Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам. антибактериальные пептиды и перспектива их использования для борьбы с антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов 9
1.1. Проблема формирования антибиотикоустойчивости у микроорганизмов 9
1.1.1. Антибиотикорезистентность и механизмы ее появления у микроорганизмов 10
1.1.2. Механизмы устойчивости бактерий к антибактериальным средствам 11
1.1.3. Пути преодоления устойчивости бактериальных клеток к антибиотикам 13
1.2. Антибактериальные пептидные соединения как природные факторы
ингибирования роста микроорганизмов 16
1.2.1. Пептиды млекопитающих 18
1.2.2. Пептиды земноводных 19
1.2.3. Пептиды насекомых 20
1.2.4. Пептиды растений 21
1.2.5. Пептиды бактерий 21
1.2.6. Механизмы антибактериального действия поликатионных пептидов .24
1.2.7. Практическое использование поликатионных пептидов 31
Экспериментальные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Бактериальные штаммы 36
2.2. Среды и условия культивирования 37
2.3. Определение антибиотикочувствительности исследуемых штаммов 37
2.4. Получение антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidis 40
2.5. Определение интенсивности роста и количества жизнеспособных клеток 41
2.6. Получение препарата низкомолекулярного катионного пептидного антибактериального фактора 41
2.7. Количественное определение антибактериального пептида в использованных препаратах 42
2.8. Определение антибактериальной активности варнерина 42
2.9. Выделение плазмидной ДНК 43
2.10. Анализ плазмидного спектра 43
2.11. Анализ липидного состава цитоплазматических мембран клеток 44
2.12. Статистическая обработка данных 45
Глава 3. Изучение антибактериального действия низкомолекулярного поликатионного пептида варнерина на антибиотикорезистентные штаммы staphylococcus epider-midis 46
3.1. Получение антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidis 46
3.2. Бактерицидное действие антибактериального пептида варнерина на различные штаммы S. epidermidis 55
3.3. Влияние варнерина на антибиотикочувствительность клеток различных штаммов S. epidermidis 65
3.4. Влияние различных по механизму действия антибиотиков на чувствительность клеток S. epidermidis к варнерину 75
3.5. Роль трансмембранного потенциала клеток S. epidermidis в реализации бактерицидного эффекта варнерина 81
3.6. Действие варнерина на клетки S. epidermidis в комбинации с лизоцимом 95
Заключение 102
Выводы 107
Список литературы 109
- Механизмы устойчивости бактерий к антибактериальным средствам
- Механизмы антибактериального действия поликатионных пептидов
- Получение антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidis
- Бактерицидное действие антибактериального пептида варнерина на различные штаммы S. epidermidis
Механизмы устойчивости бактерий к антибактериальным средствам
Сохранение высокого уровня инфекционной заболеваемости и ее рост во многом обусловлены широким распространением антибиотикорезистентных форм микроорганизмов. Любопытно отметить, что оксфордские классики Г. Абрахам и Э. Чейн еще до получения очищенного пенициллина описали бактериальный фермент, его разрушающий - пенициллиназу (Навашин, 1997). Тем самым была показана возможность появления и распространения устойчивых к этому антибиотику форм возбудителей заболеваний. Как стало понятно уже через несколько лет после внедрения в клиническую практику пенициллина, формирование антибиотикорезистентных форм бактерий является постоянным спутником химиотерапии.
Опыт последних 50 - 60 лет показывает, что этиологическая структура инфекционных заболеваний человека подвержена определенным изменениям во времени. В 40 - 60-х годах XX века ведущими патогенами были грамположительные бактерии. Внедрение и успешное применение пенициллинов привело к тому, что в 70 - 80-е годы главным этиологическим фактором инфекционных заболеваний стали грамогрицательные бактерии. С конца 80-х годов прошлого века и до настоящего времени вновь наблюдается возрастание клинической значимости грамположительной микрофлоры. При этом возбудителями инфекций становятся микроорганизмы, устойчивые к наиболее часто используемым антибиотикам (Сидоренко, 2000).
