриппом в России;
выявить эпидемиологические связи циркулирующих в России штаммов высокопатогенного вируса гриппа со штаммами сопредельных стран.
Внедрение в практику
Впервые в России разработаны и внедрены в ветеринарную практику и систему санэпиднадзора тест-системы «ГРИПП» - (Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных № ПВР-1-3.5/01553 от 14 марта 2006 года) и «АмплиСенс Influenza virus Н5» (Регистрационное удостоверение № ЛС-001511 от 14.04.2006, Сертификат производства МИБП № 000592, ФСП 42-0115-7239-05) для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
На базе ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора было налажено производство тест-систем «ГРИПП» и «АмплиСенс Influenza virus Н5». В рамках Государственного заказа данные тест-системы поставляются в Центры гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ветеринарные Центры для проведения мониторинга за гриппом птиц на территории России.
Результаты выполненной работы вошли в Методические Указания по лабораторной диагностике гриппа птиц у людей МУК 4.2.2136* — 06 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей».
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены:
на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ и ФГУН ЦНИИЭ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, 2003-2007 гг.);
на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.);
VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2005 г.);
на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005
г.);
- на совместном заседании президиума РАСХН и РАМН «Итоги
выполнения совместного Постановления от 14 апреля 2005 г. по
проблеме «Грипп А — непредсказуемый и социально опасный
зооноз» (Москва, 2005 г.);
— на Международной конференции по инфекционным болезням
(ICEID) Общества микробиологов (Атланта (США), 2006 г.);
на международной научно-практической конференции "«Высокопатогенный грипп птицы: актуальные аспекты эпизоотологии, эпидедимиологии, диагностики и профилактики» (Судак, АР Крым (Украина), 2006 г.);
на международных семинарах-совещаниях специалистов стран СНГ по проблеме гриппа птиц (Новосибирск, 2006 и 2007 гг.);
на международной конференции «Готовность к пандемии гриппа: международная оценка» (Санкт-Петербург, 2007 г.);
на IX конгрессе Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).
Публикации результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждения, выводы, практические предложения, список литераттуры и приложения. Работа иллюстрирована 54 рисунками и 47 таблицами. Список литературы содержит 87 источников, в т.ч. 81 зарубежных авторов.
Структура и функция вириона
Структура вириона подробно описана в обзоре Webster [83]. Вирионы вируса гриппа1 А представляют собой неоднородные по форме частицы 80-120 нм в диаметре и 200-300 нм в длину преимущественно сферической формы, покрытые двухслойной липидной оболочкой, являющейся фрагментом наружной мембраны инфицированных клеток. Структура вириона схематично представлена на рисунке 2. Оболочка вириона содержит встроенные поверхностные белки — гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA) и протеин М2. С внутренней стороны оболочка вириона выстлана матриксным протеином Ml. Геном вирусов гриппа А имеет общий.размер 13588 п.н. и состоит из восьми уникальных сегментов одноцепочечной РНК с негативной полярностью, покрытых молекулами нуклеопротеина, имеющих форму спирали.
