Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные проблемы и перспективы антимикробной терапии 12
1.2. Использование гетероциклических соединений в качестве антимикробных препаратов 23
1.3. Антимикробное действие новых гетероциклических соединений 31
1.4. Химические соединения гетероциклических рядов с антиоксидантной активностью 38
1.5. Использование гетероциклических соединений в качестве ауторегуляторных веществ 47
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Экспериментальные модели 53
2.2. Химические соединения, использованные в работе 54
2.3. Определение антимикробной активности соединений 59
2.4. Изучение токсичности исследуемых соединений 60
2.4.1. Определение токсичности на тест-объектах дафниях больших {Daphnia magna Straus) 61
2.4.2. Определение острой токсичности соединений на белых лабораторных мышах 64
2.5. Определение основных биохимических показателей крови белых лабораторных мышей 64
2.6. Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. Изучение антимикробной активности веществ из разных классов поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений 68
3.1. Отбор перспективных химических соединений разных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов микроорганизмов 68
3.2. Изучение антибактериальной активности отобранных соединений по отношению к клиническим штаммам микроорганизмов 72
Глава 4. Анализ проявления антимикробной активности в зависимости от химической структуры соединений 76
Глава 5. Определение токсичности отобранных поликарбонильных карбо и гетероциклических соединений на разных биотест-объектах 84
5.1. Определение острой токсичности отобранных поликарбонильных карбо и гетероциклических соединений на биотест-объектах/), magna Straus 84
5.2. Определение токсичности отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений на белых лабораторных мышах 87
5.3. Оценка действия отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений на метаболическую активность в организме белых мышей по биохимическим показателям крови 88
Заключение 102
Выводы 110
Список литературы 111
Приложение 128
- Современные проблемы и перспективы антимикробной терапии
- Использование гетероциклических соединений в качестве ауторегуляторных веществ
- Отбор перспективных химических соединений разных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов микроорганизмов
- Оценка действия отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений на метаболическую активность в организме белых мышей по биохимическим показателям крови
Введение к работе
Актуальность темы. Формирование устойчивости бактерий к антимикробным препаратам остается одной из самых актуальных проблем современной медицинской и ветеринарной микробиологии (Навашин, 1994; Сидоренко, 1995, 1998; Страчунский, Козлов, 2001). Природная лекарственная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов и обусловлена отсутствием или недоступностью мишени действия антибиотика; в этом случае традиционные антибиотики клинически неэффективны. Примером может служить резистентность микоплазм и псевдомонад к бензилпенициллину или бактерий к противогрибковым препаратам (Егоров, Сазыкин, 1999). Приобретенная устойчивость связана со способностью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Различают первичную, имеющуюся до начала лечения антимикробными препаратами, и вторичную приобретенную устойчивость, которая развивается и возрастает в процессе антимикробной терапии и обусловлена изменением генома микробной клетки в результате мутаций или внехромосомного (плазмидного) переноса генетической информации от одной микробной клетки к другой с последующей селекцией устойчивых штаммов микроорганизмов (Розенфельд, 1986; Сазыкин, 1998; Сидоренко, 1999; Романова, 2001; Страчунский и др., 2002).
Особое внимание с точки зрения клинической значимости и уровня антибиотикорезистентности заслуживают метициллинорезистентные стафилококки (MRSA), у которых метициллинрезистентность является маркером полирезистентности ко всем -лактамным антибиотикам и ассоциирована с устойчивостью к аминогликозидам, линкозамидам и фторхинолонам. Кроме того, MRSA имеют тенденцию к эпидемическому распространению, что делает данную проблему крайне важной (Фомина, 1997; Сазыкин, 1998; Яковлев, 1999; Белобородова и др., 2000; Проценко и др., 2005).
Одним из перспективных путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов является поиск и внедрение в практику новых антибактериальных веществ, в том числе с отличным от широко применяемых антибиотиков строением и механизмом действия (Яковлев, 1999; Страчунский, 2001). В связи с вышеизложенным, поиск веществ с антибактериальной активностью среди новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов и изучение их антибактериального действия на различные микроорганизмы является актуальным и имеет прикладное значение.
Цель работы: изучение антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов, токсичности наиболее перспективных соединений и их влияния на метаболические процессы в организме лабораторных животных.
Задачи исследования:
-
Провести отбор перспективных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений различных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
-
Оценить антибактериальное действие отобранных соединений на клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
-
Выявить взаимосвязь проявления антимикробной активности отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с особенностями их химической структуры.
-
Изучить токсичность отобранных соединений на биотест-объектах Daphnia magna Straus и на белых лабораторных мышах.
