Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Особенности компенсаторных и восстановительных процессов в мозге при судорожных состояниях 13
1.2. Влияние гипоксии/ишемии, а также адаптации к гипоксии на проявление судорожной активности разного генеза 26
2. Материалы и методы исследований 41
2.1. Биологический материал 41
2.2. Экспериментальные модели 41
2.3. ВЭЖХ моноаминов в разных структурах мозга 44
2.4. Цитофотометрическое определение содержания РНК в системе нейрон-глия 46
2.5. Морфометрия 49
2.6. Определение содержания медиаторных аминокислот в нервной ткани 50
2.7. Получение ядерных фракций клеточных структур мозга и экстракция из них гистонов 52
2.8. Фракционный анализ ядерных гистонов мозга с помощью ВЭЖХ 53
2.9. Статистический анализ цифрового материала 54
3. Результаты собственных исследований 55
3.1. Динамика восстановления внутриклеточных изменений, возникающих после судорог в системе нейрон-глия МА-ергических ядер мозга у высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных 55
3.2. Влияние модуляции активности МА-ергических систем после судорог на проявление судорожной готовности и восстановление содержания РНК в клеточных структурах мозга 65
3.2.1. Влияние противосудорожных препаратов и других веществ медиаторного типа действия на содержание моноаминов в ЦНС высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных 65
3.2.2. Влияние модуляции активности МА-ергических систем в пост судорожный период на изменения содержания РНК в нейронах и сателлитных глиоцитах различных структур мозга 71
3.2.3. Фракционный состав ядерных гистонов мозга при модуляции активности МА-ергических систем в постсудорожный период 80
3.3. Роль моноаминергических и аминоацидергической систем при адаптации к гипоксии животных с разными индивидуально-типологическими особенностями 82
3.3.1. Влияние адаптации к гипоксии на метаболизм моноаминов в ЦНС животных с высокими и низкими адаптивными возможностями 82
3.3.2. Содержание медиаторных и нейромодуляторных аминокислот в ЦНС животных, обладающих индивидуальными адаптивными возможностями 89
3.4. Влияние адаптации к гипоксии на проявление аудиогенной судорожной готовности и динамику восстановления содержания РНК в клеточных структурах ЦНС в постсудорожный период 93
3.5. Эффективность влияния противосудорожных препаратов на животных с разными адаптивными возможностями 100
3.6. Динамика изменения судорожной готовности в период деадаптации и ее влияние на восстановление содержание РНК в системе нейрон-глия МА-ергических ядер мозга после судорог 106
4. Заключительное обсуждение результатов исследований 113
Выводы 135
Практические рекомендации 137
Список литературы 138
- Особенности компенсаторных и восстановительных процессов в мозге при судорожных состояниях
- Влияние гипоксии/ишемии, а также адаптации к гипоксии на проявление судорожной активности разного генеза
- Экспериментальные модели
- Динамика восстановления внутриклеточных изменений, возникающих после судорог в системе нейрон-глия МА-ергических ядер мозга у высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Функциональное перенапряжение ЦНС,
обусловленное судорожным состоянием, сопровождается истощением
энергетических и пластических ресурсов клеточных структур мозга, что
снижает его репарационные возможности в постсудорожный период и
нередко вызывает гибель нейронов [44, 48, 57, 177, 204]. При этом тяжесть и
объем повреждений мозга определяются не только судорожным припадком,
но и в значительной степени вторичными нарушениями, которые развивают
ся в ЦНС после судорог [194, 132, 261, 291, 331]. Если эти нарушения
сохраняются длительное время, то они часто приводят к срыву компенса
торно-восстановительных механизмов и служат патогенетической основой
для повторных судорог [177, 257, 313]. В связи с этим существует понятие
«постсудорожный синдром» [154]. Таким образом, при судорожных состоя -
ниях может возникать "порочный круг", когда постсудорожные нарушения
в ЦНС становятся дополнительным провоцирующим фактором, повышаю
щим судорожную готовность.
Поэтому при коррекции судорожных состояний необходимо решать две взаимосвязанные задачи: снизить судорожную готовность организма и повысить репарационные возможности мозга после судорожного припадка. Первая задача часто решается с помощью многочисленных противосудорож-ных препаратов, мишенью для которых являются тормозные механизмы. Эффективность такой коррекции контролируется инструментальными методами исследования, а в случае необходимости можно заменить препарат, изменить его дозу или комбинацию с другими препаратами. При решении второй задачи достаточно сложно объективно оценить влияние конкретных противосудорожных средств на характер восстановления структурно-метаболических изменений, возникающих в мозге человека после судорог. В связи с этим большинство авторов связывают перспективу исследований таких механизмов с изучением экспериментальной эпилепсии на живот-
ных, которое позволяет понять глубинные патофизиологические процессы [186,250,261296,298].
В настоящее время глубоко и всесторонне изучены механизмы запуска и реализации судорожных состояний разного генеза, а также роль медиатор-ных систем в этих процессах. Противосудорожные препараты, как и другие вещества медиаторного типа действия, изменяют характер межмедиаторных взаимоотношений в ЦНС. При этом активируя тормозную ГАМК-ергичес-кую систему, они по-разному модулируют баланс активности МА-ергичес-ких систем [53, 205, 351].