В совокупности все сегменты вируса кодируют 10 протеинов - РВ1, РВ2, РА, НА, NP, NA, Ml, М2, NSl, NS2. Протеины PBl, РВ2 и РА образуют комплекс, обеспечивающий РНК-зависимую РНК-полимеразную активность, и локализуются в ядре инфицированных клеток. РВ2, кодируемый первым сегментом, распознает, связывает и отщепляет кэпированные с 5 -конца участки мРНК клеток хозяина, которые используются для затравки при синтезе вирусной мРНК. РВ 1, кодируемый вторым сегментом, обеспечивает элонгацию комплементарной РНК и вирусной РНК вирионов нового поколения. Функция протеина РА детально не изучена. НА является основным поверхностным антигеном вируса, функционирующим в форме гомотримера в качестве видоспецифичного лиганда сиаловых рецепторов, находящихся на поверхности клеток организма хозяина, и тем самым, играет ключевую роль на первом этапе репликативного цикла вируса (проникновение в клетки). НА кодируется четвертым сегментом вируса. Во время посттрансляционного процессинга НА подвергается протеолизу для отщепления сигнальной последовательности и для расщепления предшественника (НАО) на фрагменты НА1 и НА2, которые затем соединяются дисульфидными мостиками, а также подвергаются гликозилированию иі конъюгации с жирными кислотами. Нуклеопротеин (NP), кодируемый пятым сегментом, выполняет структурную функцию, образуя оболочку молекул РНК, и регулирует полимеразную активность вирусной РНК-полимеразы, переключая ее с синтеза мРНК на синтез комплементарной и вирусной РНК. Нуклеопротеин подвергается фосфорилированию. Нейраминидаза (NA), кодируемая шестым сегментом, является вторым основным поверхностным антигеном, связанным с мембраной и функционирует в форме тетрамера как фермент, катализирующий отщепление нейраминовых кислот от сиаловых рецепторов в процессе высвобождения нового поколения вирусов из клеток хозяина. Седьмой сегмент вириона кодирует два протеина - Ml и М2. Протеин Ml формирует внутреннюю поверхность оболочки вириона и, как предполагается, инициирует сборку вирусных частиц нового поколения. Тетрамер протеина М2 расположен в оболочке вириона трансмембранно и формирует протонные каналы, создающие кислую среду, необходимую для освобождения вирусной РНК в процессе инфицирования. Восьмой сегмент вируса гриппа кодирует мРНК, подвергающуюся альтернативному сплайсингу с образованием двух неструктурных протеинов - NS1 и NS2. Оба белка представлены в большом количестве в инфицированных клетках (NS1 преимущественно в ядре, a NS2 в цитоплазме), но они не присутствуют в зрелых вирионах.
Вирионы прикрепляются к клеткам хозяина посредством активированного протеолизом гемагглютинина, НА1 субъединица которого содержит участок всязывания с терминальными сиаловыми кислотами гликопротеиновых (гликолипидных) рецепторов клеточной стенки (Neu5Ac(2-3)Gal или Neu5Ac(2-6)Gal). После прикрепления вирион проникает внутрь клетки путем эндоцитоза. Кислая среда визикул способствует изменению конформации субъединиц гемагглютинина, что приводит к проникновению гидрофобных участков субъединицы НА 2 в везикулярную мембрану и в конечном итоге к слиянию везикулярной и вирусной мембран. Далее активируются протонные каналы вириона, что приводит к понижению кислотности внутри вириона и выходу сегментов РНК, покрытых нуклеопротеином через цитоплазму в ядро клеток, где связанные с нуклеокапсидом полимеразные комплексы инициируют первичную транскрипцию мРНК вируса и трансляцию в цитоплазме преимущественно протеинов NP и NS1. При этом блокируется трансляция мРНК инфицированных клеток. Протеины NP и NS1 мигрируют в ядро, где как полагают, они способствуют переключению активности полимеразного комплекса с транскрипции мРНК на транскрипцию комплементаной (кРНК) и вирусной РНК (вРНК). Вновь синтезированные вРНК служат матрицей для транскрипции и трансляции поздних продуктов - Ml, М2, НА и NA. Протеины Ml, М2, а также НА и NA после посттрансляционного процессинга, транспортируются к клеточной поверхности, где встраиваются в клеточную мембрану, которая выстилается изнутри матриксным белком и окружает покрытые нуклеокапсидом сегменты РНК. Вновь образованные вирионы отпочковываются от клеточной мембраны посредством действия нейраминидазы, катализирующей отщепление нейраминовых кислот от сиаловых рецепторов и, тем самым, предотвращей аггрегацию вирионов на поверхности клеток. Последний этап созревания (протеолитическое расщепление предшественника гемагглютинина на субъединицы) зависит от структуры гемагглютинина и происходит либо уже после выхода вирионов из инфицированных клеток (при повторном инфицировании в желудке птиц или в респираторном тракте людей), либо внутриклеточно, что характерно для гемагглютинина, ассоциированного с вирусами, имеющими высокую степень патогенности.
