Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 9
1.1. Фитогормоны и их действие на растительный организм 9
1.2. Фитогормональная регуляция биосиятетических процессов 23
1.3. Изменение физико-химических свойств ДНК растений при действии фитогормонов 35
ГЛАВА II. Материалы и методы исследований 42
2.1. Условия культивирования эксплантатов топинамбура в системе in vitro 42
2.2. Определение кинетики синтеза ДНК топинамбура 43
2.3. Определение кинетики синтеза РНК и белков топинамбура 43
2.4.Выделение ДНК 44
2.5. Плавление ДНК 45
2.6. Измерение содержания ДНК, РНК и белков 45
2.7. Определение коэффициента распределения суммарной ДНК в градиенте нейтрального Csci 46
2.8. Определение коэффициента распределения нов.осинтезированной меченой ДНК топинамбура в градиенте нейтрального csci 46
2.9. Мечение ДНК топинамбура in vivo 47
2.10.Определение температуры плавления новосинтезированной ДНК 48
2.11.Определение нуклеотидного состава ДНК топинамбура 48
2.12.Фракционирование и определение длины фрагментов ДНК топинамбура 49
2.13. Кинетика реассоциации ДВК топинамбура 49
2.14. Выделение митохондрий и ядер из тканей клубней топинамбура и определение коэффициента распределения ДЖ органелл в градиенте нейтрального Csci 51
2.15. Определение содержания эндогенного и экзогенного этилена 52
2.16. Цитологическое исследование эксплантатов топинамбура 52
2.17. Статистические методы обработки результатов 53
ГЛАВА III. Влияние кислот на синтез ДНК, РНК и белков 54
3.1. Влияние различных концентраций регуляторов роста растений на интенсивность синтеза ДНК топинамбура 55
3.2. Продолжительность лаг-периода, предшествующего началу синтеза ДНК в зависимости от возраста клубней топинамбура 62
3.3. Продолжительность лаг-периода и интенсивность синтеза ДНК под влиянием 2-хлорэтилфосфоновой кислоты 65
3.4. Действие индолилуксусной кислоты на продолжительность лаг-периода и интенсивность синтеза ДНК топинамбура 69
3.5. Влияние 2-хлорэтилфосфоновой и -индолилуксусной кислот на биосинтез РНК и белков топинамбура в период, предшествующий началу s фазы митотического цикла 74
ГЛАВА IV. Влияние кислот на физико-шлические свойства ДНК топинамбура 82
4.1. Характеристика ДНК топинамбура 82
4.2. Определение температуры плавления ДНК топинамбура, выделенной из тканей обработанных и необработанных регуляторами роста 85
4.3. Распределение ДНК в градиенте Csci в зависимости от обработки 2-хлорэтилфосфоновой и-индолилуксусной кислотами 90
4.4. Изучение структурной организации ДНК топинамбура с помощью кинетики реассоциации 91
ГЛАВА V. Влияние 2-хлорэтилфосфоновой и р-индолилуксусной кислот на физико-химические свойства новосинтезированнои ДНК топинамбура 98
5.1. Действие 2-хлорэтилфосфоновой и индолилуксусной кислот на термальную денатурацию новосинтезированнои ДНК топинамбура 99
5.2. Определение коэффициента распределения новосинтезированнои ДНК топинамбура в градиенте нейтрального csci при экзогенной обработке тканей 2-хлорэтилфосфоновой и /> -индолилуксусной кислотами 104
5.3. Определение плавучей плотности новосинтезированнои ДНК митохондрий и ядер топинамбура 103
Заключение 115
Выводы 119
Список основной использованной литературы 121
- Фитогормональная регуляция биосиятетических процессов
- Условия культивирования эксплантатов топинамбура в системе in vitro
- Влияние различных концентраций регуляторов роста растений на интенсивность синтеза ДНК топинамбура
- Определение температуры плавления ДНК топинамбура, выделенной из тканей обработанных и необработанных регуляторами роста
Введение к работе
Изучение действия фитогормонов на различные физиологические и биохимические процессы является важным направлением исследования систем регуляции жизнедеятельности растений. Работы, ведущиеся в области изучения биологически активных веществ, используемых в качестве регуляторов ростовых и других жизненных процессов растений, относятся к молодой, но интенсивно развивающейся области знаний, тесно связанной с запросами практики. За сравнительно короткий период времени в этой области получен целый ряд важнейших достижений: синтезировано большое количество разнообразных химических соединений, являющихся средствами воздействия на растительные объекты; получен обширный фактический материал, характеризующий физиологическое действие этих соединений в зависимости от дозы, особенности растительных объектов и условий окружающей среды. На основе этих материалов сделаны важные обобщения, касающиеся природы действия биологически активных веществ; найдены разнообразные формы и направления использования этих веществ в качестве эффективных средств воздействия на растения; налажен промышленный синтез биологически активных веществ и организовано применение их в народном хозяйстве.