-
Определить влияние отобранных соединений на активность ключевых ферментов метаболизма, состояние белкового, липидного и углеводного обменов в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.
Научная новизна. В работе впервые дана характеристика антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов: фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, енамина, семикарбазона в отношении тест-штаммов бактерий Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P и грибов Candida albicans 18; отобраны 10 наиболее перспективных в плане дальнейшего изучения. Все соединения были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Отмечена высокая антибактериальная активность препарата ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по отношению ко всем используемым бактериям. Выявлены 8 перспективных антистафилококковых препаратов из ряда халкона (№ 44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№ 45, 46, 49), енаминов (№ 4), семикарбазонов (№ 9, 10). Показана фунгицидная активность в отношении стандартного тест-штамма Candida albicans 18 соединения из ряда енаминов (№ 4).
Установлена самая высокая антимикробная активность по отношению к метициллинорезистентным клиническим штаммам стафилококка соединения ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по сравнению с другими изучаемыми соединениями; МПК для MRSA составила 3,12 мкг/мл, для MRSE – 1,28 мкг/мл. Данное соединение также обладало высокой антимикробной активностью в отношении метициллиночувствительных клинических штаммов S. aureus, S. epidermidis и S. hominis, (МПК 0,80 мкг/мл). Этот же препарат был эффективен и в отношении клинических штаммов Escherichia coli и Proteus vulgaris.
Впервые установлена зависимость антимикробной активности изучаемых соединений от значений их молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.
Определены показатели токсичности отобранных соединений на биотест-объектах D.magna и белых лабораторных мышах и отобраны 4 нетоксичных препарата, для которых впервые изучено влияние на метаболическую активность в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили отобрать перспективные соединения с антимикробной активностью в отношении стандартных тест-штаммов E. coli 113-13, B. cereus 8035, S. aureus 209 P, и C. albicans 18, и клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, не обладающие токсичностью по отношению к биотест-объектам и не оказывающие существенного влияния на активность ключевых ферментов, состояние белкового, углеводного и липидного обменов в организме лабораторных животных. Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, 44, 46 и 4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.
Результаты проведенных исследований позволяют проводить направленный синтез новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с антимикробной активностью в ряду фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов и енамина. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Антимикробной активностью по отношению к стандартным и клиническим штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также к низшим грибам обладают 10 представителей новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений классов фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов, енаминов.
-
Перспективные по антимикробной активности соединения классов фенилпентендиона (ПНВ-1), халкона (№ 44), енаминов (№ 4) и полифункциональнозамещенных эфиров (№ 46) являются малотоксичными для гидробионтов (Daphnia magna) и белых лабораторных мышей.
-
Отобранные поликарбонильные карбо- и гетероциклические соединения ПНВ-1, № 44, № 46, № 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не вызывают выраженных изменений активности ключевых ферментов метаболизма и показателей белкового и углеводного обменов в организме белых мышей.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях различного ранга: научной коференции молодых ученых вузов Поволжского региона «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2006-2009), межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); XI Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2009); общероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2009).
Работа выполнена на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского в рамках темы НИР «Разработка методологии создания и тестирования новых препаратов с антимикробной активностью» совместно с сотрудниками Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского в период с 2005 по 2009 годы. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.
Исследования были частично поддержаны 2 грантами: CRDF RUB 1-570-SA-04 при финансовой поддержке Palomar Medical Technologies, Burlington, USA; грант «Проведение научных исследований молодыми учеными (4 очередь)» 2006-РИ-19.0/001/028 в рамках федеральной целевой научно-технической программы «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 146 страницах текста, включают 10 рисунков, 13 таблиц. Список использованных литературных источников включает 171 наименование, в том числе 51 иностранных авторов.
Современные проблемы и перспективы антимикробной терапии
Основой терапевтического действия антимикробных препаратов является подавление жизнедеятельности возбудителя за счет угнетения различных метаболических процессов, которое происходит в результате связывания антибиотика с мишенью, в качестве которой может выступать либо фермент, либо структурная молекула микроорганизма. Однако в процессе эволюции многие микроорганизмы адаптировались к присутствию в окружающей среде антимикробных препаратов, что привело к возникновению устойчивости к ним [90].
История антибиотиков насчитывает чуть более 70 лет, хотя роль микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний была известна уже со второй половины XIX века.
