Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время бордетеллез является широко распространенным заболеванием животных во многих странах мира (Baker, 2003). Однако в Российской Федерации до настоящего времени исследования в этой области не проводились.
Bordetella bronchiseptica является возбудителем хронических и, довольно часто, асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахеобронхита) животных. Возбудитель поражает животных всех возрастных групп, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. Тяжесть заболевания связана с присутствием у B. bronchiseptica факторов патогенности: адгезинов (филаментозного гемагглютинина, пертактина и фимбрий) и токсинов (дермонекротического, аденилатциклазы-гемолизина и липополисахарида) (Woolfrey et al., 1991; Gueirard et al., 1995).
Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства) (Bemis, 1977). Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, содержащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продуктивности животных, обусловливают необходимость выявления B. bronchiseptica и проведение противоэпидемических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка методов индикации и идентификации B. bronchiseptica.
Цель работы - разработка методических приемов индикации и идентификации B. bronchiseptica, основанных на иммунохимических и молекулярно-генетических методах.
Задачи работы:
-
Провести сравнительный анализ иммунохимических методов изучения антигенного состава B. bronchiseptica с целью идентификации.
-
Адаптировать метод полимеразной цепной реакции для молекулярно-генетической идентификации B. bronchiseptica.
-
Подобрать праймеры для выявления специфических участков ДНК B. bronchiseptica, а также идентификации участка генома представителей рода Bordetella.
-
Определить специфичность полимеразной цепной реакции при индикации B. bronchiseptica.
-
Разработать схему мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения нескольких специфичных участков ДНК B. bronchiseptica.
-
Определить чувствительность ПЦР при выявлении возбудителя бордетеллеза.
-
Разработать схему проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки ДНК B. bronchiseptica.
Научная новизна. Впервые в Российской Федерации проведен сравнительный анализ антигенного состава B. bronchiseptica с гипериммунными сыворотками в реакциях радиальной иммунодиффузии по O. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза по G. Bedarida et al. (1969) и иммуноэлектрофореза по P. Grabar и C. Williams, описанному Х. Фримель (1979). Показана высокая чувствительность метода иммуноэлектрофореза для изучения антигенной структуры B. bronchiseptica при использовании иммунной сыворотки с низким титром. На примере использования разработанных систем праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ доказана высокая специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции при идентификации B. bronchiseptica. Подобраны и оптимизированы соотношения систем праймеров для одновременного выявления 3 специфичных участков генома B. bronchiseptica в мультиплексном формате ПЦР. Предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК B. bronchiseptica в биоматериале.
Практическая значимость работы. Метод иммуноэлектрофореза при проведении антигенной идентификации B. bronchiseptica позволяет использовать его для контроля состава и специфичности антигенов при разработке и производстве биопрепаратов, а подобранные и оптимизированные системы праймеров – в производстве ПЦР-систем, основанных на амплификации специфических участков генома B. bronchiseptica для диагностики бордетеллеза.
Разработаны «Методические рекомендации по выявлению Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции», утвержденные ректором УГСХА от 10 ноября 2010 г. и подтвержденные актом комиссионных испытаний, проведенных на базе ООО «Медицинский Центр «Академия» (г. Ульяновск). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии, а также при проведении практических занятий для студентов и аспирантов в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Иммуноэлектрофорез по методу P. Grabar и C. Williams, описанному Х. Фримель (1979), позволяет идентифицировать 8 антигенов B. bronchiseptica, 5 из которых являются видоспецифичными.
-
При использовании праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ может быть проведена индикация B. bronchiseptica в биологическом материале.
-
Чувствительность метода ПЦР с праймерными системами к участкам генов BfrA, BfrZ и Cytochrom–C–oxidase генома B. bronchiseptica составляет 5,5х103, а участка гена 16S rRNA – 5,5х102 бактериальных клеток/мл.
-
Мультиплексный формат ПЦР с системами праймеров к участкам BfrA, BfrZ и Cytochrom–C–oxidase дает возможность одновременно идентифицировать 3 гена: BfrA и BfrZ – специфичных для B. bronchiseptica, а также Cytochrom–C–oxidase – специфичного для B. bronchiseptica, B. pertussis и B. parapertussis.
-
Применение метода ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК B. bronchiseptica в биологическом материале.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы и в Научно-исследовательском центре микробиологии и биотехнологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия».
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008; 2009), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» (Москва, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 28 рисунков. Список использованных литературных источников включает 207 наименований, в том числе 190 зарубежный.
