Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1 Оценка влияния антропогенных факторов на биологические системы 8
1.2 Сточные воды целлюлозно-бумажной промышленности, их состав и влияние на гидробионтов 15
1.3 Лигнин как природный биополимер и отход ряда производств 20
1.3.1 Структура лигнина 21
1.3.2 Деградация лигнина 25
1.4 Биологические эффекты лигиинсодержащих соединений 27
1.5 Проблемы утилизации лигнина и возможности его применения .34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1 Объекты исследования 39
2.2 Методики экспериментальной работы на моллюсках 41
2.3 Методика экспериментальной работы на растениях 42
2.4 Анафазный метод учета хромосомных аберраций 44
2.5 Статистическая обработка результатов 45
ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ЛИГНИННЫХ ВЕЩЕСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ ОЧИЩЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД ЦБП, НА ОРГАНИЗМЫ ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ 46
ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГИДРОЛИЗНОГО ЛИГНИНА И ПРОДУКТОВ ЕГО МОДИФИКАЦИИ НА ОРГАНИЗМЫ ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЯ 56
4.1. Сравнительная оценка влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации электрическим газовым разрядом на моллюсков и кукурузу 57
4.2 Сравнительная оценка влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации электрогидравлическим ударом на кукурузу 64
4.3 Эффективность контактной обработки образцов гидролизного лигнина последрожжевой бражкой 68
4.4 Испытания образцов гидролизного лигнина в нолевых экспериментах 73
4.4.1 Оценка влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации на рост и урожайность пшеницы 73
4.4.2 Оценка эффективности предпосевной обработки семян гороха исходным гидролизным лигнином и модифицированным электрическим газовым разрядом 77
ГЛАВА 5. ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ БУРЫХ УГЛЕЙ 80
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86
ВЫВОДЫ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
- Оценка влияния антропогенных факторов на биологические системы
- Методика экспериментальной работы на растениях
- Сравнительная оценка влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации электрогидравлическим ударом на кукурузу
Введение к работе
В экспериментах на байкальских эндемичных моллюсках было показано, что воздействие на липюсульфонат нейтронного облучения, приводящее в результате его деструкции к понижению молекулярной массы, сопровождалось снижением цитогенетической активности. На основании этого предполагают, что цитогепетическая активность лигнинсодержащих соединений может быть связана с величиной их молекулярной массы (Новикова и др. 1996). В связи с этим, представляет интерес проверка данного предположения, а также поиск других путей воздействия на ЛСС с целью снижения их генетической опасности и получения продуктов, обладающих положительной биологической активностью. Цель - оценка экологической опасности лигнинсодержащих соединений. Основные задачи:
определить степень экологической опасности лигнинных веществ сточных вод целлюлозно-бумажных предприятий, сбрасываемых в водоемы.
провести сравнительную оценку влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации, на организмы животных и растений.
провести агрохимические испытания образцов гидролизного лигнина - исходного и модифицированных - с целью выявления долговременности эффектов их воздействия на растения.
оценить качество семян растений, обработанных лигнинсодержащими соединениями по показателям прорастания семян и роста главного корешка.
- оценить биологическую активность гуминовых кислот на семенах
кукурузы.
Научная новизна. Впервые установлена мутагенная активность растворимых в воде лигнинных веществ, выделенных из биологически очищенных сточных вод ЦБП, в составе которых они непосредственно сбрасываются в водоёмы на примере моллюсков и кукурузы.
Установлено, что обработка ГЛ электрическим газовым разрядом, электрогидравлическим ударом в водной среде и последрожжевой бражкой приводит к снижению его токсичности и мутагенности, а также появлению стимулирующей активности на прорастание семян и рост сельскохозяйственных растений.
Установлено, что биологическая активность лигнинсодержащих соединений коррелирует с их молекулярной массой и общим содержанием кислых групп. Снижение молекулярной массы лигнинсодержащих соединений и увеличение в их составе общего содержания кислых групп приводит к снижению мутагенных эффектов и одновременному появлению рост-стимулирующей активности.
Оценка влияния гуминовых кислот бурых углей различного происхождения по цитогенетическому показателю на кукурузе показала, что ГК бурых углей не обладают мутагенной активностью.
