Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Протеомные и геномные факторы в морфологических изменениях опухолевых клеток 14
1.1.1. Нарушение эпигенетического контроля и опухолевый рост 14
1.1.2. Морфологические изменения нейральных клеток при воздействии факторов дифференцировки 25
1.2. Значение сиалидаз и ганглиозидов в морфологических изменениях опухолевых клеток 40
1.2.1. Сиалидазная активность в структурных изменениях клеточного ядра 40
1.2.2. Значение ганглиозидов для морфологических изменений клеток 45
1.2.3. Значение сиалидаз и ганглиозидов в
морфофункциональной пластичности нейральных клеток 56
1.3. Ферменты, участвующие в метаболизме ганглиозидов 61
1.3.1. Методические особенности исследования активности ферментов, регулирующих состав ганглиозидов 61
1.3.2. Метаболизм ганглиозидов 69
1.3.3. Субстратная специфичность разных типов сиалидаз 75
1.3.4. Липидные микродомены и сиалидаза ассоциированная с плазматической мембраной 76
1.4. Циклический аденозинмонофосфат как фактор
дифференцировки нейральных клеток 81
2. Материалы и методы 87
2.1. Перевиваемые клеточные линии in vivo 87
2.2. Поддержание клонов перевиваемой in vivo рабдомиосаркомы РА-23 крыс 87
2.3. Клеточные культуры и генетическая трансфекция 89
2.4. Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной 91
2.5. Анализ активности лизосомальной сиалидазы 92
2.6. Анализ активности ацетилхолинэстеразы 93
2.7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ-электрофорез) 94
2.8. Количественная полимеразная цепная реакция 97
2.9. Иммуноцитохимический анализ 99
2.10.Импрегнация клеток нитратом серебра 99
3. Результаты 100
3.1. Морфофункциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс при воздействии противоопухолевых факторов 100
3.1.1. Метастатический потенциал клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА—23 крыс при воздействии противоопухолевых факторов 100
3.1.2. Сиалидазная активность в клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс, контрастных
по метастатическому потенциалу 107
3.2. Функциональные изменения клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23, связанные с отбором на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер 111
3.2.1. Отбор опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер 111
3.2.2. Метастатический потенциал опухолевых клонов, контрастных по частоте клеток с нарушениями структуры ядер 123'
3.2.3.Активность лизосомальной сиалидазы в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер 134
3.2.4. Активность сиалидазы ассоциированной с
плазматической мембраной в клетках опухолевых клонов, различающихся по нарушениям структуры ядер 136
3.3. Морфофункциональные изменения нейральных клеток линии NB-1 нейробластомы человека 138
3.3.1. Морфологические маркеры дифференцировки клеток линии NB-1 нейробластомы человека при повышенной экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной 138
3.3.2. Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека 149
3.3.3. Активность ацетилхолинэстеразы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека при
воздействии факторов дифференцировки 150
3.3.4. Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека 153
3.4. Анализ молекулярно-генетических маркеров экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека 155
3.4.1. Верификация продукта транскрипции гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клетках NB—1 155
3.4.2. Иммуноцитохимическая верификация клеток NB-1,
положительных по экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной 157
3.4.3. Верификация методом протеомного анализа антигена, соответствующего сиалидазе ассоциированной с плазматической мембраной 159
Обсуждение 161
Выводы 186
Практические предложения 187
Список литературы
- Морфологические изменения нейральных клеток при воздействии факторов дифференцировки
- Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной
- Метастатический потенциал клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА—23 крыс при воздействии противоопухолевых факторов
- Отбор опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изменение морфологических свойств клетки в ответ на воздействие внешних и/или внутренних факторов характеризует её состояние. В связи с этим необходимо исследование механизмов; регулирующих эти изменения. Возможность клеточного- ответа на определённый стимул - будь то трофический фактор (синтез факторов роста, или дифференцировки) или физико-химическое воздействие, — обеспечивается- комплексным взаимодействием сопряжённых молекулярных систем, которые расположены как на мембранах, так и в ядре клетки. Плазматическая мембрана является динамичной структурой со сложной организацией. Гликосфинголипиды и ферменты, модулирующие их, способны образовывать надмолекулярные системы плазматической' мембраны, которые особенно насыщены ганглиозидами. Ганглиозиды, являясь неотъемлемой составной частью плазматической мембраны любой эукариотической- клетки, подвергаются* гидролизу ферментом сиалидазой, элиминирующим молекулы сиаловой кислоты из их структуры. Изменение количества молекул сиаловой кислоты., приводит к качественным изменениям ганглиозидов, что активирует или тормозит ряд протеинкиназ. Протеинкиназы, в свою очередь, осуществляют фосфорилирование ряда белков; что стимулирует или снижает транскрипцию определённых генов. Несмотря на значительные достижения в исследовании клеточного генома, нет полной ясности о том, как реализуют своё действие уникальные гены в клетках эукариот.