В настоящее время наряду с природными (эндогенными) регуляторами роста растений в практике сельского хозяйства применяется ряд их синтетических аналогов. Положительные результаты дает применение химических соединений, высвобождающих биологически активное вещество при трансформации в растительных тканях. К ним прежде всего следует отнести препараты, созданные на основе 2-хлорэтилфосфоновой кислоты, действующим началом которых является выделяющийся при гидролизе этилен. Однако, несмотря на широкое применение как природных, так и искусственных регуляторов роста растений в практике растениеводства, до сих пор нет единой теории механизма действия тех или иных биологически активных веществ. Это связано прежде всего с разнообразием изучаемых растительных систем и неоднозначностью реакций растительных тканей, вызываемых одним и тем же регулятором в различных условиях роста. Большое значение имеет также доза применяемого биологичеоки активного вешества, так как в небольших количествах многие из них у сшивают (стимулируют) жизнедеятельность растений, в повышенных -ослабляют (затормаживают) ее, в больших - необратимо повреждают и убивают растения (гербицндное действие). При этом следует учитывать физиологическое состояние растительных тканей и то, что действие различных фитогормонов в растительном организме может быть взаимосвязанным. Имеется ряд исследований о взаимном влиянии абсцизовой кислоты и этилена на ростовые процессы в растениях, о взаимодействии ауксина и цитокинина во время индукции клеточных делений в растительных тканях. Имеются данные о связи синтеза этилена с накоплением ауксина в клетках растений, чем и объясняется, по-видимому, ингибиторное воздействие ауксина на ростовые процессы при повышении концентраций. Причем в различных растительных системах эти взаимосвязи неодинаковы и также зависят от концентраций, физиологического состо-яни тканей и ряда других факторов.
Существующие исследования механизма действия гормонов в основном затрагивают физиологические реакции растительного организма в ответ на воздействие ими. При изучении растяжения клеток в колеоптилях или зоне междоузлий механизм действия связывается с изменением рН среды. При этом происходит изменение скорости поступления различных веществ как внутрь, так и из клеток. Кроме того, существует мнение об изменении структуры клеточной стенки при воздействий ауксинов, что также может обусловливать ускорение растяжения клеток. Во время растяжения клеток под воздействием экзогенных регуляторов роста происходит накопление ДНК, РНК и белков, причем считается, что изменение соотношения определенных белков нарушает пропорцию индукторов и репрессоров основных биосинтетических процессов и при этом происходит изменение направленности роста. Б этом случае создаются благоприятные условия для деления клеток. Однако механизм клеточного ускорения деления природными и синтетическими регуляторами роста до сих пор не имеет объяснения. Не выясненной остается также природа ингибирования роста растений под действием регуляторов ретардантного характера - абсцизинов и этилена.
Наряду с изучением физиологических реакций растительного организма на эндогенные и экзогенные регуляторы роста, внимание исследователей привлечено к изучению биохимических и молекулярных аспектов действия этих веществ. Оказывая влияние на кинетику и интенсивность биосинтеза ДНК и РНК, фитогормоны могут регулировать синтез метаболических и структурных белков. Эти изменения могут быть вовлечены в регуляцию ростовых процессов растительных тканей. При этом может происходить изменение в активности ранее имеющихся ферментов, либо синтезироваться ряд новых активных, в данных условиях роста, белков. В настоящее время вопрос о первичности воздействия фитогормонрв в растительном организме остается нерешенным. Имеется ряд исследований влияния регуляторов роста на кинетику синтеза ДНК в ранние часы роста растительных тканей в период, предшествующий делению и растяжению клеток, а также дифференциации. Были исследованы также физико-химические характеристики ДНК растений, синтезированной при действии экзогенных регуляторов роста. Однако данные этих исследований неоднозначны и нуждаются в более глубоком изучении. Особый интерес представляют исследования механизма действия синтетических регуляторов роста, которые в настоящее время широко используются в растениеводстве. С этой точки зрения внимание исследователей привлечено к изучению основ действия высокоэффективного этиленпродуцируюшего вещества 2-хлор-этилфосфоновой кислоты (2-ХЭФК) и препаратов, созданных на ее основе. Это вещество оказывает влияние на различные физиологические процессы, важнейшими из которых являются подавление ростовых процессов и ускорение созревания плодов. Однако, несмотря на широкое использование 2-ХЭФК в сельском хозяйстве и исследование физиологического действия этого вещества, в литературе до сих пор нет данных о его действии на биохимические процессы растительного организма. Изучение механизма ДЄЙСТЕЙЯ ЭТОГО этиленпродуцируюшего вещества расширит представление исследователей о диапазоне его действия, концентрационных зависимостях и создаст предпосылки для поиска новых перспектив его применения в растениеводстве.
