Введение к работе
з
Актуальность проблемы
Нетуберкулезные микобактерии - это микроорганизмы, про которые в начале второй половины XX века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию называют микобактерио-зами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобакте-риозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Ка-toch V., 2004; Khatter S., 2008].
В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, и их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2002; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены М. tuberculosis и М. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобактерии входят в так называемый М. tuberculosis complex: М. tuberculosis, М. bovis, М. afticanum, М. microti, М. canetti, М. caprae, М. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель Л.М., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Оттен Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky Е., 1979, 1992; Tells С, Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier K., 1998; Dawson D., 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski X, Young M., 2008].
He входящие в M. tuberculosis complex микобактерии долгие годы называли микобактериями окружающей среды (enviromental mycobacteria), возбудителями микобактериозов, атипичными микобактериями. Однако, в последние десятилетия большинство микробиологов использует термин «нетуберкулезные микобактерии» (HTM) [Wallace R. et al., 1990,1997; Dawson D., 2000; Katoch V.,
Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 50-70 годы XX века: Л.М. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б.Яблокова, Т.Б. Ильина, Р.О.Драбкина, Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Огтен Т.Ф., Васильев А.В., 2005].
За это время ситуация в мире резко изменилась, число больных мико-бактериозами во многих странах возросло в десятки раз. Это явилось следствием увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras Т., Daley С.,2002; Cole Т. et al.,2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Heifets L., 2004; Shin J. etal., 2009].
Заболевания, вызываемые разными видами HTM, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Cole T.et al., 2005]. Перед микобактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.
В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению НТМ и микобактериозов про-
5 грессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Katoch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Young M., 2008].
К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактерио-за и назначить своевременное лечение.
Кроме того, в России микобактериозы не считаются самостоятельными заболеваниями, несмотря на то, что они включены в Международную классификацию болезней. В связи с такой ситуацией, врачи не знают особенностей течения и лечения этой патологии, нет специальных курсов обучения, не используются современные методы диагностики микобактериозов. Сегодня даже не ясно, в каких учреждениях следует лечить таких больных. Часто пациенты, страдающие микобактериозами, находятся в одних палатах с больными туберкулезом и могут инфицироваться от них, а возможно и заражать их.
Все вышеизложенное определяет актуальность и необходимость разработки комплекса методов выделения и идентификации НТМ с применением всех имеющихся в настоящее время технических возможностей.
Цель исследования
Создание оптимального комплекса выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий (НТМ) с использованием разработанных и модифицированных методов, и на этой основе изучение видового состава выделенных НТМ и их чувствительности к антибактериальным препаратам.
Задачи исследования
1. Изучить эффективность использования наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Йенсена, плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) для выделения НТМ.
-
Провести сравнительный анализ результатов применения для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.
-
Разработать для видовой идентификации НТМ новый молекулярно-генетический метод - биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с результатами, полученными микробиологическими методами, ПДРФ и ВЭЖХ.
-
На основании результатов сравнительных исследований эффективности различных методов выделения и идентификации НТМ разработать оптимальный диагностический комплекс (алгоритм), с его помощью охарактеризовать видовой спектр штаммов НТМ, циркулирующих в городе Москве.
-
Проанализировать частоту повторного обнаружения у больных одного и того же вида НТМ, как критерия (при наличии клинико-рентгенологических признаков заболевания) развития микобактериоза.
-
Выявить особенности чувствительности к противотуберкулезным и другим антибактериальным препаратам НТМ, выделенных из диагностического материала, поступившего в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных учреждений города Москвы.
Научная новизна исследования
В результате сравнительного изучения эффективности выделения НТМ с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и плотных - агаровой (Миддлбрука 7Н11) и яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных сред, установлено, что наибольшее число микобактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается получить до 10% изолятов, оптималь-
7 ным для выделения НТМ является комплексное применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.
Выявлено (при субкультивировании на чашках с агаровой средой Мидц-лбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные как в жидкой, так и на плотных питательных средах, могут содержать несколько видов микобактерий.
Впервые для идентификации видов НТМ разработан и применен метод биологических микрочипов: поэтапно испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов. В итоге полученный «БИО-ЧИП MS» позволяет идентифицировать 9 видов НТМ: М. avium, М. intracellu-lare, М. scrojulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, М. fortui-tum, М. chelonae и дифференцировать их отМ tuberculosis complex.
При сравнительном изучении эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов ПДРФ и ВЭЖХ на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований (не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий), но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.
Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации НТМ, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах - плотной и жидкой, и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего - предпочтительнее).
Впервые с помощью разработанного алгоритма охарактеризован видовой состав НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве. С наибольшей частотой среди медленнорастущих
8 HTM из клинического материала выделяли МАС, М. xenopi и М. kansasii а быстрорастущих - М. fortuitum. Клинические изоляты НТМ отличались высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.
Впервые создана коллекция клинических изолятов (548 штаммов) нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику
Предложено для эффективного выделения НТМ из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Мидд-лбрука 7Н11, выделенных в жидкой и на плотной яичной питательных средах культур, позволяет обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культурально-морфологические свойства.
Высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий методом ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.
Результаты видовой идентификации культур НТМ с помощью молекулярно-генетических методов (ПДРФ и биологических микрочипов) аналогичным образом в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований, при существенном сокращении времени их получения. В связи с этим, указанные методы могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения биочипов является простота метода,
9 возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале и автоматизированный учет результатов.
При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ, при отсутствии М. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.
При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что НТМ в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фторхинолонам, как ци-профлоксацин и моксифлоксацин.
Создана коллекция, состоящая из 548 клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ, которая может быть использована в качестве контрольной при разработке и испытании новых диагностических тест-систем.
Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Москвы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиопульмонологии РМАПО Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
На основании результатов проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:
«Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 07.02.2007;
«Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009;
«Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Использование модифицированной жидкой питательной среды Мидд-лбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для выделения НТМ из клинического материала.
-
Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, иммобилизирован-ных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: М. avium, М. intracellulare, М. scrojulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, M.fortuitum, М. chelonae и дифференциации их отМ tuberculosis complex.
-
Анализ сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью биочипов, оценки ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологических методов, показал, что все они дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические тесты характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.
-
Разработан алгоритм выделения и идентификации НТМ, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобакте-риозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой ере-
и дой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.
-
При использовании предложенного алгоритма выделения и идентификации НТМ охарактеризован их видовой состав в городе Москве: с наибольшей частотой из медленнорастущих НТМ в клиническом материале обнаружены MAC, М. kansasii и М. xenopi, а из быстрорастущих - М. fortuitum. Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ (при отсутствии М. tuberculosis и наличии соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики) дает основание для рассмотрения в диагностическом ряду микобактериоза.
-
НТМ, выделенные от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве, отличаются высоким уровнем устойчивости как к основным, так и резервным противотуберкулезным препаратам, и в большинстве случаев чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и мок-сифлоксацин.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на научных форумах всероссийского и международного уровней, включая научно-практические конференции и заседания Ученого совета МНПЦБТ, 8-й Российский съезд фтизиатров (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 4-й конгресс Евро-Азиатского респираторного общества и 5-й Международный конгресс пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и 8-ю Московские Ассамблеи «Здоровье Столицы» в 2008 г. и 2009 г., Европейские респираторные конгрессы (Берлин 2008 г., Вена 2009 г.), 5-й конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.
12 Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий ссылки на 31 работу отечественных и 342 зарубежных авторов. Результаты исследования проиллюстрированы 27 рисунками, в виде графиков, схем, фотографий и 18 таблицами.