Продолжительность инкубационного периода (с 3-х до 7-ми дней) и выраженность клинической картины при инфицировании вирусами гриппа птиц зависят от субтипа вируса, вида животного, количества попавшего в организм вируса, возраста, иммунного статуса животного (человека) и в наибольшей степени от наличия факторов патогенности у данного варианта вируса. По степени патогенности выделяют два основных варианта вируса гриппа птиц - низкопатогенный вирус гриппа птиц (НПВГП) и высокопатогенный вирус гриппа птиц (ВПВГП). Выделяют следующие основные критерии, характеризующие ВПВГП: вирус должен вызывать гибель более 75% 4-8-ми недельных цыплят, в течение 10 дней после внутривенного введения 0,2 мл суспензии в разведении 1:10і или интравенозный индекс патогенности (IVPI) должен превышать 1,2; вирус должен содержать более двух основных аминокислот в сайте протеолитического расщепления гемагглютинина. Вирус любого субтипа можно отнести к разряду ВПВГП при соблюдении трех или двух последних условий. Вирусы, имеющие гемагглютинин отличный от 5 или 7 типа относят к ВПВГП при соблюдении одного из двух первых условий. НПВГП у диких водоплавающих птиц (например, уток) реплицируется главным образом в клетках, выстилающих киишечник, при этом никаких видимых признаков заболевания вирус не вызывает, однако выделяется с пометом в высоких концентрациях.
Методы диагностики гриппа птиц
В связи с разнообразием клинической картины гриппа птиц как у животных, так и у людей для постановки диагноза требуется его обязательное лабораторное подтверждение. Согласно рекомендациям МЭБ [51] одним из методов выбора традиционно считается выделение вируса на развивающихся эмбрионах кур SPF с последующей идентификацией вируса. Изоляцию вируса проводят на 9-11-дневных эмбрионах, в которые вводят 0,2 мл биологического материала с добавлением антибиотиков и инкубируют при 35-37 С в течение 4-7 дней. От павших птиц используют 10% суспензию индивидуальных или пулированньгх внутренних органов (трахея, легкие, воздушные мешки, кишечник, селезенка, почки, мозг, печень, сердце), от живых птиц -трахеальные и клоакальные смывы или осветленную суспензию помета. В конце обозначенного периода эмбриональную жидкость тестируют на наличие гемагглютинирующей активности (достижение титра 1:8 и более). Следует учитывать, что гемагглютинирующая активность характерна как для вирусов гриппа А, так и для парамиксовирусов (например, вирус Ньюкасла) и некоторых штаммов реовирусов птиц. Неспецифическую реакцию гемагглютинации может вызывать наличие в аллантоисной жидкости гемагглютининов бактериального происхождения. В связи с этим присутствие в эмбриональной жидкости именно вируса гриппа А должно быть подтверждено либо в тесте иммунодиффузии в агаре [8] с антисыворотками к нуклеокапсиду илиматриксному антигену вируса гриппа А, либо в тестах на основе иммуно-ферментного анализа (Elisa) с моноклональными антителами к нуклеокапсиду [68; 69; 77]. Тест иммунодиффузии обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако он длителен (24-48 ч.) и интерпретация результатов требует определенных навыков работы. Коммерчески доступным является набор Directigen Flu A (Becton, Dickinson Microbiology Systems, США) для детекции антигена NP с помощью иммуноферментного анализа. Преимуществом теста является быстрота анализа (15 минут), однако его чувствительность неодинакова для разного биологического материала, а специфичность проверена не на всех видах птиц и анализ имеет высокую стоимость.