Практическая значимость работы. Электрический газовый разряд при напряжении 30 и 40 кВ и электрогидравлический удар в водной среде снижают генетическую опасность лигнинсодержащих соединений и способствуют появлению биостимулпрующей активности. В связи с чем, их можно рекомендовать как эффективные способы воздействия на ЛСС.
Продукты модификации гидролизного лигнина, обладающие положительной биологической активностью, при условии их генетической безопасности могут быть использованы в качестве биостимуляторов в сельском хозяйстве. Рекомендуемые к применению концентрации образцов ГЛ-4,0-16,1 мкт/мл.
Защищаемые положения.
1. Растворимые и нерастворимые в воде лигнинные вещества
биологически очищенных сточных вод ЦБП обладают токсичностью и
мутагенной активностью, что указывает на их опасность для водных
экосистем.
2. Гидролизный лигнин обладает токсико-генетической активностью.
Воздействие на гидролизный лигнин электрического газового разряда и
электрогидравлического удара в водной среде снижает его мутагенную
активность и приводит к появлению рост-стимулирующей активности.
3. Появление рост-стимулирующих эффектов и снижение
цитогенетической активности гидролизного лигнина происходит с
понижением его молекулярной массы, а также с увеличением в его составе
общего содержания карбоксильных и фенольных гидроксильных групп.
Апробация. Основное положения работы изложены в 11 публикациях.
Результаты работы были представлены и обсуждены на: региональной
конференции: "Биология-наука XXI века", Пушино, 2002; на Всероссийской
конференции: "Экология Байкала и Прибайкалья, Иркутск, 2001;
международном форуме: "Безопасное развитие регионов", Иркутск, 1997;
международном симпозиуме: "Россия - Германия: История, Культура,
Наука", Иркутск, 1999; международных конференциях: "Студент и научно-
7 технический прогресс", Новосибирск, 2002; "Проблемы экологии. Чтения памяти профессора М.М. Кожова, Иркутск 1995, 1999. Структура диссертации. Диссертация изложена на 125* страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения и выводов. Результаты работы проиллюстрированы 21 таблицами и 8 рисунками. Список цитируемой литературы включает 277 источников, из них 58 работы зарубежных авторов.
Оценка влияния антропогенных факторов на биологические системы
В настоящее время все более актуальной становится проблема антропогенных воздействии на природные комплексы и экосистемы. Одной из важнейших задач охраны окружающей среды является слежение за изменениями, происходящими в ней под влиянием антропогенного фактора, т.е. организация мониторинга (Израэль. 1975; 1981; Дубинин, 1977). Любая система контроля природной среды складывается из экологического мониторинга и анализа полученных данных, на основе которого принимаются решения о перспективах функционирования и практического использования экосистемы (Булгаков, 2002).
Под экологическим мониторингом понимают совокупность наблюдений за компонентами биосферы, специальным образом организованных в пространстве и во времени, а также адекватный комплекс методов экологического прогнозирования. Основными задачами экологического мониторинга является наблюдение за состоянием биосферы, оценка и прогноз ее состояния, определение степени антропогенного воздействия на окружающую сред, выявление факторов и источников воздействия. Особую роль в системе экологического мониторинга играет биологический мониторинг, т.е. мониторинг биологической составляющей экосистемы (Богомолов, 1997), важной частью которого является слежение за биологическими откликами и последствиями загрязнений в биологических системах, что является, в свою очередь, основой для оценки состояния биосферы и его дальнейшего прогноза. Приемами биологического мониторинга являются наблюдения и эксперимент (Федоров, 1979). Наблюдение как основная форма диагностического мониторинга позволяет выявить основные тенденции в изменении окружающей среды при использовании набора определенных показателей. Эксперимент позволяет предсказать последствия этих изменений среды (Константинов, 1979).
Главным методом биологического мониторинга является биоиндикация, смысл которой заключается в регистрации любых изменений в биоте, вызванных антропогенными факторами. В биологическом мониторинге могут быть использованы не только биологические, но и любые другие методы, например, химический анализ содержания загрязняющих веществ в живых организмах (Богомолов, 1997). Биоиндикация в природных сообществах часто представляет единственную возможность получения информации о влиянии параметров среды и их взаимодействиях (Булгаков, 2002). К таким параметрам относятся не только концентрации веществ, но и климатические условия, скорость переноса веществ в водной или воздушной среде, эрозионные процессы в почве, соленость воды и т.д..
