Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика лейкоцитов крови 12
1.1.1. Морфометрическая и количественная характеристика лейкоцитов 12
1.1.2. Функциональные свойства лейкоцитов 19
1.1.2.1. Фагоцитарная активность лейкоцитов 20
1.1.2.2. Адгезионная способность лейкоцитов 26
1.1.2.3. Осмотическая резистеность лейкоцитов 27
1.2. Экдистероиды: краткая характеристика 31
1.2.1. Фитоэкдистероиды и система крови млекопитающих 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Животные 43
2.2. Реактивы и оборудование 43
2.3. Методы исследования 45
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Функциональная активность лейкоцитов крови крыс при гемолитической (фенилгидразин) анемии с участием экдистероидсодержащей субстанции Серпистен 56
3.2. Реактивность лейкоцитов крови лабораторных животных при однократном введении экдистероидсодержащей субстанции Серпистен 89
3.3. Сравнительная оценка количественного состава лейкоцитов крови крыс при однократных (2 ч) и продолжительных (5 сут) инъекциях экдистероидсодержащей субстанции Серпистен 138
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 144
4.1. Изменение функциональных свойств и реактивности лейкоцитов крови лабораторных животных с гемолитической анемией при действии экдистероидсодержащей субстанции Серпистен 145
4.2. Реакция лейкоцитов крови лабораторных животных на однократное введение экдистероидсодержащей субстанции Серпистен 162
4.3. Анализ реактивности лейкоцитов крови крыс на однократное и многократное введение экдистероидсодержащей субстанции Серпистен 169
Выводы 175
Литература 177
- Морфометрическая и количественная характеристика лейкоцитов
- Функциональная активность лейкоцитов крови крыс при гемолитической (фенилгидразин) анемии с участием экдистероидсодержащей субстанции Серпистен
- Сравнительная оценка количественного состава лейкоцитов крови крыс при однократных (2 ч) и продолжительных (5 сут) инъекциях экдистероидсодержащей субстанции Серпистен
- Изменение функциональных свойств и реактивности лейкоцитов крови лабораторных животных с гемолитической анемией при действии экдистероидсодержащей субстанции Серпистен
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших проблем современной физиологии является исследование закономерностей процессов адаптации организма к различным факторам среды (Н.А. Агаджанян и соавт, 1999; 2001; В.П. Казначеев, 1980; Ф.З. Меерсон, 1981; B.C. Новиков, 1998). Система крови, имея высокую реактивность, быстро включается в реакции на действие физиологических и экстремальных факторов среды, обеспечивая поддержание гомеостаза (Н.В. Васильев и соавт., 1992; П.Д. Горизонтов и соавт., 1983; Г.И. Козинец и соавт., 2001; Б.Г. Юшков и соавт., 1999; 2001). Лейкоциты крови вовлечены в иммунные процессы (Р.В. Петров, Т.И. Ульянкина, 1995; В.А. Черешнев и соавт., 2002 и др.) и играют важную роль в создании микрососудистого сопротивления (С.A. Alonso et al., 1995; М.Т. Eppihimer, Н.Н. Lipowsky, 1996; В.Р. Helmke et al., 1997).
В последнее время значительно вырос интерес к изучению растительных
экдистероидов, обладающих комплексом положительных свойств при
отсутствии каких-либо побочных эффектов на организм животных и человека
(Л.Д. Пчеленко и соавт., 2002; В.Н. Сыров, З.А. Хушбактова, 2001; Yu. D.
Kholodova, 2001). Показано, что растительные экдистероиды оказывают
адаптогенное; анаболическое; иммуномодулирующее и
иммунокорригирующее; антиоксидантное и антирадикальное; бактерицидное и противовоспалительное; улучшающее реологические свойства крови (В.В. Володин, 1999, 2006; Л.Ф. Осинская, Л.М. Саад, Ю.Д. Холодова, 1992; М.Б. Плотников и соавт., 1999; A.G. Kurmukov, О.A. Yermishina, 1991). Известно влияние экдистероидов на пролиферацию клеток позвоночных (3. Саатов с соавт., 1979; К. Slama, 1993), что имеет важное значение при развитии анемий разного происхождения.
Фитоэкдистероиды - полигидроксилированные стерины, структурно идентичные или подобные гормонам линьки и метаморфоза насекомых. Теоретической основой применения экдистероидов является их физиологическое действие на организм млекопитающих, обусловленное
свойством данных соединений стимулировать биосинтез белка без эффектов других стероидов (К. Slama, R. Lafont, 1995). В 80-х годах в Институте химии растительных веществ АН УзССР из корней с корневищами левзей сафлоровидной {Rhapontucum cartomoides (Willd.) Iljiri) была выделена активная экдистероидсодержащая субстанция, на основе которой разработан препарат тонизирующего действия «Экдистен» (Н.К. Абубакиров, 1981; И.О. Куракина, В.М. Булаев, 1990; А.У. Маматханов и соавт., 1980). Низкий процент выхода экдистероидов левзей сафлоровидной, высокие экономические затраты на создание сырьевой базы приводят к поиску растений с высоким содержанием экдистероидов, одним из которых является серпуха венценосная (Serratula coronata L.). Экдистероидсодержащая субстанция Серпистен (основной компонент 20-гидрокисэкдизон) растений Serratula coronata L. успешно разрабатывается в последнее время (В.В. Володин, И.Ф. Чадин, 1996). Однако механизмы физиологического действия новой субстанции Серпистен на организм теплокровных изучены недостаточно. Система крови и в том числе лейкоциты отражают многие происходящие в организме физиолого-биохимические процессы (воспалительные, иммунные, микрореологические). Изучение функционального состояния лейкоцитов крови в ответ на действие Серпистена продиктовано, как стремлением ближе подойти к раскрытию механизмов действия исследуемой экдистероидсодержащей субстанции на живой организм, так и потребностью создания нового препарата с большим набором физиологических эффектов.