Формирование антибиотикоустойчивых штаммов бактерий происходит за счет селекции в организме больного устойчивых клеток, появляющихся в микробной популяции на фоне применения антибактериальных препаратов. В представлении большинства клинических микробиологов быстрое распространение возникшей антибиотикорезистентности обусловливают прежде всего трансмиссивные плазмиды (Навашин, Сазыкин, 1998). Так, у 80% штаммов стафилококков, выделяемых от больных, имеет место плазмидный тип устойчивости, поэтому более вероятным способом формирования резистентности штаммов является передача и амплификация в реципиентных клетках плазмид, содержащих детерминанты антибиотикоустойчивости. Вместе с тем, относительно недавно были описаны несущие гены резистентности коньюгативные транспозоны (Salyers, Amabile-Cuevas, 1997). Кроме того, распространению антибиотикорезистентности способствует также передача генов устойчивости путем трансдукции, а также такое явление как ретранспорт (Навашин, Сазыкин, 1998).
Классическим примером является устойчивость к группе р-лактамных антибиотиков. Бактерии, резистентные к антибиотикам этого класса продуцируют фермент р-лактамазу, который гидролизует (З-лактамное кольцо антибиотика, тем самым инактивируя его (Coleman et ah, 1994; Вильяме, 1997).
Деактивация антибиотиков другого класса - аминогликозидов осуществляется при помощи трех групп ферментов: аденилилтрансфераз, ацетилтрансфераз и фосфорилтрансфераз, осуществляющих ковалентную модификацию субстратов за счет соответственно аденилирования, ацетилирования и фосфорилирования молекулы антибиотика (Shaw et ai, 1993).
Так, например, ферментативное ацетилирование является наиболее частым механизмом устойчивости и к хлорамфениколу (Kloos et al, 1992). 2. Модификация мишени, на которую действует антибиотик. Устойчивость к Р-лактамам может быть также обусловлена появлением пенициллинсвязывающих белков со сниженным сродством к этим антибиотикам (Вильяме, 1997).
Метилирование 23 S рРНК служит причиной снижения связывания с рибосомами макролидов и линкомицинов (Kloos et al, 1992).
Резистентность к фторхинолонам может быть обусловлена снижением сродства этих антибиотиков к мишени - ДНК-гиразе, обусловленного мутационным изменением ее аминокислотного состава (Nikaido, 1998).
Так, повышение содержания фосфатидилэтаноламина в составе липидов цитоплазматической мембраны снижает ее проницаемость для фузидиевой кислоты, а увеличение содержания тейхуроновой кислоты в клеточной стенке уменьшает количество поступающего в клетку новобиоцина (Бриан, 1984).
В последнее время показано, что значительное повышение в цитоплазматической мембране количества специфических белков-транспортеров, условно именуемых "помпами" является наиболее распространенным механизмом устойчивости бактерий к чужеродным для них агентам (Paulsen et al., 1996).
Поскольку выброс антибиотиков против градиента концентрации является энергозависимым процессом, работа помп обеспечивается или протон-движущей силой или гидролизом макроэргических соединений, прежде всего АТФ (Сазыкин и др., 1999). У грамотрицательных бактерий системы активного выброса организованы более сложно, чем у грамположительных. Помимо основного белка-транспортера, расположенного в цитоплазматической мембране, они включают, по крайней мере два белка, функционирующих в периплазме и наружной мембране (Nikaido, 1998; Aeschlimann et al., 1999).
Применительно к проблеме химиотерапии обращает на себя внимание прежде всего исключительно широкая специфичность некоторых систем активного выброса, которые могут транспортировать из клетки вещества самых отдаленных структур, например, (3-лактамы, тетрациклины, макролиды, фторхинолоны, фузидиевую кислоту, красители и т.д. (Сазыкин и др., 1999; Markham, Neyfakh, 2001).