К настоящему времени уже не вызывает сомнения, что сиалидазы. играют важную роль в изменении морфологических свойств клеток. Показано, что накопление сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в области окончания одного из отростков способствует его росту (Rodriguez et al., 2001). Ассиметричное перераспределение сиалидазы
8 ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ) локально повышает активность тирозинкиназы А, которая, в свою очередь, стимулирует активность фосфатидил-инозитол-3-киназы (ФИ-З-К) и следующую за этим деполимеризацию актина в отростке и его развитие в виде аксона (Da Silva et al., 2005). Матричная рибонуклеиновая кислота, с которой происходит трансляция фермента сиалидазы- ассоциированной с плазматической мембраной, выявляется в коре головного мозга, мозжечке и гиппокампе у мышей. Экспериментально вызванная- с помощью трансфекции высокая активность данного типа сиалидазы инициировала феномен дифференцировки в клеточных линиях нейрального происхождения. При этом дифференцировка клеток сопровождалась морфологическими изменениями, что регистрировалось как образование отростков (Hasegawa et al., 2000). При аксонотомии регенерация аксонов происходила в тех нейронах, в которых выявлялась высокая* активность САПМ. В нейронах с низкой активностью САПМ аксонотомия, как правило, не сопровождалась восстановлением аксонов, что было показано- на клеточной* культуре нейральных клеток, полученных из гиппокампа крыс (Rodriguez et al., 2001).* Предполагается, что данный» эффект сиалидазы сопровождается изменением в плазматической мембране содержания высших ганглиозидов и v накоплением содержания ганглиозидов с одной молекулой сиаловой кислоты (Kato et al., 2006).
Нарушение экспрессии сиалидаз имеет значение для развития патофизиологических процессов в организме. При сиалидозах, например, болезни Тэя-Сакса происходит нарушение деградации олигосахаридов и их избыточное накопление в лизосомах. Такие характеристики опухолевых клеток, как способность к метастазированию и инвазивность, непосредственно связаны с состоянием плазматической мембраны клетки, в состав которой входят соединения, содержащие молекулы сиаловых кислот, включая гликосфинголипиды. При этом изменение активности сиалидаз может существенно влиять на злокачественность опухолевых клеток не
9 только вследствие изменения состава гликосфинголипидов, но, главным образом, влияния на активность определённых типов тирозинкиназ, которые могут инициировать перестройку цитоскелета. Как известно, функциональное состояние клеточного цитоскелета оказывает влияние на подвижность и инвазивность опухолевых клеток. Повышенная экспрессия сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии карциномы почки RCC приводила к истощению моносиалоганглиозида GM3 и делала опухолевые клетки карциномы менее чувствительными к факторам, индуцирующим апоптоз (Ueno et al., 2006). Снижение концентрации GM3 также приводило к повышению подвижности опухолевых клеток. Метастатический потенциал опухолевых клеток меланомы В16 мыши также существенно зависит от моносиалоганглиозида GM3 (Kato et al., 2001). Высокая экспрессия сиалидазы сопровождает процесс дифференцировки клеток мышечной ткани. Значительное повышение уровня матричной рибонуклеиновой кислоты для гена сиалидазы.регистрировалось в крысиных миобластах уже на 3-й сут после индукции дифференцировки. В то же время; миогенная дифференцировка могла быть блокирована при экспозиции крысиных миобластов к антисенс-олигодезоксирибонуклеиновой кислоте, комплиментарной ДІЖ, кодирующей сиалидазу (Sato and Miyagi, 1996).