Методика ОТ-ПЦР была успешно использована во время вспышки высокопатогенного гриппа в 2003 г. в Нидерландах. Была отмечена высокая чувствительность и специфичность анализа [45], при этом чувствительность анализа при исследовании смывов из трахеи совпадала с чувствительностью выделения вируса. Однако было отмечено, что при исследовании помета в ряде случаев наблюдалось ингибирование реакции. Таким образом, при разработке тестов большое внимание следует уделять качеству экстракции РНК и контролю наличия ингибирования, чтобы избежать ложно-отрицательных результатов анализа. Certest Biotec S.L. Иммунохро-матография CerTest Avian Flu test Помет, мазки из клоаки Тестирование антигенов вирусагриппа А, для птиц Испания Imm Tech Incorporated Elisa Influenza ANucleoproteinAntigenDetectionEIA Помет, мазки из трахеи и клоаки, гомогенаты тканей, аллантоисная жидкость Домашняя птица США Rockeby biomed Ltd Иммунохро-матография Rockeby Avian Influenza virus Antigen test kit Помет, мазки из клоаки, аллантоиснаяжидкость Домашняя птица Сингапур Synbiotics Быстрая иммунохро-матография на стрипах FLUDETECT Antigen Capture test strip Мазки из трахеи и клоаки Птица Франция Среди доступных в России быстрых тестов можно отметить «FLU Detect Test Strip», («Synbiotics», Франция), которая рекомендуется для обнаружения типоспецифического антигена вируса гриппа в трахеальных и клоакальных смывах и помете, и тест-система «Rapid Test Kit АІУ Ag», («Anigen», Корея), рекомендуется для обнаружения типоспецифического антигена вируса гриппа в фекалиях, трахеальных и клоакальных смывах, суспензиях тканей. Преимуществом этих тестов является высокая скорость проведения теста (15 минут) и возможность постановки в полевых условиях, однако тесты неспецифичны при исследовании проб внутренних органов и помета (дают ложно-положительные результаты), имеют невысокую чувствительность и очень высокую стоимость. В связи с этим подобные тесты не целесообразно использовать для диагностики гриппа птиц у индивидуальных особей, а положительные результаты необходимо обязательно подтверждать специфичными методами (выделением вируса с последующей идентификацией или ОТ-ПЦР).
В некоторых случаях для диагностики гриппа птиц применяются серологические методы. Следует иметь в виду, что серологические тесты для обнаружения антител у инфицированных птиц могут успешно применяться только в случае медленного течения инфекции или носительства для не вакцинированных животных (в противном случае тест должен обладать способностью дифференцировки поствакцинальных и инфекционных антител). При инфицировании BITBFn заболевание протекает молниеносно, вследствие чего антитела не успевают достигнуть диагностического уровня. В связи.с этим МЭБ не рекомендует применение серологических ТЄСТОВ -для диагностики ВПВГП.
С целью обнаружения антител к вирусам гриппа А используется реакция иммунодиффузии в агаре (РД11), реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА. РДП рекомендован только для тестирования кур и индеек, так как не все виды птиц образуют преципитирующие антитела при инфицировании гриппом А. Вследствие отсутствия стандартизованных компонентов; РТГА может давать невоспроизводимые результаты.