Цель исследования:
Изучение функциональной активности и количественного состава лейкоцитов крови лабораторных животных при экспериментальной анемии в условиях корригирующего действия растительных экдистероидов.
Для достижения цели исследования реализованы следующие задачи: 1. Исследование особенности функциональной активности лейкоцитов крови при экспериментальной гемолитической анемии (фенилгидразин).
Оценка характера влияния и эффекты последействия экдистероидсодержащей субстанции на состав и функции лейкоцитов крови практически здоровых лабораторных животных в зависимости от режима и дозы введения.
Изучение функционального состояния лейкоцитов крови под действием субстанции Серпистен на фоне развившейся гемолитической анемии и при условии предварительных (профилактических) введений исследуемой субстанции.
Научная новизна исследования
Впервые показаны эффекты одно- и многократного введения экдистероидсодержащей субстанции (ЭС) Серпистен на количественный состав и функциональную активность лейкоцитов крови лабораторных животных.
Впервые выявлена способность ЭС Серпистен повышать активность элементов защитной системы крови, усиливая, в частности, фагоцитарную активность лейкоцитов, повышая сумму поглощенных микроорганизмов (Saccharomyces cerevisiae) независимо от дозы, режима введения, а также состояния организма.
Впервые проведено комплексное сравнительное исследование функциональной активности лейкоцитов крови под действием ЭС Серпистен у лабораторных животных (крысы) в норме и при экспериментальной гемолитической анемии. Исследованы особенности сопротивляемости лейкоцитов крови средам с низкой осмолярностью, выраженные через резистентность и регуляторные возможности у крыс при сочетанном и раздельном действии ЭС Серпистен и фенилгидразина. Проведена оценка адгезионной способности лейкоцитов крови под действием ЭС Серпистен у крыс в норме и при экспериментальной анемии.
Впервые показано, что эффект ЭС Серпистен зависит от пола животных (мыши, крысы).
Впервые продемонстрирована возможность ЭС Серпистен «нормализовать» картину белой крови, измененной действием гемолитического яда, в процессе развития гемолитической анемии у млекопитающих (крысы). Эффекты такого рода свойственны адаптогенным препаратам. Эффект нормализации подтверждается, в частности, уменьшением числа ауторозеток (снижение ауторозеткообразования), которые способствуют освобождению циркулирующей крови от поврежденных гемолитиком эритроцитов.
Впервые выявлено, что ЭС субстанция Серпистен, введенная как до гемолитика, так на и его фоне способствует формированию «экономного» типа реагирования нейтрофилов и лимфоцитов у крыс, проявляющегося в ограничении набухания клеток при снижении концентрации окружающего раствора (т.е. ЭС Серпистен стабилизирует мембрану лейкоцитов).
Впервые показано, что предварительные инъекции (профилактические, перед введением фенилгидразина) ЭС Серпистен в течение 5 дней в дозе 5 мг/кг/день и 20 мг/кг через день (суммарная доза 25 и 60 мг/кг, соответственно) стабилизируют картину белой крови так, что в ответ на введение гемолитического яда фенилгидразина она практически не меняется.
Научно-практическая значимость
Обнаруженная способность новой ЭС Серпистен, основным компонентом которой (-80%) является 20-гидроксиэкдизон, стимулировать неспецифические защитные силы организма трех видов лабораторных животных (млекопитающих) может быть учтена и использована при создании новых лекарств или биологически активных пищевых добавок.
Выявленные эффекты ЭС Серпистен в условиях экспериментальной гемолитической анемии открывают перспективы использования его в качестве мембраностабилизирующего и адаптогенного средства для предупреждения последствий действия гемолитических ядов, а также для лечения гемолитических анемий, как средства, облегчающего последствия действия гемолитического яда, то есть, открываются перспективы использования
субстанции Серпистен в клинической практике в качестве профилактического и лечебного средства в дополнение к лекарственной терапии для предупреждения и лечения гемолитических анемий.
Материалы и методы экспериментальной части (метод внутрисосудистого розеткообразования для оценки степени повреждения клеточных мембран; комплексный метод исследования геометрии, площади поверхности, резервных возможностей мембраны, осморегуляции, адгезионной способности лейкоцитов, показателей фагоцитоза, общего количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови) включены в проводимые на кафедре физиологии человека и животных СГУ работы большого практикума по курсу «Физиология человека и животных».
Результаты проведенных исследований будут способствовать более глубокому пониманию физиологических механизмов действия новой перспективной экдистероидсодержащей субстанции Серпистен на защитную функцию крови организма млекопитающих.