В клинической практике преодоление устойчивости бактерий к антибиотикам осуществляется путем применения антибиотиков в комбинации друг с другом и с другими биологически активными веществами. Помимо этого, ведется активная разработка и внедрение новых антибактериальных препаратов.
Для эффективного лечения инфекций, вызываемых метициллинрезистентными штаммами Staphylococcus epidermidis, применяются комбинации антибиотиков: Р-л актам + аминогликозид, ванкомицин + цефалоспорин, ванкомицин + рифампицин (Cossley et al., 1979; Ein et al, 1979). Антибактериальный эффект гентамицина в комбинации с метициллином в отношении метициллинустойчивых штаммов золотистого стафилококка в 5 -10 раз выше по сравнению с действием одного гентамицина (Стафилококк, 1988).
Относительно новым комбинированным препаратом является синерцид (пристинамицин), который состоит из двух стрептограминовых антибиотиков: хинупристина и дальфопристина. Оба компонента синерцида ингибируют биосинтез белка, проявляя при этом выраженный синергидный эффект (Сидоренко, 2000). Взаимодействие дальфопристина с пептидилтрансферазным доменом 23S РНК приводит к таким конформационным изменениям 50S-субчастицы рибосомы, которые облегчают связывание с ней хинупристина (Cocito et al, 1997).
Механизмы антибактериального действия поликатионных пептидов
Показано, что катионные пептиды являются существенным компонентом антибактериальной защиты всех живых организмов, а их продукция представляет собой важнейший биологический феномен (Hancock, Lehrer, 1998). К настоящему времени описано более 500 пептидных антибактериальных факторов (Hancock, Scott, 2000).
В зависимости от путей биосинтеза антибактериальные пептиды могут быть разделены на два класса: пептиды, синтез которых осуществляется вне рибосом последовательным функционированием мультиферментных комплексов (грамицидины, полимиксины, бацитрацины и гликопептиды) (Kleinkauf, Dohren, 1988) и пептиды, синтезируемые на рибосомах (Boman, 1995). Если синтез пептидов первой группы характерен преимущественно для микроорганизмов, то продукцию вторых можно наблюдать на всех уровнях жизни - от бактерий до растений и животных, где они выполняют функции основных компонентов врожденной защиты от микроорганизмов (Hancock, Chappie, 1999).
Большинство известных антибактериальных пептидов по меньшей мере на 50 % состоит из остатков гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин, про лин, валин). В составе таких пептидов остатки нейтральных и отрицательно заряженных аминокислот содержатся в небольших количествах, в то время как положительно заряженных - аргинина, гистидина и лизина, обнаруживаются в избытке, обусловливая суммарный положительный заряд молекул (Hancock, 1997).
При всем структурном разнообразии большинство описанных в настоящее время антибиотических пептидов являются, как правило, одновременно основными (катионными, щелочными) и амфипатическими (характеризующимися пространственным разобщением гидрофильных и гидрофобных боковых групп аминокислотных остатков) молекулами, проявляющими сродство как к липофобным, так и липофильным средам и соединениям. Положительный заряд и амфифильность молекул антибиотических пептидов лежат в основе их антимикробного действия (Кокряков и др., 1997; Boman, 1995; Maloj, Kari, 1995).
Организация вторичной структуры молекул катионных пептидов характеризуется наличием Р-складчатых структур, стабилизированных дисульфидными и тиоэфирными связями, а-спиралей, вытянутых вследствие избыточного содержания пролина участков, а также петель (Hancock et al., 1995).
Третичная структура антибиотических пептидов определяет их амфипатическую природу и может быть представлена в виде молекул с противопоставленными полярным и гидрофобным концами, а также в виде катионных "двукрылых" структур с двумя положительно заряженными участками, окружающими гидрофобную сердцевину - кор (Hancock, Lehrer, 1998).