Разработка тест-систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа птиц методом ПЦР
В работе использовали следующие штаммы и изоляты: штаммы вируса гриппа Ад выделенные от; животных: А/черноголовый хохотун/Астрахань/1421/79 (H13N2), А/индюк/Висконсин 1/66 (H9N2), А/индюк/Онтарио/6118/69 (H8N4), А/утка/Германия/1215/73 (H2N3), А/утка/Чехословакия/56 (H4N6), А/утка/Англия/56 (H11N6), А/утка/Альберта/60/76 (H12N5), А/утка/Украина/1/63 (H3N8), А/утка/Альберта/35/76 (H1N1), А/индюк/Массачусетс/3 740/65 (H6N2), А/цыпленок/Германия/49 (H10N7), А/крачка/Ю. Африка/61 (H5N3), А/утка/вирус чумы птиц/Росток/34 (H7N1), А/свинья/1976/31(HSW1N1), А/утка/Поттсдам/1402-6/86 (H5N2); штаммы вируса гриппа А, выделенные от человека: А/Кумамото/102/2002 (H3N2), А/Ленинград/549/80(Н2Ш), А/Киев/3304/84 (H0N1), А/Гонконг/03 (H5N1), А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2); штамм вируса гриппа В -В/Токио/53/2000; штаммы других возбудителей инфекционных болезней птиц: реовирус, вирус инфекционного бронхита кур (ИБК «Чапаевский», ИБК МВА-6, ИБК Н-120, ИБК AM, М-4), парамиксовирусы 1 и 2 типов, вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус болезни Марека, вирус \ болезни Гамборо, Mycoplasma gallisepticum; штаммы аденовируса человека 3, 5, 6, 7, 37, 40 типов; штамм респираторно-синцитиального вируса «Лонг» тип А; штамм вируса парагриппа 1 (Сендай), 2 и 3 типов; штаммы бактериальных возбудителей ОРЗ человека: Haemophilus influenzae тип В, Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila; клинические изоляты: коронавирус человека групп ОС43 и Е229; респираторно-синцитиальный вирус тип А и В; вирус парагриппа тип 1-4; риновирус тип 1В и 2, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae. Штаммы предоставлены ГИСК им. Л.А. Тарасевича и ФКУ ВГНКИ.
Внутренние органы мясо птиц и комбикорм гомогенизировали с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовили 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Суспензию переносили в пробирку на 1,5 мл и центрифугировали при 10 тыс. об./мин в течение 30 секунд. Супернатант использовали для экстракции РНК.
Помет. Для исследования использовали 4-5 г помета. Готовили 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе, тщательно ресуспендировали и декантировали в течение 10 мин. Надосадок переносили в пробирку на 1,5 мл и центрифугировали при 12 тыс. об./мин в течение 5 мин. Супернатант использовали для экстракции РНК.
При исследовании яиц в скорлупе прокалывали отверстие иглой со стерильным шприцем или пастеровской пипеткой с фильтром и отбирали в пробирку на 1,5 мл 1,0-1,5 мл яичного белка. Методика экстракции РНК.
Лизирующий раствор (гуанидин тиоцианат ("Amresco", США) — 5,2 М; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ("Amresco", США) — 12,5 мМ; трис-(оксиметил)-аминометан-гидрохлорид (трис-НО) ("Amresco", США) - 10 мМ; тритон XI00 ("Amresco", США) - 2 %.) и раствор для отмывки 1 (гуанидин тиоцианат - 5,0 М, Ка2-ЭДТА - 0,0125 М, трис-НС1 -0,01 М.) прогревали при 65 С до полного растворения кристаллов. 1. Отбирали необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный контроль выделения). Вносили в каждую пробирку по 450 мкл лизирующего раствора. (В случае дальнейшего использования гибридизационно-флуоресцентного анализа вносили по 10 мкл ВКО). Пробирки маркировали. 2. Если анализировали яйца, эмбрионы кур, то в пробирки с лизирующим раствором вносили по 100 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером. 3. Если анализировали мазки со слизистой глотки и трахеи, пробы фекалий, комбикорма и сухие корма, то в пробирки с лизирующим раствором вносили по 50 мкл ОКО (сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая для культур клеток (ФС 42-0343-3539-02) с натрия азидом ("Sigma", США) 0,05%) и по 50 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером. 4. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения вносили 100 мкл ОКО. 5. Плотно закрытые пробы тщательно перемешивали на вортексе и ценрифугировали в течение 5 с при 5 тыс. об./мин на микроцентрифуге для удаления капель со внутренней поверхности крышки пробирки. 6. Тщательно ресуспендировали сорбент (суспензия силикагеля ("Sigma", США, кат. № S 5631) — 40%, в деионизованной воде "MilliQ", полученной в системе водоочистки ("Millipore", США, кат. № ZMQSEL230) на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавляли по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешивали на вортексе, оставляли в штативе на 1 мин, еще раз перемешивали и оставляли на 5 мин. 7. Центрифугировали пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об./мин в течение 30 с на- микроцентрифуге. Удаляли супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник, для каждой пробы. 8. Добавляли в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировали 30 с при 10 тыс. об./мин на микроцентрифуге. Удаляли супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. 9. Добавляли в пробирки по 500 мкл 70% раствора этилового спирта. Тщательно ресуспендировали сорбент на вортексе. Центрифугировали 30 с при 10 тыс. об./мин на микроцентрифуге. Удаляли супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. 10. Повторяли отмывку, следуя пункту 9. 11. Добавляли в пробирки по 400 мкл ацетона. Тщательно ресуспендировали сорбент на вортексе, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об./мин на микроцентрифуге. Полностью удаляли супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный, отсасыватель.