Результаты работы призваны привлечь внимание к свойствам новой экдистероидсодержащей субстанции Серпистен и к изучению действия данной субстанции на лейкоциты крови, а также объяснить выявленные в ходе исследований эффекты режима и доз препарата в физиологических и экстремальных условиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Снижение повреждающего действия гемолитического яда как при профилактическом введении ЭС Серпистен, так и при введении на фоне фенилгидразиновой анемии обусловлено стабилизацией поверхностной мембраны клеток крови, способствующей облегчению выхода животных из состояния гемолитической анемии.
При введении ЭС Серпистен в реакциях на гемолитический яд стабилизируется количественное соотношение различных форм лейкоцитов крови лабораторных животных.
В ответ на введение ЭС Серпистен происходит активация лейкоцитов, проявляющаяся в повышении суммы поглощенных микроорганизмов и фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов крови лабораторных животных.
Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность научным руководителям д.б.н., проф. Марине Зотовне Федоровой Белгородского университета за руководство в выполнении данной работы и к.б.н., доц. Нелли Алексеевне Мойсеенко Сыктывкарского университета за научное направление темы кандидатской диссертации и осуществление руководства над работой в период моей учебы в аспирантуре, а также д.б.н. В.В. Володину и к.б.н. СО. Володиной Института биологии Коми НЦ УрО РАН за любезно предоставленную экдистероидсодержащую субстанцию Серпистен и химические реактивы, а также всем сотрудникам кафедры физиологии человека и животных химико-биологического факультета Сыктывкарского университета за поддержку и помощь в выполнении работы. Особую благодарность выражаю к.м.н., врачу высшей категории, гематологу-иммунологу г. Нижнего Новгорода Геннадию Владимировичу Сидневу за ценные советы и консультации и ст.н.с. Института биологии Коми НЦ УрО РАН Андрею Ильичу Кичигину за рекомендации к написанию научной работы и предоставленный метод для более глубокого исследования функциональной активности лейкоцитов крови под действием экдистероидсодержащей субстанции Серпистен.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения Ф.В. Овсянникова «Механизмы
функционирования висцеральных систем» (г. Санкт-Петербург, 2003); VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (г. Санкт-Петербург, 2004); конференции студентов и молодых ученых «Научное студенческое сообщество и современность» (г. Анталия, Турция, 2004); XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Екатеринбург, 2004); IX международном Съезде Фитофарм, конференции молодых ученых Европейского Фитохимического общества «Растения и здоровье» (г. Санкт-Петербург, 2005); IV Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2005; 2006); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2006).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 22 печатные работы, из них 3 статьи.
Морфометрическая и количественная характеристика лейкоцитов
Нейтрофилы - округлые клетки, диаметром от 7,0 до 15,0 мкм. В цитоплазме мелкая нейтрофильная зернистость, ядро по мере развития клетки постепенно сегментируется. На основании строения ядра различают сегментоядерные, палочкоядерные и юные нейтрофильные гранулоциты. У крыс сегментоядерные формы составляют 30% от общего количества лейкоцитов (В.Н. Никитин, 1949), по Д.И. Гольдбергу и соавт. (1973) - до 22%.
Палочкоядерные формы представляют собой как стадию развития и как конечную форму развития нейтрофилов и содержатся в основном в костном мозге. В периферической крови их у крыс не более 0,5% (А.В. Илюхин и соавт., 1976; О.В. Александровская и соавт., 1987). У мышей линии СВА количество нейтрофильных гранулоцитов составляет 10-41% (И.П. Западнюк и соавт., 1983).
Основной или центральный пул клеток находится в костном мозге, где зрелые нейтрофилы (палочкоядерные и сегментоядерные) составляют, например, у человека около 40% всего клеточного состава. Около 50% всех нейтрофилов, находящихся в кровеносных сосудах не разносятся с током крови, а прилипают к стенкам сосудов, особенно в легких и селезенке (X. Вайс и соавт., 1996). Это периферический пул (резерв) клеток.
Мобилизация периферического пула нейтрофилов осуществляется главным образом рефлекторно в результате действия на микроциркуляторное сосудистое русло физиологических или патологических раздражителей малой интенсивности (пищеварение, беременность, мышечная работа, перегревание, курение и др.). Выброс клеток из центрального пула происходит в ответ на действие сильных стрессоров (рентгеновское облучение, инфекции, интоксикации, травмы и т.д.) через стресс-медиаторы (адреналин, кортизол), а также посредством воздействия хематтрактантов, образующихся при активации комплемента и разных клеток в местах повреждения и воспаления (Д.Ф. Глузман и соавт., 2000; Т.Н. Копьева, О.М. Амосова, 1990; А.Г. Лукьянова, Р.В. Ленская, 1996; А. Ройт, 1991; В.В. Серов, B.C. Пауков, 1995).