В 1929 году А. Флемингом был открыт новый препарат пенициллин, который только в 1940 году удалось выделить в кристаллическом виде. Это новое и весьма эффективное химиотерапевтическое вещество получено в результате жизнедеятельности плесневого гриба, т.е. биосинтетическим путем. У пенициллина оказалось столько достоинств, что он до сих пор широко применяется в ветеринарной и медицинской практике. Главные из них - высочайшая антибактериальная активность и безопасность [64]. Другой антибиотик, цефалоспо-рин, выделенный в 1945 году, дал жизнь новой группе полусинтетических антибиотиков - цефалоспоринам, оказывающих сильнейшее антибактериальное действие. Некоторые из их способны убивать грамположительные и грамотри-цательные микроорганизмы, другие действуют на устойчивые штаммы бактерий. В настоящее время число выделенных, синтезированных и изученных антибиотиков исчисляется десятками тысяч, около тысячи применяются для лечения инфекционных и микозных болезней, а также для борьбы со злокачественными заболеваниями [65]. При воздействии ряда антибиотиков на чувствительные к ним микроорганизмы нередко возникают формы, устойчивые к их действию.
В связи с широким использованием антибиотиков в различных сферах практической деятельности возникновение устойчивых форм микробов приобретает важное значение. Резистентность микроорганизмов проявляется не только к антибиотикам, но и к химически синтезированным лечебным препаратам. Так, в связи с широким и активным применением в лечебной практике фторхи-нолонов наблюдается появление и распространение устойчивых к ним микроорганизмов [98].
При этом необходимо подчеркнуть, что чем активнее применяются антибиотики в качестве химиотерапевтических веществ, тем больше возникает устойчивых к ним форм бактерий. Так, если в первый период применения пенициллина обнаружено около 8% резистентных форм Staphylococcus aureus, то к концу 1950 г., т. е. меньше чем через десять лет, их число возросло до 70%. Аналогичное положение наблюдалось и с другими антибиотиками. Когда в начале 1950 г. в Японии были введены в медицинскую практику стрептомицин, тетрациклин и хлорамфеникол, устойчивые к этим антибиотикам штаммы Shigella составляли 0,04%, но постепенно мультирезистентные штаммы распространились, и через 20 лет их число достигло 90%.
Различают два основных типа лекарственной резистентности микроорганизмов: природную и приобретенную.
Природная устойчивость обусловлена отсутствием или недоступностью у микроорганизмов мишени действия антибиотика. Примером может служить резистентность микоплазм и псевдомонад к бензилпенициллину или бактерий к противогрибковым препаратам. При наличии у бактерий природной устойчивости антибиотики клинически неэффективны. Природная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов [103].
Актуальной проблемой является приобретенная устойчивость, которая связана со способностью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Различают первичную и вторичную приобретенную устойчивость. Первичная устойчивость возбудителей имеет место еще до начала лечения антимикробными препаратами, вторичная устойчивость развивается и возрастает в процессе антимикробной терапии. Приобретенная устойчивость обусловлена изменением генома микробной клетки в результате мутаций или внехромосомного (плазмидного) переноса генетической информации от одной микробной клетки к другой с последующей селекцией устойчивых штаммов микроорганизмов [96].
Формирование резистентности во всех случаях обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов. Основной механизм приобретенной резистентности реализуется за счет R-плазмид (от англ. resistance - устойчивость), которые содержат гены, определяющие устойчивость к одному или нескольким антимикробным препаратам. Плазмиды легко передаются микроорганизмам разных видов, родов и даже семейств посредством трансформации, трансдукции и конъюгации. Легкость передачи плазмид лежит в основе эпидемического распространения ан-тибиотикорези-стентности в условиях лечебного учреждения. Гены множественной лекарственной устойчивости таюке могут локализоваться в транспозонах, интегрированных в плазмиды.
Резистентные к антибиотикам бактерии обнаруживаются не только в клиниках при использовании этих биологически активных соединений в качестве лечебных препаратов, но и в естественных природных условиях. В некоторых регионах в грунтовых водах обнаруживается высокое содержание резистентных к антибиотикам форм кишечной палочки, хотя применение антибиотиков в этой местности было крайне ограниченным. Одной из возможных причин такого феномена может быть «слабое селективное давление в результате какого-то, пусть небольшого, количества антибиотика в природной среде» [89]. Глобальный характер проблема резистентности микроорганизмов приобрела в конце 80-х - начале 90-х гг. XX столетия. Многие развитые страны начали разрабатывать и осуществлять на практике национальные программы по сдерживанию возникновения и распространения резистентных форм микроорганизмов.
Теоретический смысл изучения факторов приспособления микроорганизмов к антибиотикам определяется необходимостью выявления механизма этого явления, вскрытия причин адаптации микроорганизмов к новым условиям существования.