Подобная амфипатическая структура пептидов делает их активными мембранотропными соединениями, способными не только к взаимодействию с фосфолипидами за счет электростатических свойств молекулы, но и внедрению в липидный бислой благодаря гидрофобным взаимодействиям (Selsted et al, 1993). 1.2.1. Пептиды млекопитающих
У млекопитающих антибактериальные пептиды обнаружены в гранулах нейтрофилов, тромбоцитах, в слизистых или кожных секретах эпителиальных клеток, а также среди продуктов деградации белков (Boman, 1995).
Нейтрофилы, выполняющие функцию обезвреживания чужеродных агентов, содержат ряд антибактериальных пептидов и белков, включая а, (3-дефенсины, протегрины, бактерицидный проницаемость увеличивающий белок, лизоцим, лактоферрин, бактенецины, и кателецидины (Hancock et ah, 1995; Ganz, Lehrer, 1997). Другие типы клеток также продуцируют антибактериальные факторы. Так, эпителиальные клетки образуют а- и Р-дефенсины, а тромбоциты - тромбоцитарные антибактериальные протеины (Бухарин и др., 2000;Hancock, Chappie, 1999).
Наиболее изученными пептидами млекопитающих являются дефенсины, среди которых выделяют а- и (3-дефенсины (Ganz, Lehrer, 1997). Дефенсины характеризуются относительно высоким содержанием в их составе (до 30 мол %) аминокислот с гидрофобными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, валин), что, по-видимому, имеет немаловажное значение в реализации их функциональных свойств (Selsted etah, 1985).
Другая особенность первичной структуры дефенсинов заключается в наличии 6 остатков аминокислоты цистеина, участвующих в образовании 3 внутримолекулярных дисульфидных мостиков, придающих молекуле пептида глобулоподобную форму и стабилизирующих вторичную структуру пептида, которая представлена 3 антипараллельными (3-тяжами, образующими (3-складчатый слой (Bach et ah, 1987; Pardi et ah, 1988; Hill et ah, 1991).
Кроме того, выявлено пространственное разделение в молекуле дефенсинов остатков аминокислот, несущих боковые положительно заряженные и гидрофобные группы, что дает основание характеризовать молекулу как амфипатическую (Selsted et ah, 1993). Разделение дефенсинов на а- и (3-группы основано на неодинаковом расположении цистеиновых остатков и их сочетании при образовании дисуль-фидных связей (Tang, Selsted, 1993). Помимо этого, из нейтрофилов и моноцитов приматов были выделен пептид, названный 0-дефенсином. Это соединение обладает циклической структурой, которая образована двумя остатками молекул а-дефенсинов (Tang et al., 1999).
У млекопитающих а-дефенсины представлены преимущественно в нейтрофилах и клетках Пэнета (Rice et al, 1987; Eisenhauer et al, 1992), a (3-дефенсины выделены из эпителиальных и лейкоцитарных клеток (Hancock, Chappie, 1999).
Определенным сходством с 3-дефенсинами обладают протегрины -антимикробные пептиды, выделенные из лейкоцитов свиньи. Они богаты аминокислотами аргинином (27-33 мол%) и цистеином (21-25 мол%). Однако их молекулярные массы ( 2 Ша) примерно в 1,5-2 раза меньше таковых дефенсинов (Kokryakov et al, 1993; Qu et al, 1997; Steinberg et al, 1997).
Получение антибиотикорезистентных штаммов S. epidermidis
Увеличение содержания плазмиды несколько большего - размера 3,7 т.п.н. обнаружено и в клетках кадмийустойчивого штамма другого вида стафилококков - S. aureus, при этом показано, что она определяет синтез АТФ-зависимой транспортной системы, ответственной за быстрый выброс ионов кадмия из клеток в окружающую среду (Lebran et ah, 1994).
Энергозависимые системы экспорта токсических агентов, в том числе и ионов тяжелых металлов, как правило, не являются высокоспецифическими и могут обеспечивать устойчивость к структурно различным антимикробным агентам, в том числе и поликатионным пептидам (Shafer et al, 1998).