Анализ данных литературы показывает недостаточную изученность взаимосвязи морфологических изменений опухолевых клеток неирального и мышечного происхождения с их сиалидазной активностью.
Вследствие этого целью настоящей работы явилась оценка морфологических и функциональных изменений опухолевых клеток неирального и мышечного происхождения и определение взаимосвязи этих изменений с сиалидазной активностью опухолевых клеток.
10 В задачи исследования входило:
Получить клоны клеток с высоким и низким метастатическим потенциалом, используя модель перевиваемой органотропной рабдомиосаркомы РА-23 крыс;
Провести сравнительную характеристику активности лизосомальнои сиалидазы в контрастных по метастатическому потенциалу клонах;
Провести сравнительную характеристику активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в контрастных по метастатическому потенциалу клонах;
Охарактеризовать структуру ядер в клетках клонов с высоким и низким метастатическим потенциалом, в том числе в клетках клонов рабдомиосаркомы РА—23 крыс при воздействии химиотерапевтических агентов;
Определить уровень матричной РНК гена сиалидазы, ассоциированной? с плазматической мембраной, в клеточной линии NB-1 нейробластомы» человека в ответ на воздействие веществ, способствующих клеточной дифференцировке;
Оценить эффект высокой активности сиалидазы ассоциированной» с плазматической мембраной на морфологическую дифференцировку клеток линии NB-1 нейробластомы человека в том числе при воздействии веществ, способствующих клеточной дифференцировке;
Оценить активность ацетилхолинэстеразы как маркера нейральной дифференцировки в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека на фоне, вызванном трансфекцией, высокой активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.
Научная новизна.
Впервые в мире обосновано использование показателей сиалидазной активности для оценки морфологических изменений опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения. Выявлена отрицательная взаимосвязь между повышенной активностью лизосомальнои сиалидазы и
метастатическим потенциалом. На основе гетерогенности клонов перевиваемых опухолевых клеток in vivo показано, что существует положительная взаимосвязь между метастатическими характеристиками опухолевых клеток и изменением структуры ядер опухолевых клеток в виде интерфазных мостов. Установлено, что высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку нейральных клеток in vitro. При этом доказано, что циклический аденозинмонофосфат индуцирует морфологическую дифференцировку и повышенную активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной. Работа имеет приоритетное значение для изучения молекулярных механизмов регенерации нервной ткани и поиска фармакологических веществ антибластомной направленности.
Основные положения, выносимые на защиту:
Клоны перевиваемой рабдомиосаркомы РА—23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом! отличаются по активности лизосомальной сиалидазы и по частоте клеток со структурными изменениями ядер в форме интерфазных мостов, этот эффект модулируется цитостатиком циклофосфаном.
Циклический аденозинмонофосфат повышает уровень матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной но не влияет на уровень матричной РНК гена лизосомальной сиалидазы.
Повышенная активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной сопровождает морфологическую дифференцировку опухолевых клеток нейального происхождения, этот эффект усиливается циклическим аденизомонофосфатом.
Повышенная активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, связана с биохимическими маркерами дифференцировки нейральных клеток (ацетилхолинэстераза).
