Содержание к диссертации
Введение
1 .Обзор литературы 10-35
1.1. Общие сведения о пастереллезе птиц 10-11
1.2. Характеристика возбудителя и требования к штаммам, используемым в качестве производственных 11-15
1.3. Противопастереллезные вакцины 15-17
1.4. Общие принципы технологии изготовления инактивированных бактериальных вакцин 17-27
1.5.0ценка качества инактивированных бактериальных вакцин 27-35
1.5.1. Основные требования к качеству инактивированных вакцин .27-28
1.5.2. Оценка иммуногенных свойств инактивированных вакцин 28-30
1.5.3. Корреляция уровня специфических антител в сыворотках крови животных с защитой организма от инфекции 30-32
1.5.4. Современные методы выявления и определения уровня антител 33-35
2. Собственные исследования 36-83
2.1. Материалы и методы 36-45
2.1.1. Материалы 36-38
2.1.2. Методы 38-45
2.2. Результаты исследований 45-83
2.2.1. Получение биомассы пастерелл для изготовления вакцины 45-58
2.2.1.1 .Биологические свойства штаммов Pasteurella multocida 45-50
2.2.1.2.0сновные параметры культивирования пастерелл 50-51
2.2.1.3.Инактивация P.multocida аминоэтилэтиленимином 51-58
2.2.1.3.1. Изучение активности аминоэтилэтиленимина при инактивации пастерелл 51
2.2.1.3.2. Кинетические закономерности гибели пастерелл при инактивации аминоэтилэтиленимином 52-57
2.2.1.3.3. Влияние аминоэтилэтиленимина на морфологию бактерий 57-58
2.2.2. Подбор масляного адъюванта для изготовления вакцины против пастереллеза птиц инактивированной эмульсионной 58-61
2.2.3. Изготовление опытных образцов вакцины против пастереллеза птиц и изучение их физических и ммунобиологических свойств 61 -73
2.2.3.1 .Физические свойства вакцины 62-63
2.2.3.2.Иммунобиологические свойства вакцины 63-73
2.2.3.2.1. Безвредность и реактогенность 63-64
2.2.3.2.2. Антигенные свойства вакцины 64-66
2.2.3.2.3. Иммуногенные свойства вакцины на белых мышах 66-68
2.2.3.2.4. Иммуногенные свойства вакцины на птице 68-73
2.2.4. Изготовление экспериментальных серий вакцины против пастереллеза птиц трехвалентной инактивированной эмульсионной 73
2.2.5. Контроль качества вакцины 73-81
2.2.5.1. Оценка физических свойств, безвредности и реактогенности экспериментальных серий вакцины на белых мышах и курах 74-75
2.2.5.2. Оценка иммуногенных свойств вакцины 75-81
2.2.6. Определение активности антигенов P.multocida в составе вакцины в процессее хранения 81-83
2.2.7. Производственные испытания вакцины 83
3. Обсуждение 84-94
4. Выводы 95
5. Практические предложения 96
6. Список использованных литературных источников 97-117
Приложения 118-121
- Характеристика возбудителя и требования к штаммам, используемым в качестве производственных
- Основные требования к качеству инактивированных вакцин
- Получение биомассы пастерелл для изготовления вакцины
- Изготовление опытных образцов вакцины против пастереллеза птиц и изучение их физических и ммунобиологических свойств
Введение к работе
Актуальность темы. Пастереллез — одна из важнейших ветеринарных проблем, возбудителем которого является бактерия Pasteurella multocida. Заболевание у птиц вызывают различные сероварианты пастерелл серогруппы А по капсульному антигену. Значительный экономический ущерб, наносимый птицеводству этой инфекцией, складывается из высокого отхода поголовья, снижения привесов и затрат на проведение профилактических мероприятий (32;190;124;81).
Как показывает мировой опыт - вакцинация во многих случаях является одним из основных средств борьбы с инфекционными болезнями животных.