Ускоренное выхождение нейтрофилов из костного мозга может сопровождаться увеличением не только зрелых, но и более молодых клеточных форм (метамиелоциты и др.) (А.Н. Шабанов, 1972). Срок жизни нейтрофилов в тканях около 7 дней (С.А. Килмен, 1974). Клетки гибнут в результате процессов апоптоза и внешних физических и химических воздействий при старении и в очагах деструкции тканей (А.Д. Панцхава, 1969; А.А. Ярилин, 1999). У крыс отмечается сезонная динамика клеток белой крови (нарастание лимфоцитов и снижение нейтрофилов в зимнее время), связанная с колебаниями магнитных и метеорологических факторов, изменением пищевого баланса. Указанные колебания клеточного состава лимфоцитов и нейтрофилов считаются отражением свойственных организму человека и животных биологических ритмов (Ю.М. Вельский, 1987; И.А. Кассирский, Д.И. Денщикова, 1974; Э.Н. Нуритдинов, 1990).
Снижение количества нейтрофилов в крови (нейтропения) возникает при перераспределении клеток (уход клеток в ткани в очаги хронически текущего воспаления, а также при повреждении костного мозга физическими, химическими и биологическими факторами (радиация, кроветворные яды, вирусы, антитела) (В.П. Бонд, 1974; А.Г. Кудяшева, А.И. Кичигин, 2000; B.C. Ронин, 1990; А.Р. Туков, 2000; Ц.В. Чинчаладзе и соавт, 1989).
Посредством фагоцитоза и участия в реакциях клеточного и гуморального иммунитета нейтрофилы очищают организм от инфекционных агентов, иммунных комплексов, продуктов распада тканей. Наличие резервов, быстрая мобилизация, постоянное «дежурство» в любых «уголках» организма, способность к амебоидному передвижению в тканях (хемотаксис) и способность функционировать в анаэробных условиях позволяет считать нейтрофильные гранулоциты важнейшим звеном в защитных реакциях организма (И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001).
Эозинофилъные гранулоциты, клетки несколько крупнее нейтрофильных лейкоцитов (диаметр их в мазке от 8,2 до 19,8 мкм), имеют на поверхностной мембране рецепторы к иммуноглобулину класса Е (IgE) и комплементу (Сз - и С4), в цитоплазме - крупные гранулы, окрашивающиеся эозином в красный цвет и содержащие, токсичный для паразитов, главный основной белок (major basis protein). Главные функция клеток - участие в аллергических реакциях немедленного типа, осуществляется посредством дегрануляции клеток с выделением гистамина и других медиаторов воспаления направленного в конечном итоге на элиминацию патогена (Д.Н. Яновский, 1962). При стресс-реакциях отмечается падение числа эозинофилов в крови, обусловленное увеличением содержания гормонов надпочечников (Г.И. Козинец и соавт., 2001). У крыс содержание эозинофилов составляет около 2% (Д.И. Гольдберг и соавт., 1973; В.Н. Никитин, 1949). Базофильные гранулоцити содержатся в крови крыс в очень небольшом количестве - до 0,2% (В.Н. Никитин, 1949), поэтому при подсчете лейкоцитарной формулы большого значения не имеют. Клетки эти обычно круглой или кругл оовальной формы, диаметром 8-15 мкм. Базофилы участвуют в аллергических реакциях и в регуляции микроциркуляции (содержат антикоагулянты типа гепарина).
Моноциты - большие клетки крови (от 10,0 до 20,0 мкм в диаметре), большей частью округлой, иногда неправильной формы, с дымчатой цитоплазмой, содержащие пылевидную зернистость и большим ядром (С.А. Луговская, 1997) - являются «родственниками» нейтрофилов по пути от стволовой кроветворной клетки (СКК), имеют общий ростовой фактор (КСФ ГМ) и сходные по основной функции - фагоцитозу. Моноциты играют основополагающую роль в реакциях презентации антигена иммуноцитам (Т-, В-, NK- лимфоцитам), при активации выделяют большое число про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1, фактор некроза опухоли (ФНО), ИЛ-6, ИЛ-10 и др.). Попадая в ткани, моноциты совершают 1-2 деления и остаются в тканях в виде тканевых макрофагов, где участвуют в реакциях фагоцитоза и иммунитета. У крыс они составляют 1-3% от общего количества лейкоцитов (В.Н. Никитин, 1949; Д.И. Гольдберг и соавт., 1973), у человека около 6% (Т.Я. Свищева, 2002).
Как и нейтрофилы, моноциты имеют периферический и центральный пул. Моноциты крови, макрофаги тканей, дендритные клетки объединяют мононуклеарной фагоцитарной системой (МФС) по происхождению и функциональным свойствам (способность к фаго- и пиноцитозу, адгезивности, наличие рецепторов для иммуноглобулинов и комплемента). Адгезивность клеток МФС коррелирует со степенью их активации, усиливается под действием ряда лимфокинов. При распластывании макрофагов, по-видимому, используется резервная часть плазматической мембраны, увеличивается число микротрубочек и актиновых микронитей (Г.И. Козинец и соавт, 2004; А.А. Ярилин, 1999). Уникальной особенностью клеток МФС является устойчивость их адгезивности к трипсину. У сенсибилизированных клеток в присутствии специфического антигена описано как усиление прикрепления и распластывания (A. Dimitriu et al., 1974), так и угнетение адгезивности (V. Holan., 1974). Активность распластывания клеток МФС на стекле отражает их способность к фагоцитозу, подвижности, к межклеточным кооперациям.
