Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА, ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ ПОТЕНЦИИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ
К ДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ (Обзор литературы) 8
Сравнительная характеристика МСК среди других типов стволовых клеток взрослого организма 8
Дифференцировочные потенции МСК в культуре и целостном организме 11
Терапевтический эффект МСК и их дифференцирующегося клеточного потомства при поражениях сердечной мышцы 14
1.4. Радиочувствительность МСК 18
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ 21
Получение культур кардиомиобластов из мезенхимальных стволовых клеток крысы и человека 21
Исследование радиочувствительности МСК и КМБ 22
Анализ кариотипа КМБ 23
Тестирование тератогенной, канцерогенной и мутагенной активности трансплантации КМБ 24
Метод проточной цитофлюорометрии для выявления специфических маркеров клеток стволового типа и оценки распределения клеток в популяции по фазам цикла 25
2.6. Методика мечения КМБ с помощью Тс-99т 25
2.7.Схема экспериментов по изучению эффективности трансплантации
КМБ на моделях индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии
у крыс и мышей 26
2.8. Тестирование жизнеспособности клеток культур МСК и КМБ при
хранении при низкой температуре (2-4 С) и после замораживания в
жидком азоте 28
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 30
Общая характеристика культур МСК и КМБ 30
Сравнительная радиочувствительность МСК и КМБ человека и крыс 35
Распределение клеток культур МСК и КМБ по стадиям клеточного
Цикла 38
3.4. Исследование кариотипа МСК и КМБ 40
Результаты тестирования мутагенного, канцерогенного и тератогенного эффектов КМБ 41
Распределение в органах и тканях сингенного и ксеногенного организма меченых Тс-99т кардиомиобластов 52
3.7. Терапевтическое действие трансплантированных кардиомиобластов в
модели индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии 53
3.8. Жизнеспособность МСК и КМБ при хранении в криобанке 62
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 65
Выводы 70
Список литературы 72
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
В последние годы активно проводятся исследования биологических характеристик различных типов стволовых клеток и возможностей их применения в клинике, в первую очередь, для трансплантации с целью замещения поврежденных и погибших клеток [Sell S., 2004; Penn M.S., 2007], в том числе при лечении онкологических больных после интенсивной лучевой или комбинированной терапии, в результате которой будут повреждены не только клетки злокачественного новообразования, но и нормальные клетки различных жизненно важных органов пациента.
При этом наиболее перспективным считается использование стволовых клеток костного мозга взрослого человека, размноженных в культуре до необходимого количества и направленных специальными индукторами в сторону дифференцировки в различные клеточные линии, включая клетки-предшественники гемопоэтическои стромы, остеоциты, хондроциты, гепатоциты, миоциты скелетных мышц, кардиомиоциты, нейральные клетки [Цыб А.Ф. и др., 2004, Dezawa М., Hoshino М., Ide С, 2005]. Использование этих клеток будет способствовать восстановлению соответствующих поврежденных тканей.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), открытые и обстоятельно изученные в лаборатории отечественного исследователя А.Я.Фриденштейна, в последние годы стали одним из основных исходных элементов для проведения клеточной терапии, а в недалеком будущем, несомненно, станут таким же агентом для проведения генной терапии. В связи с этим актуальной становится проблема достаточно быстрой и воспроизводимой интегральной характеристики МСК и их дифференцированного клеточного потомства, производимых для целей, клеточной терапии с использованием различных критериев. Одним из этих критериев является клеточная радиорезистентность выращенной культуры клеток в стандартных условиях облучения. В литературе, также как и в наших собственных работах, есть достаточно много сведений о радиационной чувствительности клеток исходных культур МСК (начиная еще со времени, когда для их обозначения использовали термин - колониеобразующие единицы фибробластов - КОЕ-Ф), полученных из костного мозга человека и различных видов животных (мыши, крысы, морские свинки, собаки и др.). Клетки-предшественники гемопоэтическои стромы всегда были более резистентными, чем гемопоэтические клетки-предшественники, величины их средней клеточной дозы Do при действии редкоионизирующей радиации были порядка
5 1,8-2 Гр и более по сравнению примерно с 1-1,3 Гр для плюрипотентных и коммутированных гемопоэтических стволовых клеток. Можно полагать, что именно по этой причине является эффективной трансплантация клеток костного мозга или очищенных концентратов гемопоэтических стволовых клеток при лечении острого лучевого поражения организма, подвергшегося действию ионизирующей радиации в «костномозговом» диапазоне доз общего облучения, так как пересаженные стволовые кроветворные клетки обеспечиваются полноценным «микроокружением» за счет выживших при данных дозах облучения стромальных стволовых клеток костного мозга, обладающих большей радиорезистентностью. В тоже время, сведения о чувствительности к радиации дифференцированного в различном направлении клеточного потомства МСК практически отсутствуют. Одновременно с этим, биологические характеристики таких клеток и безопасность использования их в клинике изучены недостаточно, в том числе и по такому интегральному тесту, как клеточная радиочувствительность, что делает актуальным сравнительное изучение радиобиологических характеристик МСК и их начавшегося дифференцироваться в направлении кардиомиоцитов клеточного потомства.