Вместе с тем, результаты исследований свидетельствуют о том, что состояние МА-ергических механизмов существенно сказывается на внутриклеточном метаболизме мозга [ 90, 39-42, 162], характер которого в значительной мере определяет формирование восстановительных процессов в постсудорожный период. Поскольку тяжесть функционального нарушения зависит от степени повреждения клеточных структур, можно полагать, что модуляция МА-ергических механизмов, обусловленная введением разных противосудорожных препаратов, неодинаково влияет на характер восстановления внутриклеточных изменений, возникающих после судорог.
Результаты действия этих препаратов в основном оценивают по их способности снижать судорожную готовность. Однако мало изучена роль противосудорожных средств в реализации компенсаторно-восстановительных процессов в клеточных структурах мозга после судорог разного генеза. Решение этого вопроса важно для выяснения механизмов, обеспечивающих устойчивость физиологических функций организма после судорог, и разработки способов коррекции не только судорожной готовности, но и репарационных возможностей ЦНС.
В связи с этим одна из актуальных задач восстановительной медицины заключается в индивидуальном подборе противосудорожных мероприятий, которые не только снижают судорожную готовность организма, но и способствуют максимально эффективному восстановлению структурно-метаболи-
7 ческих изменений, возникающих в мозге после судорожного припадка [250, 298].
Многочисленными исследованиями доказано травмирующее действие
цереброваскулярной ишемии в постэпилептическом повреждении мозга, а
также связь между устойчивостью организма к гипоксии и его судорожной
готовностью [4, 7, 47, 113, 132, 134, 144, 154]. Поэтому одним из способов
нефармакологической коррекции многих функциональных нарушений
является адаптация организма к гипоксии. Хотя фундаментальные основы
этой проблемы хорошо описаны в ряде монографий и обзорных статей [6,
88, 119, 137, 142, 153, 167], однако не изучено влияние МА-ергических
механизмов на восстанов- ление внутриклеточных нарушений в ЦНС,
возникающих после судорог в зависимости от индивидуальной
устойчивости организма к гипоксии, особен- ностей адаптации к ней и деадаптации.
Цель исследования
Изучить роль МА-ергических систем в проявлении компенсаторно-восстановительных изменений после судорог разного генеза в системе нейрон-глия ЦНС у животных с неодинаковой чувствительностью к гипоксии, особенностями адаптации к ней и деадаптации.
Задачи исследования
Изучить динамику восстановления внутриклеточных изменений, возникающих после судорог разного генеза в системе нейрон-глия МА-ергических ядер мозга у высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных.
Оценить влияние противосудорожных препаратов (фенитоина и габапентина) на состояние МА-ергических систем ЦНС у животных с разными индивидуально-типологическими особенностями.
3. Сравнить влияние фенитоина и габапентина, а также других веществ
медиаторного типа действия на динамику восстановления после судорог
8 содержания РНК в цитоплазме нейронов МА-ергических ядер мозга и их сателлитных глиоцитах у животных с разной чувствительностью к недостатку кислорода.
Изучить состояние МА-ергических систем у животных, обладающих разными индивидуальными возможностями адаптации к гипоксии.
Оценить эффективность противосудорожных препаратов и их влия -ние на восстановление внутриклеточных процессов после судорог в зависимости от степени адаптированности организма к гипоксии.
Изучить индивидуально-типологические особенности деадаптации, проявления на этом фоне судорожной готовности и восстановления постсудорожных изменений в ЦНС.
Научная новизна работы
Впервые установлено, что модуляция активности МА-ергических механизмов после судорог значительно изменяет характер компенсаторно-восстановительных процессов в клеточных структурах мозга. Получены новые экспериментальные данные, позволившие выяснить роль МА-ергических систем в восстановлении внутриклеточных изменений, возникающих после судорог разного генеза, конкретизировать при этом регионально-специфические особенности цитохимических перестроек в системе нейрон-глия, а также оценить постсудорожную уязвимость структур разной ергич-ности, ее связь с индивидуальной устойчивостью организма к гипоксии, особенностями адаптации к ней и деадаптации.
Приведены прямые доказательства того, что подавление МА-ергических механизмов в постсудорожный период лимитирует реализацию структурно-метаболических перестроек, лежащих в основе репарационных процессов в клеточных структурах мозга, а их активация повышает интенсивность восстановления системы нейрон-глия. Причем снижение и увеличение уровня ДА в ЦНС после судорог приводят к диаметрально противоположным изменениям содержания HI-фракции ядерных гистонов в стволе
9 мозга. Это свидетельствует о том, что дисбаланс МА-ергических механизмов в постсудорожный период вызывает глубокие внутриклеточные изменения и, по-видимому, сказывается не только на процессах трансляции, но и транскрипции. Поэтому фармакологическая коррекция судорожного состояния, проведенная без учета этих изменений, может стать причиной новых функциональных нарушений.