Практическое значение проблемы адаптации микробов к действию антибиотиков обусловлено тем, что появление резистентных форм in vivo при применении антибиотиков в лечебной практике или в борьбе с фитопатогенными организмами приводит к существенному снижению лечебных свойств антибиотиков. Поэтому применение антибиотиков в клинике и особенно выбор того или иного препарата для назначения больному должны учитывать его эффективность в отношении возбудителя заболевания и индивидуальные особенности больного [97]. Разнообразие взглядов на феномен резистентности микроорганизмов к антибиотикам и его всё возрастающее значение при практическом использовании этих биологически активных веществ требует более подробно рассмотреть все имеющиеся сведения о причинах (механизмах) устойчивости микроорганизмов к антибиотикам [32]. Можно указать на следующие основные факторы, приводящие к устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.
1. Состояние клеточной стенки, при котором антибиотик задерживается на поверхности клетки и не проникает внутрь в результате ухудшения проницаемости антибиотиков через пориновые каналы внешней мембраны или по другим причинам.
2. Способность клетки разрушать лекарственный препарат раньше, чем он сможет проявить биологическое действие, посредством конститутивных либо индуцируемых ферментов, усиленно синтезируемых клеткой в присутствии антибиотика, или модифицировать антибиотик.
3. Изменение клеточных структур (рибосом, мембран и др.) или модификация активных центров антибиотика, находящегося в клетке, под действием ряда факторов. 4. Способность бактерий снижать концентрацию антибиотика внутри клетки в результате активного выноса антибиотика.
5. Нарушение в микробной клетке мишени, ответственной за чувствительность микроорганизма к антибиотику.
6. Перенос генов антибиотикорезистентности от устойчивых штаммов микроорганизмов к чувствительным.
Использование гетероциклических соединений в качестве ауторегуляторных веществ
В настоящее время в современной микробиологии существует концепция, согласно которой развивающаяся клеточная культура представляет собой саморегулирующую систему, поведение которой определяется не только воздействием внешних факторов, но и влиянием ауторегуляторных метаболитов, контролирующих скорость и этапы развития культуры [120]. Оригинальные отечественные и зарубежные статьи по низкомолекулярным микробным ауторегуля-торам обобщены в монографии А.С. Хохлова [111]. В последние годы опубликован ряд работ по микробной колониальной организации и биокоммуникации, в которых микробная колония рассматривается как целостная структура или даже надорганизменная система, а выделяемые химические вещества выступают в качестве факторов межклеточной коммуникации и социального поведения [67, 102, 148]. Расширяется список работ, посвященных плотностнозависимой (кворумзависимой) коммуникации, состоящей в том, что по концентрации сигнального вещества коллектив организмов оценивает собственную плотность [66, 133, 159]. Если плотность достигла определенного порогового значения (кворума), то предпринимаются те или иные коллективные действия. К числу описанных к настоящему времени явлений относятся, например, биолюминесценция у морских бактерий, где в роли диффундирующих химических факторов коммуникации выступают ацилированные лактоны гомосерина. Некоторые грамположительные бактерии используют также пептидные факторы плоност-нозависимой коммуникации, например определяющие спорообразование у бацилл. В роли факторов межклеточной коммуникации могут выступать некоторые аминокислоты (глутамин, аспарагиновая кислота) [68].
Классификация метаболитов с конкретной сигнальной функцией построена на выяснении их взаимодействий: меж- или внутривидовых, а также благоприятного или вредного характера воздействия на микроорганизмы [171]. Термин «семиохемики» был предложен для обозначения всех метаболитов с сигнальной функцией [141], разделяющихся на два класса и обеспечивающих межвидовые (алломоны, кайромоны, депрессоры) и внутривидовые (аутоксины, аутоингибиторы адаптации, ферромоны) взаимодействия. Следует отметить, классификация и термиология метаболитов с сигнальной функцией достаточно условна, поэтому в последнее время наиболее употребимым стал термин «факторы ауторегуляции» [169].
Под ауторегуляторными факторами понимают физиологически активные соединения различной химической природы, выделяемые микробной популяцией или ее частью в окружающую среду, не используемые в целях конструктивного и энергетического метаболизма, но играющие в клеточном сообществе сигнальную роль к изменению количественного (скорость роста) и качественного (дифференциация) состояния микробной культуры [114]. Группу таких метаболитов назвали факторами d (от англ. differentiation). Было показано, что микроорганизмы различных таксонов в процессе развития синтезируют и выделяют в окружающую среду ауторегуляторные метаболиты двух типов: аутостимуляторы автолиза (факторы ck) жирнокислотной природы [91] и аутоин-дукторы анабиоза (факторы di), являющиеся фенольными соединениями [114, 115]. Одной из последних и наиболее полных работ, посвященных вопросам ау-торегуляции образования покоящихся форм бактерий, механизмам анабиоза и свойствам аутоиндукторов анабиоза - факторов db является монография О.В. Бухарина с соавторами [16].