Функциональная активность лейкоцитов крови крыс при гемолитической (фенилгидразин) анемии с участием экдистероидсодержащей субстанции Серпистен
Для экспериментального моделирования гемолитической анемии, как одного из фактора экстремального (химического) воздействия, мы вводили животным фенилгидразин - мощный гемолитик. Таким образом, проведено 4 серии исследований. В первой серии эксперимента использовали 2,5 мес крыс линии Wistar обоего пола. Оценивали функциональное состояние лейкоцитов крови животных при экспериментальной ФГ анемией и ФГ анемии на фоне предварительных инъекций ЭС Серпистен. Проведенные нами исследования показали (табл. 2), что введение ФГ самцам крыс приводит к достоверному снижению у них в крови ФА нейтрофилов и моноцитов (р 0,001) и СПК (р 0,01) на 24% по сравнению с интактными. ФИ при этом не меняется. В эксперименте на самках также показано, что инъекции ФГ вызывают снижение ФА на 15%, р 0,02 по сравнению с интактными, СПК и ФИ изменяются незначительно. Снижение показателей фагоцитоза: ФА и СПК в ответ на введение ФГ, показывает, что процесс фагоцитоза угнетается вследствие снижения резистентности организма к гемолитику. В подтверждение негативного действия ФГ мы наблюдаем снижение осмотической стойкости (ОР) лейкоцитов крови самцов на 50,5%, р 0,01 по сравнению с интактными (табл. 3). У самок в ответ на действие ФГ снижение ОР незначительно (7%).
При изучении осморегуляторных свойств клеток крови интактных и опытных крыс были выявлены следующие особенности изменения размера клеток при снижении осмотического давления окружающего раствора хлорида натрия. Абсолютные значения диаметра нейтрофилов и лимфоцитов в средах разной концентрации представлены в таблице 4 а, б. В частности, на клетках крови самцов крыс показано, что в изотоническом (0,9% NaCl) растворе диаметр нейтрофилов и лимфоцитов крови интактных крыс составляет 9,5±0,1 и 6,6±0,04 мкм, соответственно. Через 60с в 0,2% NaCl отмечается увеличение (р 0,001) среднеклеточных диаметра, площади поверхности и объема нейтрофилов на 15, 32 и 51% соответственно; лимфоцитов - на 17, 36 и 59%. Незначительное снижение осмолярности среды (60 секундная инкубация в Примечание: п - число животных; d - диаметр клеток; S - площадь поверхности клеток; V -объем клеток; достоверность внутригрупповых различий с клетками, инкубированными в изотоническом (0,9% NaCl) растворе при р 0,05а, 0,02в, 0,01с, 0,001d; достоверность различий с клетками интактной группой, инкубированными в 0,9% NaCl при р 0,05 . 0,45% растворе NaCl) также приводила к увеличению размеров лейкоцитов. Через 1 ч в 0,45%) NaCl осморегуляторные реакции клеток крови интактных крыс обеспечивали практически полное восстановление исходного объема клеток.
В ответ на введение ФГ высокий осмотический градиент (60с в 0,2% NaCl) приводит к высоко достоверному (р 0,001) увеличению диаметра, площади поверхности и объема нейтрофилов на 27, 61 и 104% соответственно и на 32, 74 и 130%) - лимфоцитов. То есть, при действии ФГ происходит более выраженный рост данных параметров клеток по отношению к таковым в изотоническом растворе, нежели у интактных. Незначительное снижение концентрации среды (60 с в 0,45% NaCl) также приводило к увеличению размеров лейкоцитов, но в меньшей степени, чем в 0,2% NaCl (60 с). Инкубация затем в течение 1ч в 0,45%) NaCl не приводит к полному восстановлению исходного объема клеток. Примечание: n - число животных; d - диаметр клеток; S - площадь поверхности клеток; V -объем клеток; достоверность внутригрупповых различий с клетками, инкубированными в изотоническом (0,9% NaCl) растворе при р 0,01в, 0,001d; достоверность различий с клетками интактной группой, инкубированными в 0,9% NaCl при р 0,01 . Оценка адгезионной способности смешанной популяции лейкоцитов крови интактных крыс и крыс, которым вводили ФГ показала следующее (табл. 5). Характер распределения лейкоцитов по классам в зависимости от силы сцепления у интактных животных выглядел следующим образом. Низкую адгезионную активность имели 41,6±8,4 и 39,3±3,4% клеток у самцов и самок соответственно, что согласуется с данными М.З. Федоровой и соавт. (2000а), полученными в экспериментах на беспородных белых крысах-самцах. Средние силы сцепления имели 12,8±1,9 и 39,1±4,2% клеток, высокие - 45,6±9,7 и 21,7±6,2% клеток у самцов и самок соответственно. Общее число адгезировавших клеток в этой группе составляет в среднем 58,4±8,4% у самцов и 60,7% у самок. Дифференциальный подсчет соотношения гранулоцитов (табл. 5) показал, что у интактных крыс адгезионная активность в основном обеспечивается за счет нейтрофилов у самцов и лимфоцитов у самок.