Впервые показано, что снижение судорожной готовности с помощью противосудорожных препаратов не всегда сопровождается эффективным восстановлением внутриклеточных изменений, возникающих в центральных МА-ергических ядрах мозга после судорог. Фенитоин, введенный после судорог, повышает интенсивность восстановления содержания РНК в системе нейрон-глия МА-ергических ядер у ВУ и НУ к гипоксии животных. Габапентин, уменьшающий содержание ДА и СТ в ЦНС, не способствует интенсивному восстановлению внутриклеточных процессов, а иногда усугубляет характер сдвигов, имевший место через 24 часа после судорог. Кроме того, у хорошо адаптированных к гипоксии животных фенитоин и габапентин предотвращают длительное снижение содержания РНК в системе нейрон-глия, возникающее после судорог. У животных с низкими адаптивными возможностями этого не происходит. Таким образом, восстановление внутриклеточных процессов мозга в постсудорожный период зависит не только от исходной устойчивости организма к гипоксии, но и от особенностей адаптации к ней.
У адаптированных к гипоксии ВУ и НУ животных выявлен гетеро-хронный характер деадаптации. При этом направленность и выраженность цитохимических изменений в нейронах МА-ергических ядер мозга и их сателлитных глиоцитах зависят не только от того, в какой период деадаптации возникает судорожный припадок, но и от индивидуально-типологических особенностей организма.
10 Теоретическое и практическое значение работы
Теоретическое значение работы состоит в формировании новых
фундаментальных представлений о роли МА-ергических механизмов в
восстановлении структурно-метаболических нарушений, возникающих в
ЦНС после судорог; выяснении зависимости этих процессов от индивидуаль
но-типологических особенностей организма, его устойчивости к гипоксии,
особенностей адаптации к ней и деадаптации, что не только вносит вклад в
концептуальные основы нейрофизиологии и фундаментальной медицины, но
и открывает новые возможности поиска и разработки способов
нефармакологической коррекции функциональных нарушений,
обеспечивающих активацию компенсаторно-восстановительных механизмов ЦНС в постсудорожный период.
Практическое значение работы: результаты исследований показали, что эффективное восстановление внутриклеточных процессов после судорог не может быть реализовано любыми противосудорожными препаратами, снижающими судорожную готовность. Дисбаланс активности МА-ергических механизмов, нередко возникающий при введении этих препаратов и других веществ медиаторного типа действия, по-разному сказывается на компенсаторно-восстановительных процессах в ЦНС после судорог и зависит от индивидуально-типологических особенностей организма. Поэтому при назначении указанных препаратов в каждом конкретном случае следует учитывать не только их прямое предназначение - снижать судорожную готовность, но и модулирующее влияние на МА-ергические системы, что в значительной мере предопределяет реализацию компенсаторно-восстанови -тельных возможностей клеточных структур мозга после судорожного припадка.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Характер восстановления внутриклеточных изменений после судорожного припадка зависит от индивидуальной устойчивости организма к гипоксии.
Состояние МА-ергических механизмов в постсудорожный период может лимитировать восстановление внутриклеточных изменений в ЦНС после судорог.
Модуляция уровня ДА в ЦНС после судорог сказывается на фракционном составе ядерных гистонов мозга.
Снижение судорожной готовности с помощью фенитоина и габапентина не всегда способствует эффективному восстановлению внутриклеточных процессов в постсудорожный период.
Эффективность исследованных противосудорожных препаратов у адаптированных к гипоксии животных зависит от индивидуально-типологических особенностей организма.
В процессе деадаптации судорожная готовность, а также восстановление внутриклеточных процессов в ЦНС у ВУ и НУ животных изменяются гетеро-хронно в соответствии с изменением их чувствительности к гипоксии.
Эффективное восстановление внутриклеточных процессов после судорог не может быть реализовано без учета модулирующего влияния противосудорожных препаратов на состояние моноаминергических систем.
Апробация результатов исследований
Результаты исследований неоднократно доложены и обсуждены на заседаниях кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека ГОУ ВПО РГУ имени С.А.Есенина при ежегодных отчетах аспирантов (2006-2009 гг.), а также на X Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации», М., 2001; III Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», М., 2002; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, М., 2004; XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, М., 2007; VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», М., 2007; VI Сибирском физиологическом съезде, Барнаул, 2008.; V Международном конгрессе «Вое-
12 становительная медицина и реабилитация», М., 2008; IX Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», М., 2008.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 169 страницах, объем основного текста - 137 страниц, объем библиографического списка - 32 страниц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы, который включает 177 ссылок, изложенных кириллицей и 208 - латиницей. Текст диссертации иллюстрирован 23 рисунками и 12 таблицами.
13 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Особенности компенсаторных и восстановительных процессов в мозге при судорожных состояниях
Понимание фундаментальных основ компенсаторно-восстановительных механизмов мозга при его повреждении является наиболее сложной и актуальной задачей восстановительной медицины и неврологии. В связи с этим на одной из сессий общее собрание Российской академии медицинских наук приняло решение о создании программы по нейронаукам, состоящей из 6 блоков, один из которых предусматривает изучение адаптивных и компенсаторно-восстановительных процессов мозга.