Целью настоящей работы послужило исследование биохимических основ действия 2-ХЭФК в ранние часы роста эксплантатов запасающих тканей клубней топинамбура в регулируемых условиях роста в культуре in vitro при сравнении с действием /-индолил-уксусной кислоты ($ -ИУК). Представляло интерес исследование влияния регуляторов роста растений на кинетику синтеза ДНК топинамбура и свойства новосинтезированной ДНК.
Фитогормональная регуляция биосиятетических процессов
В литературе имеется достаточно данных о физиологических реакциях растительного организма на обработку этиленом, но до сих пор остается не выясненным вопрос о механизме его ингибиторного действия на рост растений. Поэтому для выяснения этого вопроса особый интерес представляет исследование биохимического действия этилена. Решению этого вопроса придается особое значение еще и потому, что физиологические реакции растительного организма, вызываемые этиленом, приобрели большое значение для растениеводства. Благодаря легкому усвоению этилена растительным организмом, а также транспорту его в растительных тканях в настоящее время широко применяется обработка растений этим веществом. Применение этилена в растениеводстве облегчается благодаря созданию препаратов, при распаде которых происходит высвобождение этилена. В основу большинства из них входит 2-ХЭФК. 2-ХЭФК была впервые синтезирована и описана в 1946 году М.И. Кабачником и П.А. Российской /9/, а в 1963 году Майнард и Шван описали выделение этилена из его состава /143/. 2-ХЭФК представляет собой кристаллическое вещество с температурой плавления 74-75 С, обладающее низкой токсичностью для теплокровных LD50 для крыс при перональном введении 4220 мг/кг. В воде при рН выше 4,1-4,5 довольно быстро гидролизуется с выделением этилена:
Физиологическая активность препаратов, созданных на основе 2-ХЭФК (этрел, этефон, кампозан), обусловлена главным образом именно способностью высвобождать этилен в клетках растений /19, 216/. При этом не исключено, что в растениях in vivo гидролиз 2-ХЭФК осуществляется при участии ферментов /77/. 2-ХЭФК свободно передвигается по растению. Превращение 2-ХЭФК с высвобождением этилена происходит постепенно, что может служить подтверждением обоснованности предположения об участии ферментов в этом процессе /88, 129/.