Цель работы. Целью данной работы явилась разработка методов получения для радиобиологических исследований культур мезенхимальных стволовых клеток и выращиваемых из них клеток-предшественников кардиомиоцитов (кардиомиобласты,. КМБ) из костного мозга человека и лабораторных крыс, изучение количественных характеристик таких клеточных культур, включая их радиочувствительность при Г стандартном гамма- облучении в условиях in vitro и получение радиоактивно меченых с помощью технеция -99т клеточных культур для изучения способности КМБ восстанавливать поврежденный миокард у лабораторных животных.
Основные задачи исследования:
Разработать метод получения МСК и клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ-в культурах клеток костного мозга человека и крыс линии Вистар и изучить биологические характеристики МСК и КМБ, в том числе их радиочувствительность при воздействии гамма-излучения Со-60 in vitro, которые можно было бы использовать при контроле качества индивидуально получаемых культур клеток-предшественников.
Разработать метод радиоактивного мечения КМБ и использовать его для количественной характеристики распределения клеток-предшественников - КМБ при их внутривенном введении лабораторным животным.
-Разработать модель повреждения миокарда на экспериментальных животных (мышь,
крыса) и использовать ее для оценки терапевтической эффективности процедуры внутривенной трансплантации полученных КМБ.
Научная новизна.
Впервые разработана методика получения индивидуальных культур кардиомиобластов из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и лабораторных животных; охарактеризованы биологические свойства полученных клеток стволового типа (радиочувствительность, выраженность ряда специфических маркеров, кариотип, особенности роста культур, клоногенная активность, распределение радиоактивно меченых клеток по тканям при системном введении), позволяющие контролировать процесс их культивирования; показана безопасность их введения в организм в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффекта.
Показано, что внутривенная трансплантация кардиомиобластов при тяжелой форме индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии ослабляет проявление тяжелого поражения сердечной мышцы и ускоряет протекание и полноту репаративных процессов, как в относительно ранние сроки (2 и 4 недели после химического повреждения тканей), так и более отдаленный период - 3 и 6 месяцев от начала эксперимента, несмотря на' низкий уровень поступления кардиомиобластов в ткани сердца, что было показано путем изучения процесса "хоминга" радиоактивно меченых технецием-99т кардиомиобластов.
Практическая значимость работы. Сведения, полученные в работе, служат экспериментальной базой для клинического применения клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ, а также основой для разработки методов биологической характеристики и контроля качества клеточных культур, приготовленных из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Материалы диссертационной работы использованы при подготовке заявки на получение разрешения Росздравнадзора МЗиСР РФ от 11 августа 2006 года за №ФС-2006/206 на применение новой медицинской технологии производства культур МСК и КМБ человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
- разработаны методики получения индивидуальных культур МСК и получаемых из них культур клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ, для которых охарактеризованы основные биологические свойства и выявлено различие в радиочувствительности, которое может использоваться при контроле качества
7 получаемых для практического применения культур мезенхимальньк стволовых клеток и их более дифференцированного клеточного потомства;
- на модели индуцированной у лабораторных животных кардиомиодистрофии показан лечебный эффект системной трансплантации КМБ, который одновременно безопасен в отношении развития в ранние и отдаленные периоды неблагоприятных последствий.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на I Международной конференции "Человек и электромагнитные поля" (г. Саров, 2003), VIII Конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (г. Москва, 2006), Британско-российском совещании "Стволовые клетки: законодательство; исследования и инновации. Перспективы сотрудничества России и Великобритании" (г. Москва, 2007)". Диссертация апробирована на конференции экспериментального сектора ГУ МРНЦ РАМН 26 марта 2008 г.
Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГУ «Медицинский
радиологический научный центр» РАМН по темам: 1. Разработка методов
культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и его эквивалентов у *
лабораторных животных и человека, создание экспериментальной модели,их
трансплантации и специфического воздействия на микроокружение стволовых клеток при*
лечении заболеваний, связанных с повреждением кардиомиоцитов, включая повреждения
сердца у онкологических больных, подвергающихся химиолучевой терапии, и подача
заявки для проведения ограниченных клинических испытаний (2002-2005 гг., № гос. і
регистрации 01.20.03 03637 ); 2. Экспериментальные и клинические исследования по разработке и ограниченным клиническим испытаниям методов клеточной терапии, основанных на применении культур мезенхимальных стволовых клеток у пациентов с поражением жизненно важных органов, в том числе у больных после лучевой и химиотерапии (2006-2009 гг., № гос. регистрации 0120.0 602178).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа объемом в 91 страницу машинописи содержит введение, обзор литературы, изложение материалов проведенных исследований, обсуждение, выводы и список литературы, включающий 32 публикаций отечественных авторов и 187 публикаций зарубежных исследователей.