Многочисленные экспериментальные и клинические исследования показали, что повреждения мозга часто сопровождаются структурно-функциональной реорганизацией, в результате чего происходит полное или частичное восстановление функций. Первые представления об этих процессах были сформированы благодаря классическим работам И.П. Павлова [99], П. К. Анохина [12], Э. А. Асратяна [19] и др. Существенный вклад в решение этой проблемы внесла Н.П.Бехтерева [27], доказавшая полифункциональность одних и тех же структур мозга. Стал понятным патогенез многих нарушений в ЦНС, когда повреждение одной структуры мозга влечет за собой целый ряд функциональных расстройств. Все это помогло выяснить глубинные механизмы и особенности компенсаторно-восстановительных процессов при различных видах повреждений мозга.
Одним из наиболее тяжелых и распространенных неврологических заболеваний, давно изучаемое врачами и нейрофизиологами, является судорожное состояние. Согласно информации ВОЗ в мире насчитывается около 40 млн. человек, страдающих эпилепсией. В Европе и США ежегодная забо -леваемость составляет по разным данным свыше 50 человек на 100 000 жителей [55, 59, 155]. Причем за последние 5 лет заболеваемость эпилепсией увеличилась на 38,3%. Согласно концепции В.А.Карлова [59], основой любых пароксиз-мальных состояний является компенсаторное напряжение гомеостатических механизмов. При срыве компенсации возникают припадки, а их прекращение обусловлено включением стабилизирующих механизмов, которые мобилизуют компенсаторные и восстановительные резервы организма. Существует мнение о том, что в процессе судорожного припадка наблюдается гиперметаболизм в области эпилептического очага и гипометаболизм в постсудорожный период [340]. При этом судорожные состояния истощают энергетические и пластические ресурсы клеточных структур мозга, что делает их наиболее уязвимыми в постсудорожный период. Поэтому основные усилия клинических и фундаментальных исследований направлены на выяснение механизмов, обеспечивающих активацию в постсудорожный период репарационных процессов, направленных на быструю ликвидацию функциональных повреждений мозга, что значительно предотвращает возникновение повторных судорог.
Любые нарушения функций мозга, возникающие при неврологических заболеваниях, обусловлены главным образом нарушениями в деятельности нейромедиаторных систем. Многочисленные исследования этого вопроса сформировали фундаментальные представления о том, что одной из основных причин возникновения судорожного состояния являются функциональные нарушения между тормозными и возбуждающими механизмами. При этом важная роль в патогенезе эпилептических судорог отводится глутамат-и ГАМК-ергической системам, взаимоотношения которых нередко предопределяют характер многих неврологических заболеваний.
Повышенная судорожная активность стволовых структур мозга определяется высоким уровнем активности глутаматергической системы и сниже -нием системы ГАМК [216, 307, 355]. При аппликации возбуждающих аминокислот на кору мозга или введении их в желудочки мозга происходит перевозбуждение нейронов и формирование эпилептической активности [159, 217]. Аналогичные изменения возникают и при электрической стимуляции глутаматергических проекций. [223]. Избыточная активация глутаматных рецепторов также сопутствует развитию некоторых форм эпилепсии и других неврологических заболеваний [100]. Вместе с тем на глутаматных рецепторах обнаружены участки, тормозящие их функцию и обеспечивающие противосудорожный эффект [305]. Эти участки имеют сродство к барбитуратам. Поэтому противосудорожное применение последних связано с их противоположным эффектом действия на ГАМК- и глута-матергические рецепторы.
На моделях различных видов судорог получено большое количество результатов исследований, свидетельствующих о значительном противосудо-рожном действии антагонистов NMDA-рецепторов. Установлено, что повышение порога развития эпилептиформной активности в поле СА1 срезов гип-покампа крыс линии К-М связано с особенностями входа Са ", опосредован-ного активацией NMDA-рецепторов или L-типом потенциалзависимых Са -каналов [126]. Полученные результаты указывают на решающее значение инактивации кальциевых каналов для подавления острой генерализованной эпилептической активности [94]. Противосудорожные эффекты блокаторов кальциевых каналов (нимотопа и нифедипина) в условиях применения конвульсантов с различными механизмами провокации эпилептической активности свидетельствуют о том, что каждый препарат имеет зависимый от дозы характер и наиболее выражен в случае коразоловых судорог.
Экспериментальными исследованиями установлено, что у крыс с генетически детерминированной аудиогенной судорожной готовностью изменен фоновый уровень медиаторов в различных отделах мозга [109, ПО, 300]. Для аудиогенной эпилепсии характерен дефицит ГАМК-ергической передачи, сопровождающийся высокой возбудимостью [234, 280]. Причем через 1 мес. после судорожного і припадка у крыс линии К-М обнаружено достоверное уменьшение числа ГАМК-ергических клеток в слуховых релейных ядрах мозга [385]. Важное значение имеет не только уровень тех или иных нейротрансмиттеров, но и характер межмедиаторных взаимоотношений [374]. Выявлена прямая связь между судорожной активностью и повышением в гиппокампе внеклеточной концентрации глутамата, ГАМК и дофамина, но не серотонина [307].