Интересно, что подобным образом может быть обеспечена защита клеток от секретируемых в среду антибактериальных факторов, потенциально опасных для бактерии-продуцента. Показано, что именно такой механизм лежит в основе иммунитета клеток S. epidermidis к продуцируемому ими антибактериальному пептиду эпидермину. Защита секретирующих клеток от этого низкомолекулярного пептида обеспечивается плазмидными генами, ответственными за синтез структурных компонентов АВС-транспортных систем, осуществляющих эффективный выброс из бактерий различных опасных для клетки соединений (Peschel, Gotz, 1996). ABC-транспортеры обеспечивают также самозащиту клеток, продуцирующих низин, лактицин и мерсацидин (McAuliffe et al, 2001). Помимо этого, обнаруженная в клетках Neisseria gonorrhoeae система энергозависимого выброса Mtr обусловливает устойчивость бактерий этого вида к широкому спектру гидрофобных антибактериальных соединений, в том числе и к поликатионному лейкоцитарному пептиду протегрину-1 (Shafer et al., 1998).
В то же время, A.S. Bayer с соавт. (2000) установили, что устойчивость к поликатионным пептидам может быть обусловлена изменениями в составе липидов цитоплазматической мембраны. Авторами было показано, что штаммы Staphylococcus aureus, обладающие повышенной устойчивостью к действию катионного пептида tPMP-І, отличаются более высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот в мембранах клеток по сравнению с чувствительными штаммами.
Изучение состава мембранных липидов штаммов S. epidermidis 33 и S. epidermidis 33-Cdr показало, что появление резистентности к ионам кадмия приводит практически к двукратному увеличению содержания фосфора липидных компонентов мембран бактериальных клеток. Это прежде всего обусловлено возрастанием количества кардиолипина - с 6,0 до 17,4%, а также увеличением содержания лизилфосфатидилглицерола с 6,3 до 33,6% (рис 3).
В связи с этим, повышение устойчивости к варнерину полирезистентного штамма S. epidermidis 33-Cdr может быть обусловлено также повышением содержания кардиолипина и лизилфосфатидилглицерола в составе мембран клеток. Таким образом, наблюдаемая в наших экспериментах взаимосвязь между повышением устойчивости клеток к ионам кадмия, левомицетину, линкомицину, эритромицину и снижением чувствительности к антибактериальному пептиду может быть обусловлена общностью защитных механизмов бактерий в ответ на действие факторов различной природы.
Изучение кинетики антибактериальной активности пептида показало, что при концентрации варнерина в среде инкубирования равной МБК, бактерицидный эффект пептида проявляется быстро, в течение нескольких минут.
При действии пептида на клетки штамма S. epidermidis 33 уже через 10 минут после внесения варнерина в среду культивирования происходило достоверное снижение количества клеток приблизительно в 2 раза. А через 4 часа действия пептида жизнеспособных бактерий обнаружено не было (рис. 4).