12 Теоретическая и. практическая значимость работы. Теоретическая значимость полученных результатов заключается в доказательстве значения двух типов- сиалидаз (ассоциированной с плазматической мембраной и лизосомальной) в морфологических изменениях опухолевых клеток нейрального (образование отростков) и мышечного происхождения (изменение структуры ядер в форме интерфазных мостов). Высокая активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной вызывает глубокие морфофункциональные перестройки нейральных клеток, выражающиеся в их морфологической и биохимической дифференцировке. Циклический аденозинмонофосфат повышает активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, но не лизосомальной сиалидазы, что, по-видимому, связано с активацией разных молекулярных сигналов* (сигнальных систем) в нейральных клетках. Кроме того, получены* данные, указывающие на то, что различные- типы сиалидазной* активности имеют разное значение- в формировании метастатических характеристик злокачественных клеток мышечного происхождения.
Практическая, значимость работы состоит в том, что предложен и апробирован оригинальный способ выявления активности разных типов сиалидаз, который может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях для оценки влияния различных стимулов на клеточную дифференцировку. Комплексный подход в оценке молекулярных и морфологических изменений, которые сопровождаются высокой сиалидазной активностью, может быть использован для тестирования пептидных, синаптотропных, метаботропных, гормональных и антибластомных фармакологических средств.
Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр нормальной физиологии и фармакологии Военно-медицинской академии имени С.М'.Кирова, кафедры нервных болезней и психиатрии и кафедры специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного
13 университета имени Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова МЧС России. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №04-04-49672).
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на 18-м международном конгрессе генетиков (Пекин, 1998), 17-м международном конгрессе по исследованию рака (Рио-де-Жанейро, 1998), 14-й объединённой встрече европейского и американского нейрохимических обществ- (Вёрлиц, Берлин, 1999), 11-м международном конгрессе по гистохимии и иммуноцитохимии,(Йорк, Великобритания; 2000), 23-й конференции по исследованию полисахаридов* (Токио, Япония, 2002), 27-й конференции по гликолипидам (Бостон, США, 2007), 3-м съезд фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007).
Публикации.1 По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 10 журнальных статей, один патент на изобретение и 5 тезисов. Работы опубликованы^ материалах международных конференций и в журналах: «Доклады Академии наук», «Вопросы онкологии», «Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии», «Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях», «Neurochemical Research», «Генетика», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «Glycobiology», «Медицинский Академический Журнал».
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы из 446 источников, среди которых 411 на иностранном языке. Диссертация изложена'на 236 страницах, содержит 7 таблиц, 6 г рисунок.
Морфологические изменения нейральных клеток при воздействии факторов дифференцировки
Образование отростков, нейральными клетками и аксонов нейронами является уникальной особенностью данного типа клеток и является комплексным событием, в котором механизмы удлинения отростка (аксона) и направление его удлинения должны быть скоординированы. Образование отростка (аксона) регулируется на,молекулярном уровне и вовлекает многие сопряжённые сигнальные факторы, обеспечивающие передачу информации, поступающей извне в клеточное ядро с последующей индукцией транскрипции и трансляции молекул, обеспечивающих скоординированное удлинение аксона и его направление (Tessier-Lavigne and Goodman, 1996). Исследование феномена аксоногенеза важно в связи с лечением, нейродистрофических/дегенеративных заболеваний, в основе которых лежит нарушение механизма формирования морфологической пластичности нейральных клеток (нейронов), а также в связи с возможностью регенерации повреждённых аксонов (Reiner et al., 1993; Rodriguez et al., 2001; Liedtke et al., 2007; Oprea et al., 2008). Данные об образовании отростков нейральными клетками