Фенольные соединения представляют собой один из наиболее многочисленных классов природных соединений с различной биологической акивностью [7, 38], состоящие из одного ароматического бензольного кольца и являющиеся производными фенола (оксибензола) или дигидроксифенола (диоксибензола -резорцина) [84]. Фенольные липиды состоят из фенольной части и углеводородной цепи различной длины, соединенной с ароматическим ядром. Наиболее часто встречаются резорцинольные липиды, присутствующие в различных живых организмах и представленные широким спектром гомологов и изомеров. Фенольные липиды с алкильным радикалом и двумя ОН-группами в метаполо-жении называются алкилрезорцинами или алкилоксибензолами (АОБ). Впервые производные алкилрезорцина были обнаружены при изучении липидного экстракта Azotobacter vinelandii [154, 155, 160], позже были идентифицированы два алкилрезорцинольных гомолога в липидах Azotobacter chroococcum [8, 71]. Те же гомологи были найдены в культуре грамотрицательной водородокис-ляющей бактерии Pseudomonas carboxydoflava [71]. Позже были изолированы резорцинолы из культуральной жидкости Streptomyces cyaneus [167]. Присутствие этих соединений в почвенных бактериях авторы связывают с фиксацией азота и симбиозом микроорганизмов с высшими растениями [138].
В основе ассоциативных симбиотических взаимодействий микроорганизмов лежат трофические, пространственные и защитные связи, обеспечивающие выживание симбионтов в природных местообитаниях и в организме хозяина. Наибольший интерес с точки зрения феномена выживания представляют защитные связи, поскольку они сопряжены с персистенцией ассоциантов в клетках организма-хозяина или на их поверхности. Следует подчеркнуть, что необходимым условием выживания микросимбионтов является их устойчивость к кислородзависимым и кислороднезависимым эффекторным механизмам иммунитета организма хозяина. Она обеспечивается способностью микроорганизмов в инактивации лизоцима, гистонов, комплемента и других факторов естественной защиты хозяина, занимающей центральное место в современной классификации факторов бактериальной персистенции [17].
Способность бактерий специфически инактивировать лизоцим хозяина была определена как их антилизоцимная активность (АЛА). Данное свойство до настоящего времени изучалось преимущественно у штаммов стафилококков, выделенных от бактерионосителей. Обнаружена зависимость между степенью антилизоцимной активности стафилококков и интенсивностью их размножения внутри эпителиоцитов, а также длительностью персистирования: от резидентных бактерионосителей значительно чаще выделялись штаммы с высокой АЛА [20]. Определена роль антилизоцимной активности в персистенции стафилококков: так, штамм золотистого стафилококка, обладающий этим признаком, более длительно персистировал в организме инфицированных мышей в сравнении с изогенным клоном без антилизоцимного признака. Установлено изменение популяционной структуры золотистого стафилококка по уровню антилизоцимной активности и факторам патогенности в связи с динамикой микробной обсемененности при разных типах течения инфекции. При остром затухающем типе инфекционного процесса наблюдается селекция низкоантилизоцимных клонов и элиминация факторов патогенности, при персистирующем типе инфекционного процесса - селекция высокоантилизоцимных клонов и обратная зависимость с экспрессией в популяциях клонов с факторами патогенности [112]. Показано, что штаммы стафилококков, выделенные от больных с затянувшимся гнойно-воспалительным процессом, чаще обладали способностью инактивировать лизоцим; обнаружена корреляционная связь между антилизоцимной активностью стафилококка и клинической стадией воспалительных заболеваний внутренних женских половых органов [73]. Совершенно очевидно, что если роль антилизоцимного фактора бактерий в их персистенции в фагоцитах существенна, то у бактерий, паразитирующих в так называемых непрофессиональных фагоцитах, она, вероятно, возрастает еще больше и может иметь патогенетическое значение. Способность паразита уклоняться от встречи с профессиональными фагоцитами хозяина общеизвестна и понятна, так как микроорганизмы пытаются проникнуть в иммунологически слабо защищенные клетки. Такой подходящей для них мишенью служат защищенные только лизо-цимом различные эпителиальные поверхности внутренних органов, где поселяются бактерии. Доказано внутриклеточное выживание стафилококков в эпителии носовой полости хозяина, что согласуется с наличием у них антилизо-цимного фактора.
Отбор перспективных химических соединений разных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов микроорганизмов
На первом этапе работы нами была изучена антимикробная активность 66 новых карбо- и гетероциклических соединений различных классов. Представляло интерес установить взаимосвязь между антимикробной активностью и особенностями химической структуры исследуемых соединений.