Более быстрый бактерицидный эффект варнерина наблюдался в отношении клеток штамма S. epidermidis 33-Rifг. Несмотря на то, что через 10 мин инкубации в присутствии пептида количество клеток сокращалось лишь незначительно ( в 1,6 раза), через 3 часа культивирования с варнерином наступала полная гибель бактерий (рис. 6). 4 Время, мин
В случае штамма, устойчивого к эритромицину следует отметить наличие латентного периода, который продолжался в течение первого часа, когда антибактериальный эффект варнерина практически не проявлялся. В первые 30 мин инкубации в присутствии пептида не происходило статистически достоверного уменьшения количества жизнеспособных клеток. Существенное снижение числа КОЕ наблюдалось только через 60 мин действия антибактериального пептида, а для полного киллинга бактерий требовалось около 4-х часов инкубации с варнерином (рис. 7). 100000000 і
После добавления варнерина к суспензии клеток полирезистентного штамма S. epidermidis 33-Cdr, устойчивого к кадмию, а также левомицетину, линкомицину и эритромицину, в течение первых 10 мин количество клеток уменьшилось в 1,6 раза, затем наблюдалось прогрессирующее падение численности бактерий, а через 4 часа инкубации в присутствии варнерина живых клеток не обнаруживалось (рис. 8). 4 Время, мин
Быстрая, в течение первых минут контакта с пептидом гибель значительного числа бактериальных клеток характерна для действия и других антибактериальных пептидов (Hancock, Chappie, 1999). Это связано с тем, что первичной мишенью действия большинства пептидов являются клеточные мембраны, нарушение барьерной функции которых ведет к быстрой утечке из клетки ионов, небольших молекул, таких как аминокислоты и нуклеотиды, сопровождающейся деполяризацией мембраны. Все это приводит к мгновенной остановке всех биосинтетических процессов (Sahl, Brandis, 1983; Ruhr, Sahl,1985).
В наших экспериментах также было показано, что действие варнерина на клетки чувствительных к нему бактерий S. epidermidis может сказываться очень быстро, в течение первых 10 минут контакта, что может свидетельствовать о том, что первичной мишенью действия пептида служит цитоплазматическая мембрана. Кроме того, представляется важным тот факт, что варнерин проявляет активность не только в отношении штаммов S. epidermidis 33, устойчивых лишь к одному антибиотику, но и в отношении множественно-устойчивого штамма. 3.3. Влияние варнерина на антибиотикочувствительность клеток различных штаммов S. epidermidis
В первой серии опытов исследование влияния варнерина на антибиотикочувствительность клеток S. epidermidis проводили путем внесения препарата пептида в среду культивирования бактерий на ранней логарифмической фазе роста. Препараты антибактериального пептида представляли собой лиофилизированные ультрафильтраты среды роста S. warneri IEGM KL-1, полученные путем последовательной истощающей фильтрации супернатантов культур продуцента в системах Centricon.
В качестве тест-культуры использовали исходный штамм S. epidermidis 33, а также штамм, резистентный к высоким концентрациям ионов кадмия в среде - S. epidermidis 33-Cdr.
Для каждого штамма были установлены МПК антибактериального пептида, которые составили 4 - 4,5 мкг белка лиофилизированного препарата/мл среды роста для S. epidermidis 33 и 12 - 13 мкг для S. epidermidis 33-Cdr.
Антибиотикочувствительность бактерий определяли стандартным методом индикаторных дисков через 1 час после добавления пептида в среду роста. Препарат варнерина вносили в среду инкубирования до конечной концентрации 8-10 мкг белка/мл среды для штамма S. epidermidis 33и25-30 мкг белка/мл для штамма S. epidermidis 33-Cdr. В предварительных опытах было установлено, что эти концентрации препарата пептида в среде культивирования обладают бактериостатическим действием на культуры клеток указанных штаммов, находящиеся в начале логарифмической фазы роста (OD = 0,1).
Присутствие пептида в среде роста вызывало значительные изменения антибиотикочувствительности клеток. Уже через 60 минут взаимодействия антибактериального пептида с клетками исходного штамма S. epidermidis 33 происходило повышение их чувствительности антибиотикам (рис. 9). Особенно резко повышалась чувствительность к таким антибиотикам как ампициллин, левомицетин, линкомицин, рифампицин, тетрациклин, цефалексин, эритромицин и фузидин. Под действием варнерина клетки стафилококков приобретали высокую чувствительность к таким антибиотикам как линкомицин, эритромицин, стрептомицин, в то время как клетки исходной культуры были среднечувствительными к данным антибиотикам.
Бактерицидное действие антибактериального пептида варнерина на различные штаммы S. epidermidis
В последние годы исследования поликатионных пептидов приобретают все больший размах. Это связано с тем, что на фоне постоянно возрастающего количества антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, антибактериальные пептиды могут стать альтернативой традиционным антибиотикам.