и аксонов нейронами получены, главным образом, в системе in vitro (Andersen and Bi, 2000). Полученные к настоящему времени результаты позволяют считать, что удлинение отростка (аксона) требует дополнительного построения мембраны на конце растущего отростка и постоянных динамичных изменений не только микротрубочек и актиновых филаментов, но и адгезивных свойств белков и липидов (гликосфинголипидов) плазматической мембраны с различными молекулами экстраклеточного матрикса (Bradke and Dotti, 2000): Одним из важных пластических материалов для построения компонентов плазматической мембраны являются ганглиозиды (Masco et al., 1991). Так, например, моносиалоганглиозид GM1 является одним из факторов, который модулирует рост и дифференцировку нейральных клеток нейробластом (Wu and Ledeen, 1991). Экспозиция культивируемых нейральных клеток к GM1 существенна для индукции образования отростков нейральными клетками и их роста (Harel and Futerman, 1993; Schwarz et al., 1995). Было также предположено, что ганглиозиды имеют потенцирующий эффект на ряд нейротрофических факторов. Так, доказано, что моносиалоганглиозид GM1 функционально модулирует взаимодействие между А—тирозинкиназными рецепторами к фактору роста, нервов и белком p75NGFR, а также В-тирозинкиназным рецептором и нейротрофическим фактором BDNF (Mutoh et al., 1993; Ferrari et al., 1995; Pitto et al., 1998). Следует отметить, что семейство тирозинкиназных рецепторов является ключевым фактором не только для выживания развивающихся рецепторов, но и для аксоногенеза (Faux et al., 2007). Развитие отростков-нейральными клетками и/или аксонов нейронами включает реорганизацию цитоскелета. Одними из факторов, участвующими в реорганизации цитоскелета нейральных клеток- являются-белки, ассоциированные с микротрубочками - БАМ (microtubule-associated proteins). Так, например, фосфорилированная изоформа БАМ - БАМ-1Б поддерживает микротрубочки на конце растущего отростка в динамично нестабильном состоянии. Культивирование нейральных клеток, полученных из дорсальных ганглиев мышей, дефицитных по этой изоформе БАМ, позволило зарегистрировать нарушение образования отростков (Gonzalez-Billault et al., 2002). Интересно отметить, что у мышей, мутантных по БАМ, существуют факторы, позволяющие компенсировать отсутствие этого важного белка, что; не смотря на нарушение в образовании отростков, тем не менее позволяет зарегистрировать их элонгацию. В" связи с этим феноменом был выявлен белок первого типа, связывающийся с концом отростка и позволяющий нейральной клетке в отсутствие БАМ продолжить элонгацию отростка (Jimenez-Mateos et al., 2005). Белки, которые контролируют реорганизацию микротрубочек в растущем отростке, находятся под контролем определённых киназ, которые фосфорилируют их и, таким образом, активируют. Одной из таких киназ является киназа 33 гликоген синтазы (glycogen synthase kinase Зр), которая осуществляет фосфорилирование БАМ белков в процессе аксоногенеза, что было продемонстрировано in vitro на первичных сенсорных нейронах эмбриона циплёнка. Ингибирование этой киназы нарушало аксоногенез сенсорных нейронов (Owen and Gordon-Weeks, 2003). Ранее считалось, что тирозинкиназа АЫ участвует, главным образом, в процессах, связанных с адгезией и миграцией клеток, однако, недавно было показано, что эта тирозинкиназа, фосфорилируя- ряд белков, регулирует полимеризацию актина и, таким образом; подвижность кончика растущего аксона при аксоногенезе (Lanier and Gertler, 2000). Поскольку образование отростка-(аксона) взаимосвязано с движением- растущего кончика (по подложке, а в условиях in vivo во внеклеточном матриксе), то неудивительно; что факторы, (киназы), которые контролируют клеточную миграцию, например, глиальных клеток, могут также регулировать аксоногенез в нейральных клетках (Liedtke et al., 2007). При движении в глиальной клетке комплекс АТФ-Ф-актин-миозин является ключевым ансамблем, который участвует в осуществлении акта миграции определённого участка цитоплазма-ламеллоподии. Нейральные клетки также экспрессируют повышенное количество аргинин-киназы поскольку подвергаются неоднократному делению в результате митоза. В нейронах при аксоногенезе аргинин-киназа концентрируется в растущем кончике отростка и в кончиках выбрасываемой нейроном филоподии (Wang and Esbensen, 2007). Как известно, семейство циклин-зависимых киназ контролирует дифференцировку клеток.