Для первичного скрининга веществ использовали стандартные тест-штаммы микроорганизмов Escherichia coli 113-13, Staphylococcus aureus 209 Р, Bacillus cereus 8035, Candida albicans 18. E.coli 113-13 является представителем грамотрицательных палочек, S. aureus 209 P - грамположительных кокков, B.cereus 8035 - грамположительных спорообразующих палочек, а С. albicans 18 - представитель низших грибов рода Candida. Результаты по антимикробной активности исследуемых соединений представлены в таблице 7. В ходе проведенных исследований было установлено, что соединения классов гидроксицик-логексанонов, гидроиндазолов, оксимов, циклогексенонов и тетрагидротриазо-лохиназолинов не обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов.
Из пяти изученных соединений ряда фенилпентендиона только два препарата обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов. Препарат 2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион (ПНВ-1) характеризовался эффективным антимикробным действием в отношении грамположительных бактерий - S. aureus 209 Р и В. cereus 8035. МІЖ для каждого из этих микроорганизмов составила 6,75 мкг/мл, при этой концентрации проявлялось бактерицидное действие препарата. В отношении Е. coli 113-13 в зависимости от концентрации ПНВ-1 обладал как бактериостатическим, так и бактерицидным действием. Так при инкубации бактерий с препаратом в концентрации 0,5 мкг/мл через 24 часа на плотной питательной среде рост отсутствовал, однако на вторые сутки появлялись отдельные изолированные колонии. Концентрации ПНВ-1 от 1 мкг/мл и выше оказывали выраженное бактерицидное действие наЕ. coli 113-13.
Препарат 1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион (ПНВ-Б) проявил низкую антимикробную активность в отношении стандартных тест-штаммов по сравнению с ПНВ-1. Выявлено антимикробное действие только на S. aureus 209 Р, для которого МПК составила больше 25 мкг/мл. Исследованные соединения ряда халкона (3-(диметиламино-бензилиден)пентан-2,4-дион (№ 44) и этил-2-(4-гидроксибензилиден)-3-оксобутаноат (№ 47)) характеризовались антимикробным действием в отношении S. aureus 209 Р (МІЖ 1,6 мкг/мл). Однако эти вещества не обладали антимикробной активностью в отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035.
Из 5 протестированных представителей полифункциональнозамещенных эфиров было отобрано три вещества: 2,2 -ди-(3-(3-метокси-4-гидроксифенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый (№ 46), 2,2 -ди-(3-фенил-2,4-ди-ацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый (№ 45), 2,2 - ди -(3-(3 - нитрофенил)-2,4- диацетил-5-гидрокси-5- метилциклоген-1-ил)-диэтиловый (№ 49).
Установлены бактерицидные свойства этих соединений в отношении S. aureus 209 Р (МПК 0,8 мкг/мл). В отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035 исследованные препараты антимикробной активностью не обладали.
Было изучено 15 соединений, относящихся к ряду тетрагидротриазолохи-назолинов, енаминов, семикарбазонов Среди 6 изученных представителей ена-минов антимикробной активностью обладал только один препарат с лабораторным шифром № 4 - этил-2-метил-4-(1-пиперидил)-6-(3-нитрофенил)-циклогекса-1,3-диенкарбоксилат. Это соединение характеризовалось эффективными бактерицидными свойствами в отношении S. aureus 209 Р (МПК 1,6 мкг/мл).
Из 6 соединений семикарбазонов выявлена высокая антимикробная активность двух препаратов: № 9 -диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-(4-метоксифенил)-циклогексан-1,3-дикарбоксилат и № 10 - диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-тиенилциклогексан-1,3-дикарбоксилат. Эти соединения оказывали бактерицидное действие на S. aureus 209 Р, МПК для которого составила 1,6 мкг/мл.
Препараты, относящиеся к рядам тетрагидротриазолохиназолинов, енаминов, семикарбазонов, не обладали антимикробной активностью в отношении тест-штаммов Е. coli 113-13 и В. cereus 8035. Из всех 66 протестированных препаратов, относящихся к различным кар-бо- и гетероциклическим соединениям, только один - представитель ряда ена-минов № 4 - этил-2-метил-4-(1-пиперидил)-6-(3-нитрофенил)-циклогекса-1,3 диенкарбоксилат проявлял эффективную фунгиостатическую активность в отношении С. albicans 18. МІЖ этого соединения для С. albicans составила 6,75 мкг/мл.
Таким образом, на первом этапе работы из 66 изученных соединений были выявлены 10 представителей новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений различных классов, характеризующиеся антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также к С. albicans 18.