Сравнительная характеристика разработанных тест-систем и методик, рекомендуемых ВОЗ
При анализе методики выявления штаммов гриппа А с 5 типом гемагглютинина, рекомендованной ВОЗ для диагностики заболевания у человека, (WHO. Recommended laboratory tests to identify influenza A/H5 virus in specimens from patients with an influenza-like illness) был выявлен высокий риск получения ложноположительных результатов из-за возможности перекрестного выявления штаммов гриппа А, содержащих 1 тип гемагглютинина, а таюке возможное образование ложно-положительных результатов при идентификации нейраминидазы первого типа с изолятами- четвертого типа нейраминидазы, что было доказано далее экспериментальным путем (см. рисунки 41, 42 и 43).
При сравнительной оценке аналитических характеристик разработанных тестов и ПЦР-методики, рекомендованной ВОЗ для выявления изолятов, имеющих 5-ый тип гемагглютинина, была выявлена низкая аналитическая чувствительность и специфичность методики ВОЗ. В частности, при тестировании рекомбинантного положительного контрольного образца аналитическая чувствительность составила всего 1x105 ГЭ/мл, что хуже показателей наших тестов в 20 - 100 раз (5x10 ГЭ/мл и 1x10 ГЭ/мл). В одном случае при тестировании образцов легких, павших от гриппа кур, был обнаружен фрагмент ПЦР ожидаемого размера, который, как показало секвенирование, содержал в своем составе рекомендованную ВОЗ последовательность праймеров, фланкирующую неизвестную для GenBank последовательность (вероятно из генома кур).
Низкая чувствительность реакции с праймерами, рекомендуемыми ВОЗ, вероятно, связана с большим размером фрагментов амплификации, отдаленным расположением праймера для инициации реакции обратной транскрипции (на расстоянии 1200 п.н.о. от амплифицируемого участка) и с малым количеством циклов амплификации (рекомендовано 30 циклов). При этом увеличение количества циклов амплификации приводит к снижению специфичности анализа за счет образования большого количества неспецифических продуктов.
В геноме вируса гриппа известны несколько участков, определяющих степень его патогенности: это — четвертый сегмент, кодирующий гемагглютинин (НА), шестой сегмент, кодирующий нейраминидазу (NA), первый сегмент, кодирующий ген РВ2, и восьмой сегмент, кодирующий неструктурные белки NS1 и NS2. В таблице 43 приведены аминокислоты молекулы гемагглютинина, участвующие во взаимодействии с рецепторами, посредством которых вирус проникает в клетки, и которые характеризуют видовую приспособленность вируса гриппа различных субтипов к организму природного хозяина.