Важную роль в реализации судорожных реакций и формировании постсудорожных восстановительных процессов мозга имеют генетически детерминированная плотность дофаминергических рецепторов [199, 361]. Различные отделы мозга крыс WAG/Rij с генетически детерминированной absence эпилепсией имеют более низкую плотность D-1 рецепторов, чем крысы Wistar. С другой стороны, у крыс WAG/Rij в корковой области плотность рецепторов D-2 выше, а в САЗ - области гиппокампа ниже, чем у Wistar. Эти результаты свидетельствуют о том, что нарушения дофаминергических механизмов ЦНС у крыс линии WAG/Rij могут служить патогенетической основой судорожных состояний.
Влияние гипоксии/ишемии, а также адаптации к гипоксии на проявление судорожной активности разного генеза
Эпилепсия и ишемия - весьма распространенные и взаимосвязанные нарушения ЦНС. В связи с этим, одна из актуальных задач фундаментальной и прикладной неврологии заключается в изучении механизмов влияния этих двух форм патологии друг на друга. Особенно актуальны вопросы, связанные с пониманием механизмов провокации судорожных состояний и эпилепсии, возникающих после ишемического повреждения мозга, а также процессов, лежащих в основе их предотвращения и эффективного лечения. Известно, что первые постсудорожные повреждения ЦНС, обусловленные ишемическими процессами, занимают от 2 до 33% мозга, а провоцируемые ими последующие повреждения до 67,5% [212].
В настоящее время хорошо изучена травмирующая роль цереброваскулярной ишемии при эпилептических судорожных припадках [8, 113, 132, 177, 187, 273, 324]. Многие авторы характеризуют эпилепсию как свободнорадикальную патологию [79]. Клинико-биохимические и экспе риментальные исследования показали, что эпилепсия в значительной мере связана с угнетением функционирования антиокислительной системы и ее ключевого звена - супероксиддисмутазы [79, 85, 88]. Это приводит к гипер активности процессов перекисного окисления, образованию свободных радикалов и может завершаться гибелью клеток. В нейронах наиболее уязвимыми мишенями при окислительном стрессе являются мембранные белки. Аналогичное истощение антиоксидантных систем и накопление в мозге продуктов перекисного окисления липидов происходит при длительной ишемии [30, 31, 50, 86-88]. Это сопровождается деполяризацией клеточных мембран и высвобождением возбуждающих нейромедиаторов — глутамата и аспартата, что оказывает дополнительный нейротоксический эффект и повышает судорожную готовность [131].
Результаты многочисленных исследований подтверждают современную концепцию о том, что постэпилептические повреждения мозга связаны с ишемическими процессами [183,245, 336, 376-378]. Установлено, что даже в пределах одного отдела мозга имеются структуры, неодинаково чувствительные к гипоксии, что коррелирует с тяжестью их повреждения после судорог. Так, по степени уязвимости от судорог, структуры гиппокампа были выстроены авторами в следующий ряд: hilus dentate СА1, subiculum САЗ с САЗ a, b гранулярные клетки зубчатой извилины. Этот ряд совпадает с соотношением структур по уязвимости от гипоксии и гибелью нейронов от ишемии [238]. Гипокси-ишемическое состояние, возникающее при судорогах, сопровождается гибелью значительного количества нейронов в гиппокампе и других отделах мозга [381].
Установлено, что циркуляторные нарушения, возникающие при судорогах, сохраняются и , после их завершения, что существенно изменяет внутриклеточный рН в различных структурах мозга [369]. Через 5 мин после судорожного припадка рН уменьшается на 0,36 единиц. В дальнейшем он продолжает снижаться и через 20 мин уменьшается на 0,51 единицу. Постсудорожная репарация сопровождается восстановлением рН до уровня контроля, а затем превышает его. Повреждения, возникающие при нарушении внутриклеточного рН, могут служить патогенетической основой для повторных судорог, усугубляя их проявление [194, 239].
По мнению многих авторов, ишемию головного мозга, возникающую при судорогах, следует рассматривать в качестве ключевого патогенетического фактора, предопределяющего тяжесть постсудорожных повреждений. Кроме того, сосудистая патологии головного мозга, усугубляющаяся после предыдущего судорожного припадка, часто является основой для провокации повторных судорог. При этом цереброваскулярные нарушения сопровождаются дистрофическими изменениями стенок сосудов, которые ограничивают компенсаторно-восстановительные возможности кровообращения, усугубляют гипоксию мозга, что приводит к срыву репарационных- процессов [176, 214].
Даже после кратковременной тотальной ишемии значительно снижается порог судорожной готовности мозга, вплоть до появления судорожных пароксизмов [76]. Причем в группе высокопороговых крыс аудиогенные судорожные пароксизмы сохраняются длительное время после восстановления кратковременно нарушенной циркуляции. Так, 22,2 % этих животных через 7 суток после восстановления системного кровотока проявляют аудио-генные судорожные припадки, к 15-м суткам — 25,0%, к 30-м суткам 13,9%. К 45-м и 60-м суткам постишемического периода у 38,9% животных сохраня -ется высокая судорожная готовность, проявляющаяся в виде аудиогенной двигательной активности, а к 75-90-м суткам эти показатель нормализуются.