В настоящее время в арсенале иммунопрофилактики пастереллеза птиц имеется целый ряд вакцинных препаратов, различающихся по составу, технологии производства, по способу применения и эффективности. Большинство из них обладает несомненными достоинствами, но имеются и недостатки (194; 160;96).
Эффективность инактивированных вакцин зависит от количества и качества антигена, природы и свойств адъюванта, от технологии изготовления препарата и способа его применения.
Важным моментом в технологии изготовления вакцин из убитых возбудителей является инактивация микроорганизмов. Для этих целей чаще всего используют формалин. Однако установлено, что формалин не является идеальным инактивантом, так как он может снижать антигенную и иммуногенную активность бактериальных антигенов. Поэтому необходим поиск новых инактивантов, которые не оказывают влияния на протективные антигены.
Одним из возможных решений этого вопроса может быть использование азиридинов.
Большинство вакцин против пастереллеза птиц выпускают в виде инактивированных формалином сорбированных и эмульсионных препаратов. Основными недостатками сорбированных вакцин являются:
необходимость многократных инъекций препарата;
относительно большие дозы вакцин.
Применяемые в настоящее время эмульсионные вакцинные препараты превосходят по иммуногенности сорбированные, однако основным препятствием их широкого использования являются:
1)высокая вязкость, затрудняющая введение при массовой обработке птицы;
2)высокая реактогенность.
Поэтому проведение работ по усовершенствованию и созданию новых инактивированных вакцин против пастереллеза птиц является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка трехвалентной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза птиц.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
разработать режим инактивации пастерелл аминоэти лэти л енимином;
подобрать масляный адъювант и изготовить экспериментальные образцы вакцины против пастереллеза птиц;
разработать метод оценки иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по индексу защиты (7V);
определить иммунизирующую дозу, напряженность и продолжительность иммунитета после применения вакцины на курах.
8 Научная новизна работы. Новизна исследований состоит в том, что в результате проведенных экспериментов:
разработан режим и определены оптимальные параметры инактивации пастерелл аминоэтилэтиленимином;
количественно охарактеризована зависимость кинетики инактивации пастерелл от концентрации инактиванта;
установлена высокая антигенная и иммуногенная активность пастерелл, инактивированных аминоэтилэтиленимином в составе вакцины;
разработан метод оценки иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по индексу защиты (N).
Практическая значимость работы.
На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю вакцины против пастереллеза птиц, трехвалентная инактивированная эмульсионная, утвержденная заместителем директора ФГУ ВНИИЗЖ по НИР 20.07.2005г.
Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:
Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов», Покров, 24-26 сентября 2003 г.
Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных», Владимир, 24-26 марта 2004г.
Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы», Ульяновск, 26-28 апреля 2005 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
9 Основные положения, выносимые на защиту:
Способ инактивации пастерелл АЭЭИ.
Масляный адъювант для изготовления вакцины.
Вакцина против пастереллеза птиц, трехвалентная инактивированная эмульсионная.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121
странице и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты исследований, обсуждение, выводы, практические
предложения. Список использованных литературных источников включает
204 наименования, в том числе 107 работ зарубежных авторов. Работа
иллюстрирована 7 рисунками и 19 таблицами. В приложении
представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
Автор благодарит сотрудников кафедры микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы пищевых продуктов Ульяновской ГСХА, лаборатории экологии ГНУ ВНИИВВиМ и лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ за помощь в выполнении данной работы.
Характеристика возбудителя и требования к штаммам, используемым в качестве производственных
Возбудителем пастереллеза является Pasteurella multocida. По современной классификации P. multocida относится к роду Pasteurella, семейству Pasteurellaceae, порядку Eubacteriales, классу Schizomycetes, отделу Scotobacteria, царству Procaryotes.
Pasteurella multocida — неподвижные, мелкие, биполярно окрашивающиеся палочки длиной 0.3-1.5 мкм, шириной 0.15-0.3 мкм, грамнегативные, имеют капсулу, выявляемую при косвенных методах окрашивания (16). Пастереллы аэробы или факультативные анаэробы, растут на простых и обогащенных питательных средах при рН 7.2-7.4. На МПБ в первые сутки наблюдается незначительное равномерное помутнение, на 4-5 сутки - просветление, на дне - слизистая косичка. На агаре пастереллы растут в виде мелких, прозрачных, росинчатых колоний с гладкими краями, иногда наблюдают рост в виде нежного прозрачного налета (7,13,16,18).