Состояние биоты часто оценивают по отклонениям от нормального функционирования отдельных организмов. Изучая различные морфологические, биохимические, цитогенетические и иммунологические характеристики, а также заболеваемость растений и животных, населяющих природные биотопы, можно судить об определенных нарушениях в экосистеме, связанных, в том числе, и с влиянием окружающей среды. Однако, данный подход имеет свои недостатки, связанные с тем, что для индикации состояния всей экосистемы в данном случае берется один или несколько видов, для которых исследуется ограниченное количество признаков. Оценка состояния экосистемы, сделанная на основании данных такого эксперимента, не может быть экстраполирована на весь биоценоз. Тем не менее, в отличие от лабораторных тест-объектов, организмы, взятые из естественных местообитаний, демонстрируют реакции на весь комплекс химических, физических и климатических факторов, характерных для данной экосистемы (Булгаков, 2002).
В последнее время, многие исследователи для обобщенной оценки благополучия экосистемы пользуются методологией БИОТЕСТа, который заключается в исследовании организмов разных таксономических групп, а интегральным показателем их благополучия предлагается считать эффективность физиологических процессов, обеспечивающих нормальное развитие организма. В методологии БИОТЕСТа обычно используются 5 основных подходов к изучению организмов: морфологический, генетический, биохимический, физиологический и иммунологический (Захаров, Кларк, 1995; Захаров, 2000).
Важной стороной в биоиндикации является выбор индикаторного организма или тест-объекта. При выборе индикатора необходимы знания о биологии, биогеографии и экологии организмов, их чувствительность, географическое распространение вида, его редкость, опасность исчезновения, методические особенности работы с организмами, в частности, затраты времени на констатацию наличия или отсутствия патологии (Spang, 1996). В качестве аналитических индикаторов используют различные живые организмы, их органы и ткани, физиологические функции, биохимические реакции и т.д.. Ответным сигналом на воздействие может быть изменение поведенческих реакций, стимуляция или подавление роста, накопление биомассы, изменение пигментации, состава крови, биоэлектрической активности органов и тканей, нарушение функций органов пищеварения дыхания, размножения и др. Обобщенным показателем эффективности действия определяемого соединения на индикаторный организм является либо выживаемость, либо летальный исход (Туманов и др., 1987; Шеховцова, 2000).
Выбор того или иного тест-объекта может зависеть от характера оцениваемого вещества - загрязнителя окружающей среды. Поллютанты в природной среде могут быть биологически нейтральными, токсичными и особо опасными (мутагенными, канцерогенными, тератогенными) (Захариев, 1977; Соколов и Смирнов, 1980). По отношению к живым организмам все вещества Шеховцова (2000) предлагает условно разделить на жизненно необходимые, токсичные и физиологически неактивные. Сравнительно быстрая ответная реакция организма может ожидаться только в двух первых случаях. Физиологически неактивные вещества могут дать отдаленный эффект или могут быть переведены в активное состояние за счет синергизма, реакции с другими веществами и т.д., что может привести к возникновению трудно предсказуемых биологических последствий (Захариев, 1977; Соколов, 1980). Как известно, именно синергическое действие факторов представляет наибольшую опасность для организмов. Согласно обобщенной концепции синергизма, при комбинированных воздействиях факторов происходит образование дополнительных повреждений за счет взаимодействия субповреждений, индуцируемых каждым из агентов и не являющихся значимыми при раздельном действии каждого из факторов (Булгаков, 2002).
Методика экспериментальной работы на растениях
Воздушно-сухие семена кукурузы, предварительно промытые с мылом, помещали в чистую отстоянную воду на сутки для набухания. Затем переносили в чашки Петри с растворами исследуемых веществ в объеме 7 мл на каждую чашку. В чашку помещали по 25 семян. На каждую концентрацию веществ обрабатывали по 100 семян. Контролем служила отстоянная водопроводная вода. Семена проращивали в термостате при температуре 22 С. Время экспозиции составляло 5 суток. По прошествие срока экспозиции измеряли длину главного корешка у каждого проростка и учитывали долю проросших семян. Корешки фиксировали в фиксаторе Карнуа в модификации Лилли (96% этиловый спирт и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) в течение 1-1,5 часов (Островская, 1984). Затем заменяли фиксатор на 70% этиловый спирт, в котором хранили зафиксированные корешки до приготовления препаратов. Методика приготовления давленых препаратов из корешков кукурузы
Для цитогенетичсского анализа использовали временные давленые препараты корешков кукурузы. Корешки окрашивали по Фельгену в течение 1,5-2х часов реактивом Шиффа с тиосульфатом Na (Dutt, 1979). Предварительно проводили гидролиз в 5N HCI при комнатной температуре 30 мин. Окрашенный корешок помещали на предметное стекло в каплю 45% уксусной кислоты, отрезали кончик корешка 1,5-2 мм (корневая меристема) и оставляли для мацерации на 5-15 минут. По окончании мацерации уксусную кислоту заменяли на насыщенный раствор хлоралгидрата, в капле которого проводили раздавливание корешка через покровное стекло. Препараты хранили в морозильной камере холодильника в чашках Петри в парах хлоралгидрата.