Среди соединений ряда фенилпентендиона наиболее перспективным соединением является ПНВ-1, поскольку оно проявляло высокую антибактериальную активность по отношению к представителям грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Из исследованных соединений отобраны 8 перспективных антистафилококковых препаратов, которые являлись представителями ряда халкона (№ 44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№ 45, 46, 49), енаминов (№ 4), семикарбазонов (№ 9, 10). Помимо этого соединение № 4 из ряда енаминов обладало фунгицидной активностью по отношению к С. albicans 18.
Из всех исследованных соединений к наиболее перспективным препаратам, обладающим антимикробной активностью по отношению к грамотрица-тельным бактериям, следует отнести представителя ряда фенилпентендиона ПНВ-1.
Для дальнейшей работы были отобраны 9 препаратов, которые имели значения МІЖ не более 10 мкг/мл для всех стандартных тест-штаммов микроорганизмов.
Оценка действия отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений на метаболическую активность в организме белых мышей по биохимическим показателям крови
Была проведена оценка действия четырех отобранных малотоксичных соединений с лабораторными шифрами ПНВ-1, №№ 44, 46 и 4 для исследования их влияния на биохимические показатели активности ключевых метаболических ферментов, состояния белкового, липидного и углеводного обменов в организме белых лабораторных мышей. В качестве наиболее информативных показателей по литературным данным нами были выбраны следующие: ACT, АЛТ, ЛДГ, КК, ЩФ, коэффициент де Ритиса и индекс ферментемии [11, 45, 46, 82,116].
Известно, что ACT - один из важнейших ферментов обмена веществ, участвующий в обеспечении поступления субстратов в цикл трикарбоновых кислот. Субстраты этого фермента - аспартат, глутамат, пируват и а-кетоглутарат - относятся к эволюционно самым древним органическим кислотам и присутствуют во всех клетках, играя ключевую роль в обмене веществ. ACT является одним из показателей, отражающих активность катаболических реакций центрального звена метаболизма. Этот фермент участвует в контроле над поступлением субстратов в цикл трикарбоновых кислот для их дальнейшего окисления (ссылка). В отличие от ACT, фермент АЛТ указывает на активность анаболических процессов периферической зоны метаболизма, в частности, цикла ала-нина (глюкозо-аланинового шунта). АЛТ отражает также функциональное состояние печени. Гораздо более информативным, чем отдельно взятые ACT и АЛТ, является их соотношение, отражающееся в коэффициенте де Ритиса [58].
ЛДГ катализирует обратимую реакцию превращения молочной кислоты в пировиноградную, используя окисление-восстановление кофермента НАД, следовательно, эта реакция влияет на мембранный потенциал клетки. Кроме того, ЛДГ участвует в обеспечении работы глюкозо-аланинового шунта. Направление обратимой реакции превращения глюкозы в аланин зависит от рН среды: в кислой среде реакция протекает в направлении гликолиза, а в щелочной - в направлении глюконеогенеза [116].
Фермент КК при повышенных затратах АТФ стимулирует окислительное фосфорилирование в митохондриях. Он активно участвует как в гликолизе, так и в глюконеогенезе, взаимодействуя с ферментами этих процессов. При активизации гликолиза, сопровождающейся повышением активности ЛДГ, происходит закисление среды за счет увеличения образования лактата. В результате равновесие в реакции, катализируемой КК, смещается в сторону образования креатинфосфата за счет АТФ, образующейся в гликолизе. КК участвует в поддержании уровня глюкозы в крови на нормальном уровне, снижает количество одного из основных индукторов агрегации тромбоцитов и тромбообразования -АДФ. Креатинкиназа входит в систему адаптации организма к изменяющимся биоэнергетическим потребностям миокарда, мозга и мышц при различных уровнях оксигенации. Важнейшая роль КК связана с ее работой на ключевых позициях метаболизма. Она регулирует соотношение АТФ/АДФ в клетке, влияя на процессы биологического окисления и гликолиза; обеспечивает транспорт макроэргов из митохондрий в цитоплазму; участвует в транспорте иРНК из ядра в цитоплазму; участвует в обеспечении внутриклеточного баланса фосфора. Повышение в крови активности КК является информативным тестом стрессового влияния, сопровождающегося возрастанием проницаемости клеточных мембран [11]. ЩФ является органно-метаболическим показателем глюкозного гомеостаза. Данный фермент участвует в регуляции уровня глюкозы в крови, формировании пула фосфатов, синергично работает с буферными системами [53].