При изучении ростовых процессов в эксплантатах тканей клубней картофеля Минато с сотр. было получено, что количество выделяющегося этилена при обработке тканей 2-ХЭФК зависит от ее концентрации. При этом происходят временные изменения в кинетике выделения этилена. Так, использование I мг 2-ХЭФК на каждый проросток картофеля вызывает значительное выделение этилена {до 200 нл на выческу) с 1-го до 24-го часа роста. После этого наблюдалось значительное уменьшение выделения этилена. В зависимости от количества применяемой 2-ХЭФК изменялся уровень ингибирования образования проростков, который достигал максимального значения при наибольшем выделении этилена /147/. Кроме этого, при изучении метаболизма 2-ХЭФК в системе культуры in vitro во время роста эксплантатов гевеи, было получено, что скорость распада 2-ХЭФК зависит от ее концентрации и количества действующего вещества /49/. В концентрации 20 мг/л 2-ХЭФК оказывала стимулирующий эффект на образование каллусной ткани сердцевины табака в культуре /196/ и при ингибировании нормального роста растений стимулировала индукцию и рост рыхлых каллусов из окончания микропйле и сегляпочки хлопчатника при отсутствии других экзогенных гормонов роста /194/. С другой стороны, 2-ХЭФК при добавлении в среду в концентрации 70 М ингибировала рост пыльцевой трубки Crotaiaria junicea /53/. Таким образом, исходя из представлен-ных данных, видно, что 2-ХЭФК оказывает разнообразные эффекты на ростовые процессы в зависимости от концентраций, физиологического состояния растительных тканей, условий исследований /27/. При довольно широком исследовании физиологических эффектов, вызываемых 2-ХЭФК в растениях, в настоящее время нет единого мнения о ее биохимическом действий. Имеющиеся данные представляют исследования, проведенные на различных растительных объектах и в неодинаковых условиях роста. Цель большинства этих исследований в основном сводилась к изучению одной из сторон метаболизма растения под влиянием 2-ХЭФК или препаратов, созданных на ее основе /27/. Так было показано, что этрел ЕЛИЯЄТ на В растущей ПЫЛЬЦевОЙ ТрубКв Crotaiaria junicea, а также на синтез липидов мембран /53/. С другой стороны, при изучении хлоропластов табака получено, что этрел определяет активность полифенолоксидазы, пероксидазы, каталазы, АТФ-азы, влияет на синтез хлорофилла, каротиноидов и белков. При этом этрел в концентрации ІРРт ингибирует все эти процессы. Повышение содержания этрела ведет к увеличению АТФ-азной активности /109/. Изменение активности ферментов посредством этрела, в частности, активности пероксидазы, зависит не только от концентрации действующего вещества, а также от исследуемого органа растения. Так получено, что этрел подавляет активность пероксидазы в проростках гороха и корневых окончаниях, однако в стебле и ткани листьев он увеличивает пероксидазную активность /108/. Это, по-видимому, может быть связано с влиянием этрела на синтез пероксидазы в этих тканях de novo /188/. Также при исследовании влияния аналога этрела-кампозана, синтезированного в ГДР химическим комбинатом "Биттерфельд" и Институтом органической химии, на компонентный состав белков у двух сортов ячменя было получено существенное изменение в профилях легко и труднорастворимых белков. Эти данные, полученные в лаборатории Деевой B.IL, свидетельствуют о глубоком влиянии соединений типа этрела на бе-локсинтезируюшую систему /7/. Были высказаны предположения о влиянии этрела на синтез РНК, однако эти данные нуждаются в дальнейшем подтверждении, так как более убедительных доказательств действия препаратов на основе 2-ХЭФК на нуклеиновый обмен растений в настоящее время еще не достаточно /29/.
Таким образом, данные по исследованию биохимического действия 2-ХЭФК в растительных тканях разнообразны и неоднозначны. Они также не дают представления о механизме действия этого вещества. Поскольку физиологическое действие 2-ХЭФК и препаратов, созданных на ее основе, большинство исследователей связывают с выделяющимся при гидролизе 2-ХЭФК этиленом /28/, представляет интерес рассмотрение вопроса о влиянии этилена на биохимические процессы, происходящие на ранних этапах роста растений.
Как было показано ранее, этилен оказывает ингибируюшее влияние на рост растений путем подавления или полного прекращения митотического процесса, происходящего в растущих тканях корней, побегов пазушных почек /46, 47/. Также было показано, что через несколько часов после добавления экзогенного этилена скорость синтеза ДНК, определяемая по кинетике включения 3Н-тимидина, начинала уменьшаться. Причем снижение скорости синтеза ДНК наблюдалось не только в делящихся апикальных меристемах, но и в зоне растяжения стебля /46/. С другой стороны, при исследовании интенсивности синтеза ДНК под влиянием экзогенного этилена на апексах проростков сои,
Условия культивирования эксплантатов топинамбура в системе in vitro
С другой стороны, при изучении дифференцирующих протокор-мов орхидеи Нагл с сотр. показали, что содержание гетерохрома-тина в определенных клетках растет непропорционально в течение процесса эндополиплоидизации. Анализ ДНК аналитическим центрифугированием показал наличие АТ-обогашенной сателлитной ДНК, которая, однако, не варьирует как гетерохроматин. Эта АТ-обога-щенная фракция ДНК является лабильной по отношению к воздействию экзогенных фитогормонов, в частности 2,4-Д /158/. Кроме этого, было показано, что гиббереллия в той же культуре вызывает усиление интенсивности синтеза ГЦ-обогашенной фракции ДНК.