Постановка полевых экспериментов на пшенице Агрохимические испытания образцов ГЛ проводили на светло-серых лесных почвах учебно-производственного участка ИГСХА (пос. Молодежный). Количество вносимых в почву зерен пшеницы на один ряд (0,25 м2) составляло в среднем 90 штук. Внесение образцов ГЛ в обедненную гумусом почву осуществляли дважды: 29 июня и 17 июля по 125 г/м . Образцы вносили через ряд под корни растений. При первом внесении образцов длина растений достигала в среднем 22 см. При повторном внесении веществ также производили замеры растений. Оценку проводили по длине стебля, длине колоса и урожайности (масса зерна, масса соломы).
Оценка качества семян пшеницы Эксперименты качества семян проводили по описанной в литературе методике (Реймерс и Илли, 1974,1978). Отсчитывали по 100 семян каждой пробы и промывали в мыльной воде. В качестве ложа для проращивания семян использовали увлажненную фильтровальную бумагу, которую в виде кружочков помещали в чашки Петри. Бумагу увлажняли до полной влагоемкости, для чего ее опускали в чашку с водой, а затем давали стечь избытку воды. Семена укладывались на фильтровальную бумагу по 25 семян на чашку. Чашки Петри помещали в термостат. Для поддержания в термостате влажной атмосферы (на уровне 90-95% относительной влажности) на дно термостата ставили лоток с водой. Семена проращивали при температуре 20 С0, периодически увлажняя фильтровальную бумагу. Качество семян оценивали по доле проросших семян, выраженной в процентах, и интенсивности роста корешков и стебельков. Долю проросших семян у пшеницы учитывали но истечении 3-х суток, а длину корешков и стебельков но истечении 3-х н 7-ми суток проращивания.
Постановка полевых экспериментов на горохе Перед посевом в почву, семена гороха подвергались предпосевной обработке, которая производилась путем суточного замачивания их в чашках Петри с растворами ГЛ в концентрации 16,1 мкг/мл при t = 22 С. Агрохимические испытания образцов ГЛ проводили на светло-серых лесных почвах учебно-производственного участка ИГСХА (пос. Молодежный). Предшественником посадок был чистый пар. Количество вносимых в почву семян гороха на один ряд (0,2 м2) составляло 25 штук. Полевой эксперимент на горохе был поставлен в двух повторностях. В процессе роста растений учитывали долю проростков и мощность развития растений (число многостебельиых растений). После сбора урожая подсчитывали среднее число семян на один плод, а также определяли средний вес одного семени.
Изучение хромосомных аберраций на стадии анафазы митоза (анафазный метод) производится тогда, когда по ряду причин невозможен метафазный учет или в тех случаях, когда требуется только количественная оценка структурных мутаций без качественной детализации, то есть без учета типов хромосомных нарушений и идентификации аберрантных хромосом. При учете аберрации на стадии анафазы можно различить типы хромосомных нарушений как ацентрические фрагменты и мосты преимущественно транслокациониого происхождения. Несомненным преимуществом анафазного метода является его относительная простота, которая заключается, во-первых, в меньшей трудоемкости приготовления препаратов и, во вторых, в меньшей трудоемкости микроскопического анализа, что и является причиной его широкого использования при изучении мутагенной активности тех или иных факторов (Кулешов, Шрам; 1982). Микроскопический анализ препаратов проводили при использовании микроскопа Jenamed (х 100). Анализировали клетки в поздней анафазе -ранней телофазе. По результатам анализа подсчитывали процент аберрантных клеток и число повреждений хромосом на клетку.