Анализ активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной
Определение активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, проводили в нейральных клетках линии NB-1 человека. После удаления культуральной жидкости из чашек Петри клетки снимали резиновым шпателем, добавляли в чашку охлаждённый фосфатно-солевой буфер (рН 7,0), в который также был добавлен, непосредственно перед использованием, ЭДТА в конечной концентрации 0,5 М и фенилметилсульфонилфлюорид в конечной концентрации 0,2 М. Клеточную взвесь пипетировали и переносили в центрифужные пробирки (Sarsted) объёмом 15 мл. Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин, после чего удаляли надосадочную жидкость, а клеточный комок подвергали гомогенизации. Концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Активность сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, определяли против смеси ганглиозидов (конечная конц. 0,5 мг /мл). Общий объём реакционной смеси составлял 100 мкл и состоял из следующих компонентов: Тритон Х-100 (0,1%), бычий сывороточный альбумин (1 мг/мл) и 0,025 М ацетат натрия (рН 4,6) и образца, содержащего фермент (50 мкл вклучительно). После инкубации при 37С (при умеренном встряхивании) в пробирки добавляли 50 мкл метапериодата натрия (0,6%), энергично перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. После инкубации с метапериодатом натрия в пробирки добавляли арсенит натрия объёмом 0,5 мл (10%). Далее добавляли 1,5 мл ТБК, энергично перемешивали и немедленно переносили в кипящую воду на 15 мин, после чего немедленно охлаждала в воде, добавляли циклогексан объёмом 1,5 мл, энергично перемешивали с помощью встряхивателя и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. По окончании центрифугирования отбирали верхнюю фазу (70 мкл) и измеряли при длине волны 549 нм (Hitachi). Расчёт активности фермента производили по методу предложенному ранее (Hasegawa et al., 2001). Активность выражали в единицах на мг белка -ед./мг белка.
Определение активности лизосомальной сиалидазы в клетках клонов рабдомиосаркомы, РА-23 проводили по следующей схеме: опухолевые клоны (п=10) гомогенизировали в калий фосфатном буфере (10 мМ) при +4C: 0,25 M сахароза, 1 мМ ЕДТА. Фенилметилсульфонилфлкюрид в концентрации 0,2 мМ был добавлен непосредственно перед гомогенизацией. Гомогенат цетрифугировали при 3,000 об/мин в течение 10 мин. Далее супернатант отделяли (фракция I) и 1 мл полученной фракции I пипетировали и центрифугировали в течение часа при 40 т. об/мин при +4С. Супернатант отбрасывали, а полученный осадок (фракция II) дополнительно пипетировали в небольшом объёме (220 мкл) в буфере для гомогенизации. Активность лизосомальной сиалидазы определяли против 4-метилумбеллиферил-М-ацетилнейраминовой (4-МФ-NANA) кислоты в конечной концентрации 2 мМ. Реакционная смесь, конечный объём которой составлял 200 мкл, также содержала ацетат натрия (рН 4,6 или 5,5). После инкубации при 37С в течение 1-2 ч реакцию останавливали добавлением 2,5 мл глицинового буфера (0,25 М глицин-NaOH, рН 10,4) и проводили флуорометрическое измерение продукта реакции 4-умбеллиферона (450 нм). Активность выражали в единицах на мг белка — ед./мг белка.
После удаления культуральной жидкости из чашек Петри нейральные клетки снимали резиновым шпателем, добавляли в чашку охлаждённый фосфатно-солевой буфер (рН 7,0), в который также был добавлен, непосредственно перед использованием, ЭДТА в конечной концентрации 0,5 М и фенилметилсульфонилфлюорид в конечной концентрации 0,2 М. Клеточную взвесь пипетировали и переносили в центрифужные пробирки (Sarsted) объёмом 15 мл. Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин, после чего удаляли надосадочную жидкость, а клеточный комок подвергали гомогенизации. Концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Активность ацетилхолинэстеразы определяли по методу Эллмана (Ellman et al., 1961).