При исследовании кинетики реассоциации ДНК топинамбура, выделенной из тканей обработанных и не обработанных ауксином, также было получено, что обработка регулятором роста растений вызы-внет изменения в быстрореассоцйируюшей фракции ДНК во время роста й дифференциации тканей клубней /128/.
Приведенные выше данные литературы о наличии амплификации и ее взаимосвязи с экзогенным воздействием регуляторов роста растений неоднозначны и недостаточны для создания единой схемы регуляции селективной репликации ДІЖ. Они не дают прямого ответа на вопрос о природе и функциях этой новосиятезированной ам-плифицйрованной ДНК.
Кроме данных, приведенных выше о фитогормональном влиянии на селективную репликацию ДНК в растениях, происходящую в ядре /71/, в литературе имеется ряд данных об определенных изменениях, происходящих в синтезе ДНК органелл (митохондрий и пластид) в ответ на гормональную обработку. Поэтому при изучении влияния регуляторов роста на синтез ДНК следует рассмотреть вопрос об эффекте, оказываемом на синтез неядерной ДНК в ответ на экзо-генно введенные фитогормоны.
При изучении селективной репликации ДНК в условиях культивирования in vitropaHeBHX тканей, следует учитывать, что во время выращивания растительных тканей в среде, содержащей фитогормоны, происходит активация не только процессов биосинтеза макромолекул, связанных с дальнейшим делением или ростом растяжения клеток. При внесении растительных тканей в культуру активизируются процессы дыхания и другие процессы метаболизма растений, связанные с переходом растительных клеток из одного физиологического состояния в другое. Одновременно с этим, вероятно, активизируются все процессы биосинтеза, связанные с метаболизмом раневых тканей в ответ на обработку регуляторами роста растений, в том числе и процессы, обеспечивающие нормальное прохождение биохимических реакций, связанных с дыханием и функционированием дыхательного аппарата в условиях роста in vitro. Поэтому ряд исследователей при изучении характеристик новосинтезирован-ной ДНК растений, особенно в случав, когда при обработке регуляторами роста образуются дополнительные сателлитные фракции ДНК, не исключают возможности гормональной индукции синтеза неядерной ДНК /121, 102/ - пластадной и митохондриальной.
Синтез митохондриальной ДНК ограничен одним периодом клеточного цикла, совпадающим cs фазой, во время которой происходит репликация ядерной ДНК /197/. ДНК митохондрий растений отличается высоким содержанием ГЦ-пар, что отражается на относительно высокой величине коэффициента распределения ДНК в градиенте хлористого цезия. Эта величина в основном постоянна для многих растительных объектов и составляет 1,706 - 1,707 г/см3. Однако имеются некоторые растительные системы, в которых мито-хондриальная ДНК имеет еще более высокое значение j = 1,712 -1,716 г/см3 /22/. Процент митохондриальной ДНК невелик и составляет 0,3 - 0,5 %, в некоторых случаях - до 1,0 % /197/. Поэтому при изучении распределения тотальной ДНК в градиенте Csci часто не улавливается пик митохондриальной ДНК,
Как было показано Грисвардом с сотр., при обработке проростков дыни регуляторами роста растений в процессе дифференциации ДНК имела сателлитную фракцию. При распределении в Csci она имела р - 1,706 г/см3, тогда как основной компонент имел f -= 1,692 г/см3. Причем при увеличении длительности ростового периода происходило увеличение величини сателлйтнои фракции /102/. Авторы объясняют увеличение сателлйтнои фракции изменением физиологического состояния тканей. Наличие этой сателлйтнои фракции, составляющей 25 % тотальной ДНК,, было также описано, и другими авторами /72, 289/. При дальнейшем исследовании сателлйтнои фракции из. проростков дыни с помощью термальной денатурации ДНК, было получено разделение сателлита по температурам плавления. Изменение соотношения и концентрации гормонов вызывало изменение во фракций сателлйтнои ДНК. В связи с этим авторами было сделано предположение, что один из компонентов сателлита включает в себя митохондриальную ДНК, синтез которой активируется при изменении условий роста растений /102/.
Кроме этого, было показано, что во время гиббереллин-инду-цированного растяжения клеток усиливается включение 3Н-тймидина во внеядерную фракцию ДНК гипокотилей дыни. Причем включение меченого предшественника в ядерную ДНК было в 10 - 20 раз ниже /86/. Иными словами, действие гибберелловой кислоты И/-ШС авторы связывают с индукцией синтеза ДНК органелл, а не ядра.