Аналогичные нарушения выявлены при изучении продолжительности сохранения повышенной судорожной готовности у животных на фоне другой модели ишемии [336]. После кетаминовой анестезии проводили сжатие груди, механически препятствуя сердцу качать кровь у крыс, не проявлявших аудиогенных судорог. После определенного времени глобальной ишемии циркуляцию восстанавливали стандартными методами реанимации. Оказалось, что 75 % крыс пережили 7-минутное сжатие груди. Через 24 часа после ишемии генерализованными судорогами на аудиогенный раздражитель реагировали 78 % крыс. Со временем восприимчивость к аудио-генным судорогам уменьшается, однако эти изменения были высоко индивидуальны у разных крыс. Одна крыса проявляла тонико-клонические судороги на звуковой раздражитель в течение более чем пяти месяцев.
Таким образом, проявление судорожной активности в постишемичес-кий период определяется не только степенью ишемии, но и индивидуально-типологической устойчивостью организма к недостатку кислорода. Установлено, что даже у животных одной линии при действии гипоксии наблюдаются разная динамика напряжения кислорода в мозге, а также морфологические и циркуляторные особенности [38, 175].
Кроме того, на фоне предварительной мозговой ишемии выявлена неодинаковая эффективность разных конвульсантов [276]. Для исследований были выбраны вещества, отличающиеся механизмами провокации судорожных реакций: ксикаин, пентилентетразол (PTZ), N-метил-D-аспартат (NMDA) и пикротоксин. Обезболенных крыс подвергали 10-минутной ишемии переднего мозга с помощью каротидной окклюзии и гипотонией (среднее артериальное давление до 30 mmHg). Животных будили через 6, 24 или 48 часов. Клонико-тонические судороги у активных крыс вызывали внутривенным введением четырех вышеуказанных препаратов. Контрольной группой служили животные, не подвергавшиеся судорогам. Установлено, что на фоне предварительной ишемии проявляются различия изменений конвульсивных порогов для исследованных препаратов.
Например, через 6 часов после ишемии порог для PTZ увеличивается на 86%. Для пикротоксина через 6 час не было обнаружено изменений пороговой дозы, но NMDA уменьшает ее на 70 %. Через 48 часов пороги для ксикаина и PTZ возвращаются к контрольному уровню, но порог NMDA увеличивается на 62 %.
Анализ полученных результатов показал, что постишемический период по-разному сказывается на уровне судорожной готовности, индуцируемой разными конвульсантами.
Известно, что новорожденный организм более устойчив к гипоксии, чем взрослый. Однако у 12-дневных мышей через 4 часа после наложения односторонней лигатуры на общую сонную артерию была выявлена корреляционная зависимость между острыми судорогами, вызванными гипоксией и морфологическими нарушениями головного мозга. Причем через 8 дней после судорог эти изменения сохранялись, а в некоторых отделах мозга усугублялись [183].
Экспериментальные модели
Животные. Исследования проведены на 373 половозрелых крысах-самцах, массой 160—180 г (возраст 3-4 мес), которых содержали в условиях вивария на стандартном рационе с 12-часовым режимом освещения. В зависимости от задач, эксперименты выполняли на животных линии Вистар или Крушинского-Молодкиной (К-М). Крысы линии К-М обладают высоким уровнем чувствительности к звуку и генетически предрасположены к аудиогенным судорожным припадкам. Все экспериментальные исследования проводили в дневное время суток в промежутке между 10 и 16 часами. Исследования выполнили в соответствии с приказами Минвуза СССР № 742 от 13.11.84 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».
Судорожные состояния вызывали с помощью введения крысам линии Вистар пентилентетразола (коразола, "Sigma" USA), а у крыс линии К—М с помощью звукового воздействия (звонка) силой 100 дБ.
Клонико-тонические судороги у животных линии Вистар вызывали в/в введением 1%-ного раствора пентилентетразола со скоростью 0,1 мл/мин с помощью инфузомата (Braun Perfusor Compact, Германия). Пороговую дозу коразола, необходимую для проявления судорог, определяли индивидуально для каждого животного и выражали ее в мг/кг массы тела. Эта величина отражает судорожную готовность экспериментального животного. Тяжесть судорог после введения пороговой дозы коразола оценивали по 5-балльной шкале: 1 — вздрагивание (кивание) головы; 2 — редкие (отдельные) клонические судороги всего тела; 3 — серия клонических судорог всего тела или клонус передних конечностей; 4 - тонико-клоничес 42 кие судороги с подъемом на задние конечности (поза "кенгуру"); 5 — клонико-тонические судороги с падением животного на бок. Животные контрольной группы получали эквивалентные объемы физраствора. После инъекции судорожной дозы препарата животных помещали в прозрачные плексиглазовые контейнеры 50 х 50 см и наблюдали за их индивидуальным поведением.