Ферментативная активность пастерелл незначительная, большинство штаммов продуцируют каталазу и оксидазу разлагают с образованием кислоты без газа: глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит, лактозу и дульцит не изменяют, все пастереллы индолообразователи, восстанавливают нитраты до нитритов.
Устойчивость P. multocida к факторам внешней среды сравнительно невысокая. Быстрая гибель пастерелл во внешней среде наступает при высушивании, действии высокой температуры и солнечных лучей. При кипячении погибают моментально. При низких температурах сохраняются длительно. Весьма чувствительны к дезинфицирующим веществам -растворам хлорной извести, формалину и т.д.
Антигенная структура пастерелл весьма сложна. Выраженными антигенными свойствами обладают такие компоненты клетки P. multocida, как капсульные полисахариды, липополисахариды клеточной стенки (ЛПС) и белки внешней мембраны (ОМП)(18,97,98,122,124).
Капсульный антиген содержит протеиновую и липополисахаридную фракции (55). Он играет основную роль в развитии специфической резистентности к пастереллезу.
В настоящее время различают пять серологических групп пастерелл по капсульному антигену (113,184,189,191), которые обозначают латинскими буквами A, B,D,E,F.
Разделение пастерелл на группы проводится посредством серотипирования в реакции непрямой гемагглютинации (90,117). Значительная гетерогенность пастерелл обусловлена соматическим антигеном, т.е. липополисахаридом, по которому P. multocida удалось разделить на 15 серовариантов (109,185,186).
Роль ЛПС, как иммуногена для млекопитающих остается спорной (183,187). Рядом авторов установлено, что степень защиты организма от пастереллеза зависит от путей и методов инокуляции ЛПС, а также от вида животного (188,190).
Были попытки использовать белки внешней мембраны (ОМП).Р. multocida в качестве потенциальных иммуногеннов (124,125,157,166). Lugtenberg et al (167) выявили 3-профиля обол очечного белка изолятов P. multocida. Профили отличались по степени миграции поверхностного белка (белка Н) с молекулярной массой приблизительно 36-38 кДа (146).
Серологические варианты P. multocida, А и D продуцируют белковые токсины, масса которых составляет около 145 кДа. Они вызывают летальный исход у грызунов и птиц, а также индуцируют остеолизис носовой раковины у свиней и некроз при инъецировании в кожу морской свинке (22,121,134,175). Из-за последнего свойства токсин был назван дермонекротическим. Как иммуноген, инактивированный токсин (токсоид) индуцирует защиту от заражения у крыс и мышей, а также от экспериментального атрофического ринита у свиней (98,130,131). Установлено, что mAb против токсина P. multocida, могут нейтрализовать его летальное действие у мышей (139,140).
Исходя из того, что в большинстве стран Европы и Северной Америке холеру птиц вызывают штаммы P. multocida сероваров А:1, А:3 и А:4 это учитывают при разработке и производстве вакцин. Исследования по определению серовариантной принадлежности изолятов P. multocida, выделеных на территории бывшего Советского Союза не проводились. Вакцинные препараты против холеры кур в Российской Федерации изготавливают, как правило, из какого-либо одного производственного штамма P. multocida принадлежащего к серогруппе А. Как известно эффективность вакцинопрофилактики пастереллеза напрямую зависит от качества производственных штаммов, из которых изготавливают биопрепарат, и от их иммунобиологических свойств. . Все производственные штаммы пастерелл должны иметь типичные для вида основные свойства, обладать выраженной антигенностью и иммуногенностью.
Основные требования к качеству инактивированных вакцин
Оценка качества инактивированных вакцин остается до настоящего времени одной из наиболее сложных проблем. Оценка качества вакцин -это системное измерение комплекса свойств препаратов при помощи корректных, легковоспроизводимых и высокоинформативных методов.