Метастатический потенциал клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА—23 крыс при воздействии противоопухолевых факторов
В виду изменений способности к метастазированию (метастатического потенциала) клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 (рис. 16) представлялось важным также ответить на вопрос: сопровождается ли изменение метастатического потенциала изменением биохимических характеристик опухолевых клеток. Лизосомальная сиалидаза и сиалидаза, ассоциированная с плазматической мембраной, являются ферментами, участвующими в гидролизе олигосахаридов и гликосфинголипидов (ганглиозидов), соответственно, модулируя- состав гликопротеинов и гликосфинголипидов клеточной мембраны, и изменяя, таким образом, способность опухолевых клеток к метастазированию и инвазии (см. разд. 1.2). В связи с этим на активность лизосомальной сиалидазы и сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), были проанализированы опухолевые клоны, контрастные по способности к метастазированию. На предмет выявления сиалидазной активности были протестированы три клона из контрольной выборки и три клона, извлечённых из лёгких животных, подвергшихся обработке цитостатиком циклофосфаном.
Как видно из табл. 1, активность лизосомальной сиалидазы в клонах с низким метастатическим потенциалом варьировала в грубой фракции (фракция I) от 0,903 до 1,297 ед. на мг белка и в среднем составляла 1,100±0,284 ед. на мг белка. Активность лизосомальной сиалидазы в клонах с высокой способностью к метастазированию в грубой фракции (фракция I) варьировала от 0,602 до 0,950 ед. на мг белка и в среднем составила 0,818±0,271 ед. на мг белка, что достоверно не отличалось от среднего показателя, выявленного во фракции I, полученной из клонов с низким метастатическим потенциалом (р 0,05). Дальнейшее исследование обогащенной фракции (фракция И), выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, выявило, что средний показатель активности лизосомальной сиалидазы составил 1,48±0,12 ед. на мг белка, тогда как активность лизосомальной сиалидазы, зарегистрированная во фракции II, выделенной из клонов с высоким метастатическим потенциалом, в среднем составляла 2,70+0,29 ед. на мг белка, что значимо отличалось от среднего показателя (фракция II) среди клонов с пониженной способностью к метастазированию \ (р 0,01). Следует отметить, что активность лизосомальной сиалидазы в мышечной ткани как у крыс, не подвергшихся воздействию цитостатиков, так и у крыс, которые подверглись воздействию циклофосфана- в среднем, не превышала 0,983±0,142 и 0;979±0;197 ед: на мг белка, соответственно;
Поскольку были выявлены различия по активности лизосомальной сиалидазы: в контрастных по способности к метастазированию (метастатическому потенциалу) клетках опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 (табл. 1); мы протестировали эти же клоны на; предмет активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ). Результаты показывают (табл. 2), что в; клонах; с повышенной способностью к метастазированию (высоким метастатическим; потенциалом) и= в клонах с пониженной; способностью к метастазированию активность САПМ различалась и среди выборки клонов Dl, D2 и Ш»бьиш выше (1,040±0,187 ед. на мг белка) по сравнению? со; средним показателем, зарегистрированным для выборки клонов С Г, С2 и СЗ (0,930±0Д67 ед: на мг белка). Несмотря на тенденцию к повышению активности САПМ среди клонов Dl, D2 и D3 следует отметить, что достоверных различий между исследованными показателями активности САПМ выявить не удалось (р 0,05). Активность САПМ в мышечной ткани как у крыс, которые не подвергались воздействию цитостатиков, так и у крыс, которые подверглись воздействию циклофосфана, составила 0,901±0,282 и 0,911±0,165 ед. на мг белка, соответственно.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что генотоксические факторы приводят к существенному снижению способности опухолевых клеток к метастазированию (метастатическому потенциалу). Пониженная способность к метастазированию ассоциирована с изменением морфологических (повышение частоты опухолевых клеток с нарушением морфологии ядер) и биохимических (повышенная лизосомальная активность) характеристик опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс.