В ответ на введение ФГ снижается число неадгезированных клеток на 56%, р 0,05 у самцов и с тенденцией на 11%, Р 0,3 у самок по сравнению с таковыми у интактных животных. При этом увеличивается число клеток, имеющих высокие силы сцепления на 46% (разница достоверна с пониженной надежностью, р 0,1) и 29% у самцов и самок соответственно. Количество клеток средней силы сцепления достоверных изменений не имеют. Общее число адгезировавших клеток достигало в среднем с 58,4 до 81,8%, р 0,05 у самцов и с 60,7 до 65,2%, Р 0,3 у самок. Соотношение гранулоцитов показало, что более высокие силы сцепления имеют лимфоциты по сравнению с нейтрофилами независимо от пола животного.
В нашем эксперименте о наличии гемолитической анемии свидетельствует существенное высоко достоверное (р 0,001) увеличение количества ауторозеток, как за счет сегментоядерных нейтрофилов, так и моноцитов, способствующих освобождению крови от поврежденных и старых эритроцитов, почти в 4,2 раза у самцов и еще больше у самок - в 7,2 раза (табл. 6). Как следствие развития защитной реакции клеток крови крыс обоего пола . в ответ на действие гемолитика наблюдаем высоко достоверное (р 0,001) увеличение общего количества лейкоцитов в крови примерно на треть (31%) у самцов и на 103% - у самок по сравнению с таковым у интактных (рис. б).
Динамика изменения клеточного состава лейкоцитов крови самцов и самок крыс, вызванного введением ФГ представлены в таблице 7. Как видно из таблицы у самцов в ответ на введение ФГ по сравнению с интактными животными происходит достоверное (р 0,01) повышение доли эозинофилов почти в 3 раза (200%), чем, по-видимому, обусловлено, повышенное количество лейкоцитов. Остальные показатели крови (нейтрофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты) изменяются незначительно.
Сравнительная оценка количественного состава лейкоцитов крови крыс при однократных (2 ч) и продолжительных (5 сут) инъекциях экдистероидсодержащей субстанции Серпистен
Опыты по влиянию однократных и многократных введений ЭС Серпистен на лейкоцитарную формулу крови проводили на нелинейных белых крысах (возраст 3,5 мес).
Гематологические показатели нелинейных крыс обоего пола под действием одно- и многократных инъекций ЭС Серпистен и NaCl представлены в таблице 27. Как видно из таблицы у самцов через 2 ч после внутримышечной инъекции субстанции Серпистен общее количество лейкоцитов крови у них по сравнению с интактной группой практически не меняется. При 5-кратной инъекции практически того же количества Серпистен наблюдается тенденция (Р 0,3) к снижению количества лейкоцитов (22%). Уменьшение числа лейкоцитов в ответ на продолжительные инъекции в крови происходит за счет снижения (разница достоверна с пониженной надежностью количества нейтрофилов (26%, р 0,1) и происходит это, прежде всего за счет сегментоядерных клеток. Обнаружено, что эффект на однократное введение ЭС
Серпистен дозе 20 мг/кг выражен сильнее, чем ответ на практически такую же (даже большую - 25 мг/кг суммарно) дозу Серпистен, но введенную в 5 приемов, в течение 5 дней по 5 мг/кг в день, т.е. постепенно. Получается, что имеет значение режим введения вещества: постепенное накопление дозы дает эффект той же направленности, но несколько мягче выраженный. Это справедливо в отношении клеточного состава крови самцов крыс.
Показано, что у самцов доля сегментоядерных нейтрофилов снижается на 43%, р 0,05 через 2 ч после однократной инъекции и только на 29%, р 0,1 - после 5 139 кратных инъекций ЭС Серпистен по сравнению с нормой. Доля же палочкоядерных клеток, наоборот, увеличивается на 42% через 2 ч после однократной инъекции и не меняется после 5-кратных инъекций ЭС Серпистен.
Выявлено, что у самок через 2 ч после однократного введения ЭС Серпистен общее количество лейкоцитов у них в крови повышается на 29%, Р 0,2 по сравнению с интактными животными и не меняется после 5-кратных инъекций исследуемой субстанции. Достоверных изменений гематологических показателей (нейтрофилы: палочкоядерные, сегментоядерные) самок крыс нами не выявлено ни при однократном, ни курсовом введении ЭС Серпистен.
Количество лейкоцитов в крови крыс самцов контрольных групп, которым вводился NaCl, находится на уровне у интактных независимо от режима введения. Наряду с этим происходят изменения отдельных показателей крови экспериментальных самцов крыс. При этом реакция лейкоцитов крови крыс через 2 ч после однократного введения NaCl более выражена, нежели при 5-кратном введении. Показано, что в ответ на однократное введение NaCl животным через 2 ч в крови у них отмечается некоторое повышение количества нейтрофилов по сравнению с интактными с увеличением вариабельности показателя (свидетельство усиления индивидуального разброса ответной реакции организма). При этом достоверно почти в 3 раза по сравнению с нормой повышается доля палочкоядерных нейтрофилов. По-видимому, это связано с неспецифической реакцией организма в ответ на введение NaCl, действующего как раздражитель (стрессор) (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983). Количество же сегментоядерных нейтрофилов снижается на 28%, Р 0,2 по сравнению с интактными крысами. При 5-кратной инъекции NaCl отмечается лишь незначительное снижение количества нейтрофилов по сравнению с исходным уровнем, и вновь, прежде всего за счет сегментоядерных, доля которых уменьшается на 18% по сравнению с исходным значением. Доля же палочкоядерных становится несколько выше (29%).