К основным показателям качества относятся: стерильность, безвредность и специфическая активность, требования, к которым по возможности должны быть максимально стандартизованы (4,27,45,60,79,91,104,195,201).
Чтобы исключить возможный токсический или аллергизирующий эффект среди иммунизируемого поголовья в каждом конкретном случае регламентируется концентрация адъюванта и ряда других веществ в препарате (23,28,79,91,103).
Контроль стерильности инактивированных вакцин производят путем посева их на специальные высокочувствительные питательные среды, позволяющие выявить разнообразные виды контаминирующих микроорганизмов, которые в малых количествах могут попасть в препараты (28,29,91,195).
Безвредность инактивированных вакцин определяют в опытах на лабораторных и естественно восприимчивых животных, для которых предназначен препарат.
При проверке на сельскохозяйственных животных и птице испытуемую вакцину вводят парэнтерально в дозах, превышающих рекомендуемые для профилактического использования в 2-3 раза. При проверке инактивированных вакцин на лабораторных животных дозы должны приближаться к максимально переносимым. Срок наблюдения за животными, в течение которого они должны оставаться здоровыми - не менее 10 суток (45,65,91,160,168,201).
Для инактивированных вакцин, при которых естественно восприимчивые животные используются для контроля иммуногенности, безвредность может быть определена ежедневным наблюдением за вакцинированными в течение 10 суточного периода после введения препарата.
Контроль иммуногенной активности инактивированных бактериальных вакцин осуществляют как in vivo — на лабораторных или естественно восприимчивых животных, так и in vitro- по уровню гуморальных антител.
При этом отечественные и зарубежные авторы (9,30,49,50,55,60,92,174,197) рекомендуют следующие подходы: использовать в качестве модели такой вид лабораторных животных и такие методы их заражения, которые обеспечат формирование иммунного ответа максимально сходного с таковым у сельскохозяйственных животных; использовать по возможности несколько видов лабораторных животных; иммуногенную активность вакцин оценивать при однократной инъекции препарата, поскольку при многократных введениях, на уровень иммунитета будет влиять и иммунологическая реактивность организма животных; испытание препарата желательно проводить на большой группе животных одной линии, чтобы исключить индивидуальные различия животных; использовать самых молодых животных, для которых предназначена вакцина.
Для оценки иммуногенной активности инактивированных вакцин используют следующие методы: - «Метод постоянного уровня иммунитета» - основан на определении минимальных доз препаратов, обеспечивающих защиту 50% животных от определенной дозы инфекционного агента (ImD50). Сущность этого метода заключается в том, что несколько групп животных иммунизируют разными дозами испытуемого препарата, затем после контрольного заражения всех животных одной дозой инфекционного агента определяют число выживших (заболевших) в каждой группе. После этого, используя статистические методы, расчитывают величины доз, обеспечивающих защиту 50% животных в опыте (9,61). - «Метод постоянной дозы антигена» - основан на определении иммуного ответа групп животных, иммунизированных одинаковой дозой антигена. Иммуногенную активность в этом случае оценивают по степени устойчовости к инфекционному агенту (LDSo)(9,60).
В некоторых случаях, при контроле иммуногенности вакцинных препаратов (105,126,127,151), определяют «индекс защиты», представляющий собой отношение величины LD5o для иммунизированных животных к величине LD5Q контрольных животных, выраженное в логарифмах, который характеризует иммуногенную активность препарата (60).
Получение биомассы пастерелл для изготовления вакцины
Первый этап нашей работы, посвященный получению биомассы пастерелл в больших количествах со стабильными иммунобиологическими свойствами начат с изучения биологических свойств штаммов P. multocida: №115, №1231, ВК-3, №11039 и №15742, отработки условий их поддержания, хранения и контроля. Эксперименты начаты с высева исследуемых штаммов на питательные среды - МПБ, МЛА, МППА и кровяной агар. Посевы инкубировали при температуре 37С до 72 часов. Через 18-24 часа культивирования наблюдали незначительное равномерное помутнение бульона с образованием «муаровых волн» при встряхивании. Через 48-72 часа отмечали просветление бульона с образованием слизистого осадка, поднимающегося при встряхивании в виде «косички».