Имеющиеся данные о влиянии фитогормонов на индукцию синтеза ДНК органелл в настоящее время еще недостаточны. До сих пор еще нет однозначного ответа на вопрос о причинной взаимосвязи этих двух явлений, однако полностью исключать влияние регуляторов роста растений на синтез ДНК органелл при исследовании избирательной репликации ДНК после гормонального воздействия нельзя,
В связи с вышеизложенным материалом, имеющимся в литературе по вопросу о влиянии фитогормонов на ростовые и биосинтетические процессы, происходящие в растительных тканях, представляло большой интерес исследование воздействия нового эффективного регулятора роста растений 2-ХЭФК на синтез ДНК в сравнении с влиянием естественного фитогормона fr-WK на этот процесс. Особый интерес вызывает изучение характеристик и природы новосинте-зированной ДНК в ответ на обработку регуляторами роста растений. Использование в исследованиях метода культуры растительных тканей с его широким диапазоном возможных изменений условий внешней среды (минеральные соли, гормоны, освещение, температура) позволило провести исследования в строго контролируемых условиях роста растительных тканей. Для этих целей были выбраны запасающие ткани клубней топинамбура, которые являются удобными, так как при вычленении эксплантатов из клубней происходит нарушение по-кая клеток, и они синхронно вступают в митоз. Этому процессу предшествует синтез ДНК, РНК и белков. Высокий уровень естественной синхронизации тканей топинамбура связан с тем, что в покоящейся паренхимной ткани клетки в основном находятся на GX фазе митотического цикла и при нарушений покоя одновременно вступают в фазу синтеза ДНК.
Влияние различных концентраций регуляторов роста растений на интенсивность синтеза ДНК топинамбура
Одни и те же результаты, полученные при использовании натуральных и синтетических регуляторов роста для активаций ростовых процессов, имеют значительные различия /179, 130, 145/. Особенно осторожно следует относиться к используемым концентрациям искусственных фитогормонов. При использовании слишком высоких концентраций биологически активных веществ некоторые исследователи добивались гербицидного эффекта и отравления растительных тканей /211, 175, 55/. Различные концентрации природных и синтетических ауксинов вызывают аналогичные реакции растительных тканей. Причем при исследовании различных концентраций ауксина, в частности 2,4-Д, было получено, что он стимулирует различные морфо-физио-логические реакции растительного организма /218/. При изучении влияния 2,4-Д на синтез ДНК топинамбура Ясуда с сотр. показали, что наиболее эффективной для активного синтеза ДНК является кон-центрация 10 М. И эта концентрация является также оптимальной для индукций каллусной ткани в эксплантатах запасающих тканей клубней топинамбура /218/.
Нами было исследовано влияние J-WK (гетероауксина) на интенсивность синтеза ДНК в тканях клубней топинамбура в зависимости от ее концентрации в среде роста. Кинетику синтеза ДНК топинамбура изучали по включению 3Н-тимидина в ДНК Для исследования использовали концентрации J -WK от 10 А М до 10 М. Исходя из данных исследований, представленных в таблице I, можно заключить, что наиболее эффективной для интенсивного синтеза ДНК в эксплан-татах топинамбура является концентрация 5 х 10 М, которая и была использована в дальнейших исследованиях. При повышении содержания js-ЖК в среде нами получено снижение интенсивности включения меченого предшественника в ДНК топинамбура, тогда как при уменьшений концентрации j -WR не происходило каких-либо изменений в кинетике включения 3Н-тймидина.
При изучении влияния 2-ХЭФК на интенсивность включения меченого тймидина в ДНК мы не располагали данными литературы о концентрациях этого биологически активного вещества, используемых в бйохиїлических исследованиях. Известно лишь, что в концентрации 20 мг/л этрел способствовал нормальному развитию каллус-ной ткани в эксплантатах сердцевины стебля табака /196/. В этой же лаборатории были проведены исследования по химической устойчивости этрела к воздействию высоких температур и давления. В результате этих исследований было получено, что при автоклави-ровании 2-ХЭФК разлагается. В связи с этим были предложены иные методы стерилизации ростовых сред, содержащих 2-ХЭФК, которыми мы и воспользовались в нашей работе.