Помимо того, что поликатионные пептиды сами по себе способны выступать в роли антибактериальных агентов, перспективным является изучение их как факторов, повышающих чувствительность бактериальных клеток к другим антибиотикам (Scott, 1999).
В настоящее время описано уже более 500 пептидных поликатионных факторов (Hancock, Scott, 2000), однако пока еще очень мало известно о механизме их действия, а также их способности усиливать действие других антибактериальных агентов.
Изучение поликатионного пептида варнерина, впервые выделенного в 1996 году в Лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, показало, что он обладает выраженным антибиотическим эффектом в отношении штаммов Staphylococcus epidermidis, характеризующихся различной чувствительностью к антибиотикам.
Установлено, что бактерицидное действие пептида начинается быстро, в течение нескольких минут, что может свидетельствовать о том, что первичной мишенью варнерина, как и большинства поликатионных пептидов, служит цитоплазматическая мембрана.
Следует отметить, что скорость антибактериального действия варнерина в отношении всех использованных штаммов S. epidermidis приблизительно одинакова, несмотря на то, что значения МПК и МБК пептида для всех штаммов разные.
Наибольшей устойчивостью к бактерицидному действию варнерина обладает штамм S. epidermidis 33-Cdr, устойчивый к кадмию, а также левомицетину, линкомицину и эритромицину. Согласно данным литературы гены, обусловливающие резистентность к ионам кадмия, как правило, имеют плазмидную локализацию и детерминируют в большинстве случаев синтез АТФ-зависимых систем, ответственных за быстрый выброс ионов кадмия из клеток в окружающую среду (Lebrun et ah, 1994). Помимо этого, повышенная устойчивость стафилококков к солям кадмия, как правило, сопровождается множественной устойчивостью к антибиотикам, благодаря общей детерминированности плазмидными генами (Самсонова и др., 1982).
Изучение плазмидого спектра исходного штамма и штамма, устойчивого к кадмию, показало, что формирование резистентности бактерий к высоким концентрациям ионов кадмия сопровождается увеличением копийности плазмиды размером 2,7 т.п.н. В связи с тем, что системы активного выброса ионов тяжелых металлов не являются высокоспецифичными, мы сделали предположение о том, что взаимосвязь между повышением устойчивости клетки к ионам кадмия и снижением чувствительности к варнерину может быть обусловлена общим защитным механизмом, который детерминирован плазмидными генами.
В то же время, изучение состава мембранных липидов штаммов S. epidermidis 33 и S. epidermidis 33-Cdr, показало, что появление резистентности к ионам кадмия приводит к изменению липидного состава цитоплазматических мембран бактериальных клеток. В клетках штамма S. epidermidis 33-Cdr возрастает количество кардиолипина - с 6 до 17,4%, а также более, чем в 5 раз увеличивается содержание лизил-фосфатидилглицерола, который в исходном штамме обнаруживается в небольших количествах. В связи с этим, повышение устойчивости к варнерину у клеток полирезистентного штамма S. epidermidis 33-Cdr может быть обусловлено также изменением липидного состава мембран клеток.
Помимо того, что варнерин сам по себе обладает бактерицидным эффектом, он также способен потенцировать действие других антибиотиков на клетки S. epidermidis. В результате проведенных экспериментов было установлено, что в наибольшей степени пептид усиливает антибактериальный эффект р-лактамных антибиотиков: ампициллина, оксациллина, цефалексина, что было показано для всех использованных в работе штаммов S. epidermidis.
В то же время, изменение чувствительности клеток стафилококков к ингибиторам синтеза белка, таким как левомицетин, линкомицин, тетрациклин и эритромицин под действием варнерина наблюдается не у всех штаммов. Пептид потенцирует действие этих антибиотиков на клетки штаммов S. epidermidis 33, S. epidermidis 33-Ampr и S. epidermidis 33-Cdr. Чувствительность к данным антибиотикам клеток остальных штаммов не изменялась.