Сравнительная оценка влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации электрогидравлическим ударом на кукурузу
Таким образом, полученные в настоящих экспериментах результаты показали, что при наличии некоторой токсичности гидролизного лигнина по отношению к моллюскам, явной фитотоксичностыо он не обладал. Однако, как на моллюсках, так и на кукурузе нами выявлена цитогенетическая активность ГЛ. Обработка гидролизного лигнина электрическим газовым разрядом при напряжении 20 - 48 кВ, в результате которой его молекулярная масса с 11600 предельно понижалась до 3400, снижала цитогенетическую активность ГЛ до контрольного уровня, что подтверждает предположение о связи мутагенной активности лигнина с его молекулярной массой (Новикова и др. 1996). Кроме того, продукты, полученные в результате обработки ГЛ электрическим газовым разрядом могут обладать рост-стимулирующей активностью. Наряду с этим, снижение цитогенетической активности и появление положительных биологических эффектов может быть связано с увеличением карбоксильных и фенольных гидроксильных групп. 4.2 Сравнительная оценка влияния гидролизного лигнина и продуктов его модификации электрогндравлическим ударом на кукурузу Другим возможным способом модификации ГЛ посредством электрического воздействия, который, как указывалось выше (глава I, раздел 1.5), используют в настоящее время в промышленном масштабе является электрогидравлический удар. Установлено, что продукты, полученные в результате воздействия электрогидравлического удара на водные суспензии ГЛ, могут являться ценным химическим сырьем, которое может использоваться, например, для производства активированных углей, в качестве наполнителя полимерных композитов (Иванова и др., 1996). Биологическая активность продуктов модификации ГЛ электрогидравлическим ударом практически не изучена. Сравнительную оценку биологических эффектов ГЛ и продуктов его модификации электорогидравлическим ударом (ЭГУ) в водной (ГЛ ЭГУв) и щелочной (ГЛ ЭГУщ) средах при параллельном цитогенетнческом контроле проводили на кукурузе при постановке экспериментов в трёх разновременных повторностях. Отметим, что воздействие электрогидравлического удара не только в водной, но и в щелочной среде использовали для понижения кислотности ГЛ (рН 2-4), который, как было сказано ранее (Глава 1, раздел 1.5), в кислом виде может негативно влиять на урожайность культур. Некоторые физико-химические характеристики данных образцов ГЛ приведены в таблице 9, из которой видно что электрогидравлический удар в разных средах понижает молекулярную массу ГЛ, что скорей всего связано с изменением его молекулярно-массового состава, а именно, отмечается увеличение содержания олигомеров с Mw 1000-5000 при снижении присутствия высокомолекулярных компонентов с Mw 10000. Образцы, полученные в результате воздействия на ГЛ электрогидравлического удара как в водной, так и в щелочной среде, отличались меньшей степенью полидисперсности по сравнению с исходным ГЛ. Кроме того, электрогидравлический удар в водной среде приводит к увеличению содержания в ГЛ карбоксильных, фенольных гидрокснльных и карбонильных групп.
Необходимо отметить, что как в связи с высокой полидисперсностыо исходного ГЛ, так и в зависимости от времени отбора пробы на предприятии, его молекулярная масса варьировала в пределах 9680-11600 а.е.м. Поэтому данный образец исходного ГЛ имел молекулярную массу отличную от таковой у ГЛ, описанного в предыдущем разделе.
Все исследованные в данных экспериментах образцы ГЛ были токсичны для кукурузы при концентрации 161 мкг/мл, что как отмечалось в разделе 3.2, связано в значительной мере с токсичностью растворителя (таблица 15). В отношении прорастания семян ингибирующий эффект ДМСО отмечался также при его разбавлении водой, соответствующем концентрации 32,3 мкг/мл, который частично снимался в результате воздействия на семена исходного ГЛ, хотя и не до контрольного уровня. В данных экспериментах, как и в описанных выше (таблица 7), ГЛ собственного фитотоксического действия не оказывал, что, как видно из таблицы 10, проявляется по обоим использованным критериям. Электрогидравлический удар в водной среде улучшал качества ГЛ в отношении прорастания семян (при концентрации 16,1), а также в отношении стимуляции роста (при концентрациях 4,0 и 16,1 мктДш), тогда как это же воздействие в щелочной среде ухудшало качества ГЛ и приводило к появлению заметной фитотоксичности ГЛ.