Для того, чтобы исключить воздействие циклофосфана на сиалидазную активность был проведён эксперимент для получения клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом без воздействия каких-либо генотоксических факторов. Для этой цели клоны опухолевых клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс были подвергнуты отбору на понижение и повышение частоты встречаемости клеток с такими нарушениями морфологии ядер как интерфазные мосты (рис. 21).
Отбор опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс на повышение и понижение частоты опухолевых клеток с нарушением структуры ядер
После проведения 5-ти циклов отбора на повышение и отбора на понижение ЧКИМ клеточные популяции РА-23 были специально протестированы на метастатический потенциал (табл. 3). Видно, что популяции клеток с повышенной ЧКИМ имели достоверно меньший метастатический потенциал, чем популяции клеток с пониженной ЧКИМ (Р 0,05, п=5). При этом, различия по величине метастатического потенциала между линиями с высокой и низкой ЧКИМ были более, чем пятикратными.
Среднее значение метастатического потенциала клеточной популяции с повышенной ЧКИМ в субштамме РА-23 составило 28.6±7.5, а значение метастатического потенциала клеточной популяции этого субштамма с пониженной ЧКИМ составило 107.1±23.9:
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о снижении метастатического потенциала в ходе отбора клонов РА-23 на повышение частоты встречаемости в них клеток с интерфазными мостами.
В клонах с высоким и низким метастатическим потенциалом мы исследовали патофизиологические изменения в опухолевых клеток на примере встречаемости патологических митозов. В клонах (п=5) с высоким метастатическим потенциалом и в клонах (п=5) с низким метастатическим потенциалом исследовали следующие формы патологических митозов: мосты в ана- и телофазе (рис. 36), мосты и отставания (хромосом и их фрагментов) в ана- и телофазе, отставания хромосом и их фрагментов в ана-и телофазе, метафазы с отставанием хромосом (метафазы с хромосомой или группой хромосом, отставших от метафазной пластинки) (рис. 37), метафазы с разбросанными хромосомами (К-метафазы) (рис. 38) и многополюсные ана-и телофазы.
Частоты клеток с интерфазными мостами и частоты патологических ана- и телофаз в выборке, представляющей эти клоны, указаны на рис. 39 - 41. Средняя частота встречаемости клеток с интерфазными мостами в выборке из 5-ти клонов с высокой способностью к метастазированию составила 0,5%, а аналогичный показатель в выборке из 5 клонов с низкой способностью к метастазированию - 18,5% (Р 0,001). Клоны с высоким метастатическим потенциалом отличались от клонов с низким метастатическим потенциалом достоверно меньшей частотой ана- и телофаз с мостами и достоверно меньшей частотой ана- и телофаз, в которых мосты и отставания хромосом и их фрагментов встречались одновременно (рис. 39 и 40) (Р 0,001 в обоих случаях, различия аргументированы U-критерием Вилкоксона-Мана-Уитни). На рис. 42 - 43 представлены зависимости частот клеток с интерфазными мостами от частот метафаз с разбросанными хромосомами (колхициноподобные метафазы) (рис. 42) и метафаз с отставшимЧастоты встречаемости метафаз с отставанием хромосом (б) в клонах рабдомиосаркомы РА-23 с низкой (о) и высокой () способностью к метастазированию. По оси абсцисс - ЧКИМ, %; по оси ординат - частота метафаз с отставаниями хромосом и их фрагментов (б), % метастазированию характеризуются значительно меньшими частотами метафаз с разбросанными хромосомами и метафаз с отставанием хромосом и их фрагментов по сравнению с клонами с высокой способностью к метастазированию (Р 0,01 и Р 0,001, соответственно, различия аргументированы U-критерием Вилкоксона-Мана-Уитни).
Частота встречаемости многополюсных, в том числе трёхполюсных, ана- и телофаз в клетках клонов с низким метастатическим потенциалом была достоверно выше по сравнению с клонами с высоким метастатическим потенциалом (рис. 41; Р 0,001, различия аргументированы U-критерием Вилкоксона-Мана-Уитни). и хромосомами (рис. 43). Видно, что клоны с низкой способностью к