Для исследования влияния различных концентраций 2-ХЭФК на интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК топинамбура были использованы концентрации 2-ХЭФК от 10 до 100 мг/л (табл. 2). Из таблицы видно, что с увеличением концентрации регулятора роста в среде увеличивается степень ингибирования синтеза ДНК и при концентрации 70 - 100 мг/л синтез ДНК был практически полностью подавлен. Низкие концентрации 2-ХЭФК не вызывали значительных изменений в интенсивности включения 3Н-тимидйна в эксплантаты топинамбура по сравнению с контролем. Кроме этого, нами было показано, что после внесения в среду культивирования 2-ХЭФК в количестве, не являющемся летальным для клеток растений. При повышении концентрации этилена в среде роста происходило практически полное ингибирование ростовых процессов. Меньшие же концентрации этилена не вызывали сколько-нибудь значительных изменений в интенсивности синтеза ДНК, а также в росте растительной ткани. Поэтому в дальнейших исследованиях наїли использовалась оптимальная для ингибирования синтеза ДНК концентрация 2-ХЭФК -50 мг/л.
Нами также была изучена кинетика выделения этилена при разложении 2-ХЭФК в растительных тканях топинамбура на первых часах роста эксплантатов в культуре. Для этого были проведены исследования кинетики выделения этилена растущей в культуре тканью то-пинамбура при использовании j -WR и 2-ХЭФК, а также без обработки регуляторами роста. Данные исследования представлены на рисунке І й 2. Как видно из рисунка, наименьшее количество этилена выделяется при культивировании эксплантатов в условиях без гормональной обработки, причем уровень содержания этилена в воздушной среде роста эксплантатов оставался постоянным на протяжении эксперимента. Аналогично с контролем происходит выделение этилена при внесении в среду роста _/ -ИУК, Заметно более высокое содержание этилена наблюдалось в воздушной среде при экзогенном введении- 2-ХЭФК в концентрации 50 мг/л (3-4 нМ/г ткани, тогда как в контроле - 1,0 - 1,5 нМ/г ткани) .С увеличением времени инкубации ткани происходило увеличение содержания этилена в среде.
Определение температуры плавления ДНК топинамбура, выделенной из тканей обработанных и необработанных регуляторами роста
Вопросу о влиянии фитогормонов на физико-химические свойства ДНК до настоящего времени не уделялось достаточного внимания. Имеющиеся данные неоднозначны. При исследовании влияния регуляторов роста на физико-химические свойства ДНК растений было показано изменение температуры плавления /23/, нуклеотидного состава и метилирования ДНК /158, 3/. Также рядом исследователей была обнаружена амплификация ДНК растений под влиянием гормонов /68/. Однако эти исследования проведены на различных растительных системах и с применением разнообразных регуляторов роста и поэтому не дают полной картины влияния фитогормонов на физико-химические свойства ДНК растений. Также практически полностью не изученным остается вопрос о влиянии 2-ХЭФК на ДНК и ее физико-химические свойства.
При изучении кинетики синтеза ДЕК в эксплантатах топинамбура нами получены результаты, отражающие влияние экзогенно вводимых фитогормонов на параметры синтеза ДНК. В связи с этим представляло интерес исследование качественных характеристик ДНК топинамбура, выделенной из тканей клубней обработанных и необработанных регуляторами роста.
Для исследования физико-химических характеристик ДНК топинамбура необходимо было добиться выделения ДНК, отличающейся высоким уровнем очистки от примесей (белков, полисахаридов и РНК) и достаточным уровнем нативности. Сложность получения препаратов ДНК, отвечающих этим требованиям, заключалась в очистке ДНК топинамбура от примесей полисахаридов. По данным Г.М. Жуковского, ткани клубней топинамбура содержат высокий уровень инулина (до 48,31 % на сухой вес), Сахаров (до 6,8 % на сырой вес) и крахмал /8/. В связи с этим при подборе методики по выделению и очистке ДНК, полученной из тканей клубней топинамбура, необходимо было руководствоваться приемами, позволяющими избавиться от повышенного содержания полисахаридов.