На МПА через 18-24 часа культивирования отмечали наличие мелких, прозрачных, росинчатых, гладких колоний.
На МППА рост культуры пастерелл происходил по уколу в виде беловатого стержня, окружающая среда при этом оставалась прозрачной.
На кровяном агаре наблюдали рост мелких (1-2мм), округлых, выпуклых колоний (рисЛ). Зона гемолиза вокруг колоний отсутствовала.
В мазках из культур окрашенных по Граму обнаруживали грамотрицательные коккобактерии или короткие палочки, расположенные одиночно или попарно (рис.2).
В мазках-отпечатках из паренхиматозных органов и крови павших белых мышей и кур, окрашенных по Романовскому-Гимза, микробные клетки выглядели в виде биполяров (интенсивно окрашены концевые участки бактерий). У всех штаммов пастерелл, выращенных на кровяном агаре, при окрашивании по Бурри-Гинсу, на темном фоне была видна капсула, в виде светлого ореола вокруг микробных клеток.
Серовариантную принадлежность пастерелл определяли в РНГА по капсульному антигену и в РА по соматическому антигену с сыворотками полученными в лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ. Основные биохимические свойства штаммов P. multocida представлены в табл. 1.
Дальнейшая серия экспериментов была посвящена изучению антигенных свойств, т.е. способности пастерелл вызывать выработку специфических антител в организме привитой птицы. С этой целью использовали инактивированную суспензию P. multocida с концентрацией 10 млрд. м.к./см каждого серовара пастерелл. Микробную суспензию готовили из 18-24 часовых бульонных культур P. multocida, убитых формалином, осажденных на центрифуге и ресуспендированных до требуемой концентрации забуференным физиологическим раствором.
При проведении опыта сформировали 2 группы СПФ-цыплят 25-суточного возраста по 5 голов в каждой. Первую группу вакцинировали полученным антигеном в грудную мышцу в объеме 0.3 см3, вторую группу не иммунизировали и она служила отрицательным контролем. Через 14 дней после вакцинации проверили наличие противопастереллезных антител в сыворотке крови птиц в ИФА с использованием наборов фирмы КРЦСША). Рассчет титра антител в сыворотках крови проводили по одному разведению (1:400) по формуле: logw ТИТР = 0.935 {logw ИС/ПК) + 3.47, где
ИС/ПК - отношение оптической плотности исследуемой пробы сыворотки крови к положительному контролю; 0.935 и 3.47 - постоянные коэффициенты.
У иммунизированных цыплят средний уровень антител составлял 3283 + 128, тогда как у контрольных специфические антитела не выявлены. Полученные результаты свидетельствуют о том, что тестируемые штаммы пастерелл вызывают выработку специфических антител в организме привитой птицы.
Вирулентность штаммов пастерелл оценивали в опытах на белых мышах и курах, определяя минимальные дозы микробных клеток вызывающих гибель 50% биологических объектов. Результаты учитывали в течение 10 суток после заражения. Белые мыши и куры погибали в течение 12-72 часов. При экспериментальном пастереллезе у мышей кроме незначительного угнетения, другие клинические признаки заболевания не установлены. У кур наблюдали угнетение, отказ от корма. У некоторых птиц отмечено истечение из носовой полости.
Изготовление опытных образцов вакцины против пастереллеза птиц и изучение их физических и ммунобиологических свойств
Целью данного этапа работы было изготовление опытных образцов инактивированной эмульсионной противопастереллезной вакцины и изучение их физических и иммунобиологических свойств.
Образцы эмульсионной вакцины готовили на микроразмельчителе тканей РТ-2, при постоянном перемешивании масляного адъюванта Montanide 18А-70(скорость вращения мешалки 600 об/мин., температура 20-22С) медленно подавали антиген. Перемешивание осуществляли в течение 5 минут.