Для более детального изучения механизма действия варнерина были поставлены эксперименты, в которых клетки всех модельных штаммов S. epidermidis сначала обрабатывали суббактерицидными концентрациями различных антибиотиков, после чего вносили варнерин. Было показано, что все Р-лактамные антибиотики, в свою очередь, значительно повышают чувствительность клеток всех использованных в работе штаммов S. epidermidis к варнерину.
В то же время, такие антибиотики как левомицетин, линкомицин, тетрациклин и эритромицин потенцируют антибактериальный эффект варнерина только в отношении клеток штамма, устойчивого к ампициллину. Достоверного изменения чувствительности к пептиду после обработки этими антибиотиками у клеток штаммов S. epidermidis 33, S. epidermidis 33-Rif \ S. epidermidis 33-Err, S. epidermidis 33 -СсГ не наблюдается.
Согласно литературным данным, встраивание внутрь цитоплазмати-ческой мембраны лантибиотиков А-типа, к которым, по-видимому, может быть отнесен варнерин, и их последующая мультимеризация с образованием пор требует энергии трансмембранного потенциала (Benz et al, 1991; Bruno, Montville, 1993). Известно, что клетки либо стационарной фазы роста, либо находящиеся под воздействием пониженных температур имеют более низкое значение трансмембранного потенциала, что обусловлено снижением интенсивности энергогенерирующих процессов в указанных условиях (Shimoda e/al., 1995).
Действительно, проведенные нами исследования показали, что антибактериальный эффект варнерина существенно снижается при низкой температуре (4С), а клетки стационарной фазы роста характеризуются большей устойчивостью к действию пептида по сравнению с клетками логарифмической фазы роста.
В специальных экспериментах было установлено, что предварительная экспозиция клеток S. epidermidis с ионофорами (пентахлорфенолом, карбонилцианид-л/-хлорфенилгидразоном и валиномицином) приводит к значительному снижению чувствительности бактерий к пептиду. Показано, что валиномицин - соединение, вызывающее диссипацию Д\/-компоненты трансмембранного электрохимического потенциала оказывает значительно более сильно выраженное действие на чувствительность клеток стафилококков к варнерину по сравнению с нигерицином - соединением, снижающим значение ДрН-составляющей потенциала. Кроме того, действие пентахлорфенола, карбонилцианид-л/-хлорфенилгидразона и валиномицина на клетки S. epidermidis было пролонгированным: количество клеток уменьшалось лишь в течение первого часа после внесения варнерина, в последующие 4 часа снижения количества клеток не происходило вне зависимости от количества внесенного пептида.
В то же время, эффект нигерицина был непродолжительным: снижение чувствительности клеток S. epidermidis к варнерину наблюдалось лишь в течение 1 часа после обработки нигерицином. Спустя 2 часа инкубирования в присутствии пептида, действие варнерина становилось концентрационно-зависимым.
Таким образом, согласно нашим экспериментам, составляющие трансмембранного потенциала - Д\/ и ДрН по-разному влияют на антибактериальную активность варнерина. В большей степени бактерицидный эффект варнерина, по-видимому, зависит от величины электрического потенциала (Дху). Известно, что некоторые поликатионные пептиды проявляют синергидные взаимодействия друг с другом, а также с другими факторами внутренней защиты организмов (McCafferty et al, 1999; Yan, Hancock, 2001). В частности, ряд пептидов способны потенцировать антибактериальный эффект лизоцима (Hancock et al, 2000; Patrzykat et al, 2001).
Проведенные нами эксперименты показали, что варнерин в сочетании с лизоцимом обнаруживают выраженный синергизм действия, дополняя антибактериальный эффект друг друга. Синергидный эффект варнерина и лизоцима наблюдался в отношении всех использованных штаммов S. epidermidis.