Как видно из таблицы 43, изученные в данной работе вирусы имели структуру гемагглютинина, по всем ключевым аминокислотам характерную для связывания с рецепторами птиц. Все представленные на данный момент в свободном доступе последовательности гемагглютинина гриппа H5N1, выделенные от инфицированных (и впоследствии умерших) людей в 2005-2006 годах, также содержат аминокислоты, характерные для «птичьих» изолятов.
Исследованные в данной работе изоляты в положении 158 гемагглютинина имели аминокислоты, по которым происходит гликозилирование аминогрупп во время пост-трансляционного процессинга белка (большинство изолятов содержали Asn, а в изоляте A/swan/Astrakhan/Russia/Nov-2/2005 (H5N1) в этом положении находилась аминокислота Asp). Все изоляты также имели делецию в гене нейраминидазы (20 аминокислот в позициях 49-68) (см. рисунок 44), что можно считать маркером адаптации вируса к организму кур. Таким образом, наличие гликозилированного гемагглютинина снижает сродство вирусов к сиаловым рецепторам и дает возможность эффективно реплицироваться [32], компенсируя сниженную активность нейраминидазы.
При исследовании изолята A/Hong Kong/156/97(H5Nl) (НК/156/97) было отмечено [27], что наличие аминокислоты Glu в позиции 92 гена NS1 способствует большему проявлению патогенных свойств вируса, в то время как изменение этой аминокислоты на Asp с помощью сайт-направленного мутагенеза приводит к снижению титра вируса и уменьшает процент смертности инфицированных мышей. Подобную структуру гена имели все изоляты вируса A/H5N1, выделенные от людей в Гонконге в 1997 г. (в том числе НК/156/97) и изолят A/H9N2, выделенный в Гонконге от человека в 1999 году [48]. В исследованных нами изолятах вируса A/H5N1 присутствует делеция 5 аминокислот в положении 80-84 последовательности белка NS1. Этим они отличаются от изолятов H5N1 1997 года и похожи на изоляты 2003-2005 годов, в том числе выделенные от людей. Вследствие данной делеции, позиция гена NS1, соответствующая 92 аминокислоте изолята НК/156/97 сдвигается в изолятах 2005 г. на 87 положение, в котором расположен Asp. Таким образом, исследованные нами изоляты содержат Asp в позиции reHaNSl, соответствующей 92 аминокислоте изолята НК/156/97.
Исследователи под руководством Naeve C.W. [60], обратили внимание на то, что на карбоксильном конце белка NS1 представлен мотив (ESEV-СООН), с которым специфически связываются регуляторные белки, содержащие PDZ-домены [70], играющие ключевую роль в организации сигнальных путей. Замечено также, что вирусы гриппа, адаптированные к организму птиц, преимущественно содержат аминокислоты Е или G в первом положении указанного мотива, в то время как вирусы гриппа, вызывающие ежегодные эпидемии у людей, в 92% случаев содержат аминокислоту R, причем мотивы RSKV обладают меньшим сродством к регуляторным белкам, чем мотивы ESEV или GCEV [60]. Следует отметить, что вызвавшие высокую смертность изоляты вируса H5N1, выделенные от людей во время вспышек 1997-1999 гг в Гонконге и во время вспышек 2003-2004 гг в Гонконге; Вьетнаме и Таиланде, содержали мотивы, характерные для птичьих изолятов - EPEV иі ESEV соответственно, в то время как изоляты вирусов гриппа эпидемий 1957 г. (H2N2) и 1968 г. (H3N2) содержали мотив RSKV и гораздо реже приводили к смертельному исходу. Выделенные нами изоляты, а также все изоляты вируса A/H5N1, 2005-2006 гг. из России и других стран, имеют мотив ESKV, то есть «птичьего» типа, с которым специфически связываются регуляторные белки, играющие ключевую роль в организации сигнальных путей и, следовательно, изоляты вируса могут обладать большой потенциальной способностью нарушать регуляцию цитокинового ответа в организме людей.
![Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс]](/i/i/4286/206226.png "Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А [Электронный ресурс] Петухова Галина Дмитриевна")