Исследования показали, что у самок крыс, как при однократной, так и продолжительных инъекциях NaCl происходит повышение общего количества лейкоцитов на 21%, р 0,1 и 24%, Р 0,3 соответственно. Изменения показателей крови самок крыс в ответ на введение NaCl аналогичны таковым у самцов, то есть оказываются, также, более выраженными при однократной инъекции NaCl, нежели продолжительных инъекциях. Однако направление изменений отдельных показателей крови самок противоположно таковому у самцов. Через 2 ч после однократного введения NaCl в крови самок отмечается снижение количества нейтрофилов (24%, Р 0,3) в основном палочкоядерных (45%, р 0,01), тогда как у самцов происходит повышение данных показателей крови. Доля сегментоядерных клеток крови самок крыс находится на уровне нормы. В ответ на 5-кратные инъекции NaCl в крови самок крыс на фоне повышенного общего уровня лейкоцитов показатели крови (нейтрофилы) достоверно не изменяются.
Таким образом, реакция со стороны лейкоцитов крови в ответ на введение ЭС Серпистен и NaCl, в котором она была растворена, оказывается разной и зависимой от пола животного. Так, например, у самцов независимо от режима введения ЭС Серпистен доля нейтрофилов снижается, прежде всего, за счет сегментоядерных клеток; в ответ же на однократное введение NaCl она увеличивается, на многократное - снижается, но в меньшей степени, чем в ответ на серпистен. При этом повышение количества нейтрофилов в ответ на однократную инъекцию NaCl обусловлено, прежде всего, за счет палочкоядерных клеток, а не сегментоядерных, как в ответ на введение Серпистен. У самок независимо от режима введения ЭС Серпистен доля нейтрофилов сохраняется на уровне интактных; в ответ на однократное введение NaCl она снижается, на многократное - находится на уровне нормы. При этом доля нейтрофилов в ответ на однократную инъекцию NaCl изменяется, как и у самцов соответствующей группы, но в противоположном направлении, за счет палочкоядерных клеток. Показано, что к развитию нейтрофилеза приводит назначение таких гормонов, как кортизон, гидрокортизон (Г.И. Козинец и соавт., 2004). Мы, в ответ на введение Серпистен отмечаем нейтропению и видим в этом подтверждение представлений о том, что Серпистен, как представитель стероидов, не обладает гормональным действием в организме млекопитающих.
Известно (Г.И. Козинец и соавт., 2001), что длительный прием стероидов снижает выработку эозинофилов и базофилов. Эксперименты показывают, что у крыс экспериментальных групп независимо от пола животного при введении ЭС Серпистен количество эозинофилов сохраняется на уровне исходной величины через 2 ч после однократной инъекции и несколько повышается (58%, Р 0,3 у самцов и 60%, Р 0,4 у самок) после 5-кратных инъекций субстанции. Это подтверждает, что ЭС Серпистен не обладает свойствами истинных стероидных гормонов, хотя исследуемая субстанции и относится к классу полигидроксилированных стероидов. В ответ на введение NaCl в крови самцов крыс количество эозинофилов изменяется в одном направлении. Причем реакция эозинофилов в ответ на действие однократной инъекции NaCl через 2 ч после введения выраженнее (доля эозинофилов снижается на 63%, Р 0,3), чем 5-кратных инъекций (доля эозинофилов снижается на 16%). Показано (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983 и др.), что среди признаков, характерных для стресс-реакции системы крови, является нейтрофильный лейкоцитоз и эозинопения. На основе полученных данных мы полагаем, что введение ЭС Серпистен является фактором, который в какой-то степени нивелирует стресс-реакции, вызванную введением NaCl и уколом. Следует отметить, что в крови самок независимо от режима введения NaCl количество эозинофилов оказывается заметно выше (на 90%, Р 0,2 и 60% при однократном и многократном введении соответственно), тогда как у самцов, напротив, ниже по сравнению с интактными животными.
Изменение функциональных свойств и реактивности лейкоцитов крови лабораторных животных с гемолитической анемией при действии экдистероидсодержащей субстанции Серпистен
Известно, что в развитии неспецифической резистентности организма имеют большое значение нейтрофильные гранулоциты и моноциты крови, основная функция которых сводится к фагоцитированию микробных культур, их связыванию, поглощению, перевариванию и элиминации иммунных комплексов (В .А. Берестов, Л.Б. Узенбаева, 1983). Мы оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов в реакции дрожжевого фагоцитоза. Наиболее отчетливо в фагоцитирующих клетках выявляются образование фагосом и фаголизосом. Последние представляют (при рассматривании в световом микроскопе) осветленные, вероятно, лишенные гранулярной фракции участки цитоплазмы с заключенными в них клетками дрожжей. Поглощение дрожжей эозинофилами крови наблюдалось лишь в единичных случаях и ни в одном из них не сопровождалось какими-либо признаками образования вакуолей и изменениями гранулярной субстанции. Давно известно (В.А. Берестов, Л.Б. Узенбаева, 1983), что эозинофилы также способны к фагоцитозу, причем механизм поглощения тест-объекта эозинофилами не отличается от такового нейтрофилов и характеризуется явлениями образования фагосом и дегрануляцией цитоплазмы. Но в этом случае эозинофильные гранулоциты фагоцитируют слабее, чем нейтрофильные, и обладают слабой бактерицидной активностью. Мы рассматривали фагоцитарную функцию только сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов, так как количественно это самые представительные группы клеточных элементов крови, способных к фагоцитозу.