Одна из наиболее адекватных моделей для исследования судорожного
синдрома являются лабораторные крысы линии К-М и другие линии лабораторных животных [124, 125, 240], которые на действие аудиогенного раздражителя реагируют двигательным возбуждением, называемым в литературе «клоническим бегом» (wild running clonus) [235]. Последний переходит в фазу клонических, а затем тонических судорог. Клонико тоническая стадия судорожного припадка развивается в течение 7-14 с. Силу аудиогенного судорожного припадка также оценивали по общепринятой 5-бальной шкале, используемой для крыс линии К-М [70].
Определение устойчивости организма к гипоксии, индивидуальной адаптации к ней и деадаптация. Перед проведением сеансов адаптации у каждого животного определяли устойчивость к гипобарической гипоксии и формировали две крайние группы, высоко- (ВУ) и низкоустойчивую (НУ). Для этого, их поочередно помещали на находящуюся в барокамере площадку с изменяющимся углом наклона и "поднимали на высоту" 8000 м со скоростью 25 м/с, регистрируя время, в течение которого животное удерживалось в верхней части наклонной плоскости. Через некоторое время, в результате развивающейся гипоксии, животное теряет способность удерживать мышечное напряжение и сползает вниз. Это время принимали за индивидуальное "резервное время". Крыс, "резервное время" у которых не превышало 2,1±0,25 мин, относили к группе НУ, а тех, у которых это время было 5,5±0,33 мин к группе ВУ. Адаптацию животных к периодической гипобарической гипоксии осуществляли в проточной барокамере объемом 150 л, снабженной авиационными высотомером и вариометром, что позволяло контролировать "высоту" и скорость "подъема". Для поглощения углекислого газа, выдыхаемого животными, в камеру помещали щелочной поглотитель. Сеансы адаптации проводили на "высоте" 5000 м в течение 30 суток по 6 часов ежедневно. Первые четыре дня животных "поднимали" соответственно на "высоту" 1000, 2000, 3000, 4000, а все последующие дни — на "высоту" 5000 м. Адаптация к гипоксии при таком режиме достигается через 25—30 сеансов.
Через двое суток после завершения 30-суточных сеансов адаптации к периодической гипоксии изучили динамику деадаптации животных в течение 35 суток. Для этих целей весь период исследования разбили на семь 5-дневных периодов (5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 дней). В каждый из этих дней у крыс определяли "резервное время" в условиях гипоксии на "высоте" 8000 м.
Модуляция активности МА-ергических систем веществами медиа-торного типа действия. Активацию КА-ергической системы осуществляли введением животным синемета (США). Этот препарат содержит L-ДОФА и карбидопу. Последняя является ингибитором периферического декарбокси-лирования L-ДОФА и тем самым обеспечивает ее максимальное поступление в мозг. Карбидопа не токсична и даже в больших дозах не проходит ГЭБ, что не меняет поведения животных. Синемет вводили в/б на 2,5% р-ре пропи-ленгликоля из расчета 25 мг/кг по L-ДОФА. Наибольшая концентрация L-ДОФА в мозге, наблюдается через 20-30 мин после ее введения [172, 316]. Контрольные животные получали аналогичный объем физраствора.
Увеличение уровня серотонина в ЦНС осуществляли в/б введением 5 окситриптофана, который является серотонинотропным веществом и предшественником его синтеза. 5-ОТФ в организме животных и человека образуется при ферментативном гидроксилировании L-триптофана. Его применяли в дозе 15 мг/кг, что увеличивает содержание серотонина в структурах мозга [68, 198, 202, 211].
Снижение уровня ДА вызывали введением ингибитора его синтеза, а-метил-В,Ь-тирозина фирмы "Шихардт" (ФРГ), который избирательно ингибирует активность тирозингидроксилазы. Препарат вводили в/б в дозе 20 мг/кг.
В качестве противосудорожных препаратов применяли фенитоин и габапентин. Известно, что фенитоин и габапентин, активируя тормозные механизмы, по-разному модулируют активность МА-ергических системы.
Фенитоин обладает сильным противосудорожным действием и практически не угнетает сознание и электрическую активность мозга. Он увеличивает содержание биогенных аминов в ЦНС и снижает активность моноаминоксидаз [53, 351]. Его вводили per os в дозе 10 мг/кг.
Габапентин также вводили per os в дозе 20 мг/кг. Этот препарат хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и действует на ГАМК-рецепторы. Однако механизм действия габапентина отличается от других препаратов, взаимодействующих с ГАМК рецепторами. В исследованиях на животных установлено, что он усиливает синтез ГАМК, оказывает модулирующее действие на NMDA-рецепторы, блокирует сс25 субъединицу кальциевых каналов, снижает синтез и высвобождение моноаминов, уменьшает синтез и транспорт глутамата [205]. Указанные дозы эквивалентны обычно применяемым в терапии.