Предложенная Дженином с сотр. методика по дифференциальной экстракции нуклеиновых кислот из больших количеств запасающих тканей топинамбура с применением 2-метоксиэтанола и цетилтриме-тиламмоний бромида для удаления примесей полисахаридов, с дальнейшей хроматографией на оксиапатите, оказалась неудачной для целей данной работы /119/. Основная причина заключается в небольшом выходе ДНК при выделении, а также неудовлетворительная очистка препарата ДНК от полисахаридов. Для данной работы использовались небольшие количества тканей клубней топинамбура, которые вырашивалйсь в условиях культивирования in vitro. Поэтому представлял интерес подбор соответствующей методики по выделению ДНК из небольших количеств запасаюпшх тканей топинамбура.
В связи с этим нами был использован метод выделения ДНК с применением цетилтриметиламмоний бромида (цетавлона), предложенный Нактинисом В.И. с сотр. /21/. Цетилтраметиламмоний бромид является сильным катионным детергентом, осаждающим ДНК из разбавленных солевых растворов. Он связывается с полианионами, в том числе и с ауклешовыми кислотами, и образует нерастворимые комплексы. Эти комплексы, однако, растворимы в солевых растворах, когда концентрация соли превышает некоторое критическое значение. Так как критическая концентрация соли выше для ДНК, чем для РНК, то они могут быть отделены друг от друга, а также от белков, полисахаридов и других примесей. Нерастворимость в воде цетавлоновых солей нуклеиновых кислот позволяет, избегая центрифугирования, достигать их количественного выделения с помощью флотации из очень разбавленных растворов. Цетавлон, являясь сильным детергентом, лизирует клетки и диссоциирует нуклеопротеидные комплексы, приводя к растворению белков, нуклеиновых кислот и других компонентов клетки. Как детергент, цетавлон ингибирует действие ферментов, в том числе и нуклеаз. С помощью этого метода удается быстро выделить более 80 % ДНК со средним молекулярным весом 20 х 10 дальтон и выше без применения рибонуклеази, проназы и амилазы.
ДНК, полученная описанным выше методом из эксплантатов клубней топинамбура, отличалась высоким уровнем очистки от примесей белков и полисахаридов. Коэффициенты 260/280 нм и 260/230лт составляли для данного препарата 1,8 и 2,1 соответственно. С помощью этого метода выделяли 2 - 2,5 мг ДНК из 10 г ткани. Однако полученный препарат ДНК начинал плавиться віх ssc с 65 С. Ход кривой, отражающей термальную денатурацию ДНК топинамбура, представлял собой отличную от классической s-образной кривой термальной денатурации. Это свидетельствовало о некоторых примесях FHK, имеющихся в препарате ДНК, выделенной по методу,предложенному В.И. Нактинисом с сотр. Для избавления препарата ДНК от примесей РНК наш была предпринята дополнительная очистка на основании методических данных, предложенных Т.Е. Сулимовой с сотр. /33/. Используя градиент концентраций Nacifl, принимая во внимание тот факт, что цетавлоногая соль РНК растворима в 0,5 MNaCi, а соль ДНК выпадает в осадок, полученную после лизиса и депротеинизации цетавлоновую соль ДНК растворяли в 0,7 М иаС1,как описано на с. 44-45. Это позволило практически полностью избавиться от примесей РНК в препарате ДНК. Остаточные количества РНК составляли менее I % Гиперхромйзм полученного препарата ДНК составлял A260(95)/A260(25O) x 100 = 39 (рис. II). Средний молекулярный вес ДНК - 10 х 10 дальто.н. Спектр препарата ДНК, полученных на "СІШКОРД-uv-vis" при разных длинах волн в I М NaCi , представлен на рисунке 10, Для получения высокомолекулярной ДНК без примесей фракционированной ДНК, раствор осаждали изопропанолом /139/. Определение температуры плавления ДНК топинамбура, выделенной из тканей обработанных и необработанных регуляторами роста По имеющимся данным, фитогормояы влияют на качественный состав ДНК, отражающийся в изменении температуры плавления. Так, данными Т.А. Паносяна с сотр. было показано снижение температуры плавления хроматина из проростков пшеницы под влиянием экзогенного гиббереллйна. Это, по-видимому, отражает дестабилизацию ДНК и активацию хроматина /23/. Вопросу влияния экзогенных фитогормо-яов на изменение кривых термальной денатурации ДНК растений посвящены и другие, ранее упоминавшиеся в обзоре литературы, исследования на протокормах орхидеи, метаксилемах лука.
В связи с этим в дальнейших исследованиях представляло интерес изучение температуры плавления ДНК топинамбура в зависимости от обработки экзогенными регуляторами роста растений 2-ХЭФК И /-ИУК.