Состояние энергетического обмена более точно отражается в таком показателе, как индекс ферментемии [58], который характеризует совокупную активность ключевых ферментов метаболизма. В целом индекс ферментемии и коэффициент де Ритиса коррелируют между собой, однако, имеется существенная разница по отношению к контролю. Результаты наших исследований представлены в таблице 13. Установлено, что при ведении лабораторным мышам соединений ПНВ-1, № 46 и № 4 в концентрации 10 мкг/мл увеличивалась через 48 часов активность ACT в сыворотке крови по сравнению с контрольными значениями на 23, 22 и 56% соответственно. Активность ACT при действии препаратов ПНВ-1 и № 4 в концентрации 1 мкг/мл была ниже, чем в контроле, а при введении препарата № 46 в этой же концентрации выше по сравнению с контрольными значениями. Введение препарата № 44 в концентрации 10 мкг/мл уменьшало активность ACT, а в концентрации 1 мкг/мл - увеличивало по отношению к показателям в контрольной группе (рис. 4 А).
Все препараты, за исключением ПНВ-1 в концентрации 10 мкг/мл, уменьшали активность АЛТ в сыворотке крови мышей по сравнению с контрольными значениями. При этом активность АЛТ на фоне действия препаратов № 44, ПНВ-1 и № 46 находилась в обратной корреляции (-0,50) с определяемой концентрацией холестерина. Наибольшее снижение концентрации холестерина отмечено при введении мышам препарата № 4 в концентрации 10 мкг/мл, однако оно не превышало 13%. Изменения активности АЛТ в сыворотке крови мышей при введении соединений № 44 и № 4 не были дозозависимы-ми, следовательно можно не связывать эти изменения с функцией гепатоцитов и сделать заключение, что функция печени не нарушена (рис. 4 Б).
Значения коэффициента де Ритиса, определяемые при введении препаратов мышам, были достоверно выше контрольных значений, что указывало на активизацию центрального звена метаболизма, увеличение поступления субстратов в цикл Кребса и более эффективный энергетический обмен (рис. 5).
Для всех исследуемых препаратов, кроме ПНВ-1 в концентрации 1 мкг/мл, активность ЛДГ в сыворотке крови мышей была выше, чем в контроле, что указывало на повышение образования АТФ в гликолизе (рис. 6).
При введении всех препаратов, за исключением № 46 в концентрации 10 мкг/мл, активность КК была ниже по сравнению с контрольными показателями, что свидетельствовало о повышении проницаемости клеточных мембран.
Для соединений № 44 и № 46 активность КК была прямо пропорциональна вводимой дозе препарата, для ПНВ-1 и № 4 - обратно пропорциональна (рис. 7 А). При введении мышам препаратов №№ 44, 46 (в концентрациях 1 и 10 мкг/мл) и № 4 (в концентрации 1 мкг/мл) активность ЩФ в сыворотке крови была ниже, чем в контроле; а при введении ПНВ-1 (в концентрациях 1 и 10 мкг/мл) и № 4 в концентрации 10 мкг/мл - выше контрольных значений (рис. 7 Б). Определение индекса ферментемии по биохимическим показателям крови мышей, которым вводили препараты № 44 и ПНВ-1 (1 мкг/мл), № 46 (1 и 10 мкг/мл), № 4 в концентрации 10 мкг/мл, показало превышение значений по сравнению с контролем; а при введении ПНВ-1 в концентрации 10 мкг/мл и препарата № 4 в концентрации 1 мкг/мл - его снижение (рис. 8).
Концентрация глюкозы в крови мышей при введении препаратов № 44 (1 и 10 мкг/мл), ПНВ-1, № 46 и № 4 в концентрации 1 мкг/мл достоверно не отличалась от контрольных значений (рис. 9). Введение препаратов № 46 и № 4 в концентрации 10 мкг/мл увеличивало содержание глюкозы, а при действии ПНВ-1 (10 мкг/мл) - уменьшало ее значения по сравнению с контролем. Наиболее низкая концентрация глюкозы соответствовала и более низкому значению индекса ферментемии при действии препарата ПНВ-1 (10 мкг/мл), что позволило сделать заключение об угнетении энергетического обмена в организме экспериментальных животных по сравнению с контролем. В этой же группе мышей отмечена в сыворотке крови большая активность АЛТ, высокая концентрация общего белка и максимальное значение соотношения общего белка и мочевины. Это указывало на явное преобладание анаболических процессов над катаболическими в организме. В сыворотке крови мышей других групп, с введением препаратов № 46 (10 мкг/мл) и № 4 (10 мкг/мл), были отмечены высокие значения глюкозы и наименьшее соотношение общего белка и мочевины (4,0 и 3,8 соответственно), а значения индекса ферментемии выше контрольных значений. Эти показатели в комплексе с описанными выше высокими значе ниями активности ACT и КК указывали на преобладание катаболических процессов над анаболическими в организме мышей.