Поскольку ЭС Серпистен обладает мембраностабилизирующим (А.А. Коцюруба и соавт., 1999), иммуномодулирующим и стрессозащитным (Ж.Е. Иванкова, Н.А. Мойсеенко, 2004; D.S. Trenin, V.V. Volodin, 1999) действиями, выбор серии экспериментов остановился на изучении картины крови лабораторных животных (крысы) с экспериментальной, вызванной мощным гемолитиком - ФГ, анемией при действии ЭС Серпистен.
В ходе исследования получены данные о снижении ФА лейкоцитов (табл. 2, 8) крыс независимо от пола животного в ответ на действие ФГ, что может говорить о заметном угнетении процесса фагоцитоза, а, следовательно, и снижении защитных функций организма в целом. Механизм данного явления до конца не раскрыт. Однако на сегодняшний день известно, что ГА при воздействии ФГ обусловлена стимуляцией образования активных форм кислорода (супероксидный радикал и его производные) и липидных свободных радикалов, которые вызывают разрушение бимолекулярного фосфолипидного слоя мембран с образованием в них пор и ингибированием Na+/K+ - АТФ-азы, а также молекулярные нарушения в состоянии белков скелета клетки. Это, в свою очередь, ведет к вхождению ионов Na+ в клетку, а затем и воды, вследствие чего, клетка гипергидратируется и гемолизируется (Н.М. Василенко, 2002; Б.Н. Лю, 2001; Л.А. Тиунов, 1976; DJ.M. Seso, G.C. Goeringer, 1990; I. Stoian et al., 1996; F. Turrini et al., 1991). Выше изложенные факты получены на эритроцитах крови. Необходимо отметить, что изучение структуры и молекулярной организации белков мембраны эритроцитов дает важную информацию о молекулярных подходах к изучению аналогичных белков в других клетках и тканях организма. Так, белки, близкие по антигенным свойствам и молекулярной массе спектрину, анкирину, белкам полос 3 и 4.1., обнаружены и в лейкоцитах. То есть обнаруженные эффекты ФГ на эритроцитах, можно экстраполировать и на лейкоциты. Несмотря на большое количество работ по изучению действия ФГ на эритроциты не удается объяснить, почему in vitro гидразины, в частности ФГ, почти не вызывает гемолиза эритроцитов, тогда как in vivo его гемолитические эффекты ярко выражены. Возможно, это связано с его метаболизмом в печени. Однако метаболизм гидразина и его производных (ФГ) в организме животных и человека также до конца не изучен (Гидразин, 1991). На сегодняшний день известно лишь то, что в организм данные соединения могут проникать различными путями и их относительная токсичность, проявляющаяся в поражении центральной нервной системы, сердечно-сосудистой, нервной и кроветворной системы (М.Ф. Савченко и соавт., 1982), не зависит от способов поступления. Гидразин и его производные (ФГ) равномерно распределяются по органам и тканям. Наибольшее их содержание определяется в почках, печени и селезенке. Выведение веществ из этих органов протекает быстро. Например, спустя 24 ч после инъекции гидразина в дозе 30 мг/кг мышам (внутрибрюшинно) или 60 мг/кг крысам (подкожно) менее 15% вещества оставалось в этих тканях (S.D. Nelson, W.P. Gardon, 1982). Выведение из организма гидразина и его производных, а также их метаболитов происходит через почки и легкие (Жидкие ракетные топлива, 1991). Высказаны предположения о механизмах повреждения клетки гемолитиком: 1). происходит постепенная абсорбция и, следовательно, накопление токсического вещества на цитоплазматической мембране до его концентрации, способной вызвать разрушение мембраны; 2). токсическое вещество проходит через внешнюю мембрану, не повреждая ее, а, попав в цитоплазматическое пространство, вызывает структурные, метаболические или регуляторные нарушения (структурное повреждение внутренних мембран и органелл клетки; расстройство внутриклеточных процессов энергетического обеспечения; нарушение активности ферментных систем клетки; водно-электролитные сдвиги в цитоплазме; интенсификацию свободнорадикальных перекисных реакций в клетке; нарушение процессов внутриклеточной регуляции (на уровне цАМФ, цГМФ)), что через какой-то интервал времени приводит к аутолизу клетки (А.Х. Авакян, 1990; Н.И. Портянная и соавт., 1994; 1999). Данные гипотезы справедливы и для лейкоцитов крови. Анализ литературы показывает, что до настоящего времени отсутствуют эффективные методы лечения ГА при интоксикациях соединениями гидразина. Учитывая, что основную роль в организме играют продукты метаболизма ФГ, представляется целесообразным использовать с терапевтической целью средства ингибирующие пути биотрансформации ФГ, а также селективные акцепторы активных радикалов (супероксидные и его производные).