Динамика восстановления внутриклеточных изменений, возникающих после судорог в системе нейрон-глия МА-ергических ядер мозга у высоко- и низкоустойчивых к гипоксии животных
Благодаря многочисленным исследованиям в области экспериментальной и клинической эпилептологии глубоко и всесторонне изучены патогенетические механизмы различных видов эпилепсии и их связь гипоксическими состояниями, возникающими в организме [176, 187, 245, 273, 314]. Установлено, что тяжесть судорожного припадка в значительной мере зависит от устойчивости организма к гипоксии [7, 144, 273]. Известно также, что адаптация организма к периодической гипоксии снижает частоту приступов у больных эпилепсией [135, 155]. Однако до настоящего времени мало изучена роль МА-ергических механизмов в формировании индивидуальных восстановительных процессов в ПНС после судорожного припадка и их связь с устойчивостью организма к гипоксии.
В связи с этим у двух групп крыс линии Вистар, обладающих высокой (ВУ) и низкой (НУ) устойчивостью к гипоксии, изучена динамика изменения судорожной готовности после однократных коразоловых судорог и восстановление внутриклеточных процессов в системе нейрон-глия МА-ергических ядер мозга.
С помощью инфузомата животным обеих групп в/в вводили 1%-ный р-р пентилентетразола со скоростью 0,1 мл/мин до появления клонико-тонических судорог. Пороговую дозу коразола, необходимую для проявления судорог определяли индивидуально для каждого животного и выражали ее в мг/кг массы. Эта величина служила показателем судорожной готовности экспериментальных животных.
Результаты исследований показали, что пороговые дозы коразола у ВУ и НУ крыс статистически достоверно не различаются (табл. 1). После однократных судорог у животных обеих групп определяли изменения судорожной готовности в течение 48 часов после судорог.
Для этих целей исследованный постсудорожный период (48 ч) разбили на три этапа (24, 36 и 48 ч). В каждый из них вновь определяли индивидуальную пороговую дозу коразола, вызывающую у этих животных судорожную реакцию (как описано выше). Чтобы исключить в постсудорожный период "раскачку", в каждый период времени брали отдельную группу животных.
После судорог у животных обеих групп происходит повышение судорожной реактивности, которая в дальнейшем имеет индивидуальную динамику изменений. Так, через 24 ч судорожная готовность ВУ и НУ животных повышается, о чем свидетельствует снижение (на 25 и 34%) по сравнению с контролем пороговых доз коразола, вызывающих клонико-тоничес-кие судороги. Через 36 ч судорожная готовность ВУ крыс снижается и достигает контрольного уровня, тогда как у НУ животных она остается ниже контроля на 39% и только к 48 часам статистически достоверно не отличается от него.
Это согласуются с исследованиями других авторов, изучавших синаптическую пластичность мозга при судорожных состояниях [21, 23]. Установлено, что исходный уровень бензодиазепиновых рецепторов у высоко- и низкоустойчивых к коразолу крыс одинаков. Однако после острых судорог у животных обеих групп плотность рецепторов уменьшается и удерживается на этом уровне в течение 48 ч.
Полученные результаты позволяют полагать, что разная продолжительность сохранения повышенной судорожной готовности у животных исследованных групп в постсудорожный период, по-видимому, неодинаково сказывается на компенсаторно-восстановительных процессах в ЦНС. Снижение активности последних может быть патогенетической основой возникновения повторных судорог [48, 257, 313], которые вызывают еще более глубокие повреждения мозга [342]. Поэтому важно выяснить связь индивидуально-типологических особенностей организма с репарационными возможностями клеточных структур мозга и их уязвимостью в постсудорожный период.
Высокая пластичность и функциональные возможности клеточных структур мозга в значительной мере обусловлены постоянной взаимосвязью функций с генетическим аппаратом клеток. Для каждого функционального состояния нейрона характерна экспрессия конкретных генов, обеспечивающая внутриклеточный синтез соответствующих РНК и белков. Макромолекулы определенной функциональной значимости поступают из тел нейронов в их отростки, где предопределяют необходимую реорганизацию межнейронных синаптических связей. Поэтому качественные и количественные изменения содержания РНК и белков в системе нейрон-глия являются интегративными показателями функциональных возможностей различных структур мозга [39, 42, 129, 146, 247, 304].
Известно, что тяжесть любого функционального нарушения определяется степенью повреждения клеточных структур. В связи с этим в настоящем разделе представлены результаты исследования динамики изменений содержания РНК в системе нейрон-глия центральных МА-ергических ядер мозга в постсудорожный период. Эти ядра являются важными медиаторными центрами, они моносинаптически иннервируют многие отделы мозга и играют важную роль в проявлении судорожной готовности [242, 243, 282]. Однако неизвестна их роль в реализации репарационных процессов после судорог.
Установлено, что повышенная судорожная готовность, имевшая место у ВУ и НУ животных через 12 ч после судорог сопровождается значительным снижением (на 33 и 32%) содержания РНК в нейронах компактной зоны черной субстанции (рис 1). Аналогичный характер сдвигов был и в сателлитных глиоцитах. Через 24 ч уменьшение содержания РНК (на 21%) обнаружено в цитоплазме нейронов ВУ крыс, тогда как у НУ животных оно остается ниже контроля не только в нервных, но и в глиальных клетках-сателлитах (на 35 и 27% соответственно).