Исходя из соотношения масляной и водной фаз 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 получили несколько опытных образцов вакцины. У которых в первую очередь изучили кинематическую вязкость и стабильность. Все образцы вакцины содержали по 2 млрд. м.к./см каждого из трех используемых в работе сероваров пастерелл. 2.2.3.1. Физические свойства вакцины
Основной задачей данного раздела был подбор оптимального количества масляного адъюванта и антигена, которые бы позволили получить стабильную эмульсию с относительно низкой вязкостью. Результаты опытов представлены в табл. 7.
Изготовленные образцы эмульсионной вакцины имели относительно низкую вязкость (от 60.3 до 93.4 мм2/с) и сохраняли стабильность в течение всего срока наблюдения, кроме образцов №№ 3 и 4. Незначительное отслоение масляного адъюванта на поверхности гомогенной эмульсии (креминг) наблюдали при хранении вакцины в течение 3-4 мес. при температуре (2-8)С и (18-22)С в образцах №№ 1, 2. Вакцина приобретала первоначальный вид при тщательном встряхивании флаконов. Через 7-14 суток хранения при температуре 37С и через 1-3 мес. хранения при температуре (2-8) С и (18-22) С наблюдали расслоение эмульсии на водную и масляную фазы в образцах №№ 3,4.
В результате проведенных исследований установлено, что наиболее выгодными для практического применения физическими свойствами обладал образец вакцины с объемным соотношением антигена и адъюванта Montanide ISA- 70 30:70. Вакцина обладала стабильностью в течение 12 месяцев хранения при температуре 2-8 С и 18-22С. Кинематическая вязкость данного образца вакцины при температуре 20±2С составляла 68.5 ±5 мм /с.
В соответствии с требованиями Международного эпизоотического бюро обязательными тестами при контроле качества инактивированных вакцин являются оценка на безвредность, реактогенность, иммуногенность и продолжительность иммунитета.
Поскольку все инактивированные эмульсионные вакцины содержат в той или иной степени реактогенные масляные адъюванты, то при парентеральном введении животным они должны вызывать ответную реакцию. Поэтому при проведении испытаний на безвредность. и реактогенность препаратов мы имели ввиду допустимые нормы таких реакций, но не их отсутствие. Кроме того, учитывая реактогенность масляных адъювантов, за максимальный прививной объём вакцины для белых мышей мы приняли - 0.2 см3, а для птиц - 0.5 см3.
Перед проверкой вакцины на безвредность провели эксперименты по определению токсичности биомассы пастерелл, инактивированной АЭЭИ.
Инактивированную аминоэтилэтиленимином бактериальную суспензию осаждали низкоскоростным центрифугированием, а осадок 10 % использовали в концентрации 2.5 10 м.к. в 1см .
Токсичность инактивированной биомассы определяли на белых мышах массой 16-18 г, путем подкожной инъекции суспензии в объеме 0.5 см , с концентрацией 15, 10 и 5 млрд. м.к./см . Учет результатов проводили через 1, 2 и 10 суток. В течение всего срока наблюдения мыши оставались живы.
Безвредность вакцины определяли на белых мышах массой 16-18 г и а -Ї цыплятах 3-х месячного возраста, которым вводили 0.5 см и 1.5 см вакцины соответственно. В течение 10 суток наблюдения мыши и цыплята оставались живы, клиническое состояние животных не изменялось.
Реактогенность вакцины оценивали на курах по наличию тканевых реакций в месте введения препарата. Вакцину вводили в объеме 0.5 см внутримышечно в грудную мышцу. Температурная реакция у птиц оставалась в пределах допустимых границ. При наружном осмотре не установлено наличие какой-либо припухлости, покраснения в месте введения препарата. При патологоанатомическом вскрытии наблюдали отечность, побледнение тканей вокруг места инъекции препарата на площади 1-2 см2 в диаметре, присутствие вакцины в тканях.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют, что вакцина против пастереллеза птиц инактивированная эмульсионная безвредна для белых мышей и кур, слабореактогенна, при введении цыплятам прививного объема 0.5см .
