Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Влияние низких температур внешней среды на функциональное состояние организма 8
1.1. Механизмы терморегуляции и мышечная деятельность ;... 9
1.2. Влияние гипотермии на нервную систему 16
1.3. Гормональный баланс в условиях гипотермии 19
1.4. Изменение обмена веществ в организме под влиянием гипотермии 24
1.5. Влияние низких температур на функцию пищеварения 28
1.6. Изменение функциональной активности дыхательной системы при охлаждении организма 29
1.7. Влияние гипотермии на систему кровобращения 35
1.8. Влияние гипотермии на систему крови и иммунную сиситему 42
1.9. Влияние алкоголя на организм 50
ГЛАВА 2. Организация и методы исследования ... 58
2.1. Организация эксперимента и характеристика модели исследования 58
2.2. Методы изучения основных этапов фагоцитарного процесса 58
2.3. Методы изучения реактивности лейкоцитов с использованием экспозиционных нагрузок 61
2.4. Методы статистической обработки 63
ГЛАВА 3. Материалы собственных исследований 64
3.1. Влияние низкой температуры на основные этапы фагоцитарного процесса 65
3.2. Осморегуляторные реакции лейкоцитов в условиях гипотермии 70
3.3. Геометрические и динамические характеристика лейкоцитов при деформации 76
3.4. Статистические взаимосвязи между полученными показателями 80
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 95
Выводы 110
Литература
- Влияние гипотермии на нервную систему
- Изменение функциональной активности дыхательной системы при охлаждении организма
- Методы изучения реактивности лейкоцитов с использованием экспозиционных нагрузок
- Геометрические и динамические характеристика лейкоцитов при деформации
Влияние гипотермии на нервную систему
Действие холода на организм обычно приводит к повышению активности метаболизма, необходимому для увеличения теплопродукции (Барба-раш Н.А., Двуреченская Г.Я., 1986). Причем изменения метаболизма наблюдаются на всех уровнях организации: клеточном, тканевом, органном, системном.
Острое действие холода стимулирует в тканях прежде всего метаболизм липидов. Об этом говорят полученные на людях данные о существенном (на 300 %) увеличении при действии холода концентрации в плазме крови свободных жирных кислот (Doi et. al.,I979; Jessen, 1980). Наряду с этим наблюдается и мобилизация углеводов (Augee, McDonald, 1973; Thibaulte et. aL, 1979; Le Blank, Labrie, 1981).
Сдвиги в углеводном обмене характеризуются увеличением в крови содержания пировиноградной и молочной кислот. Нарушения липидного обмена характеризуются развитием гиперхолестеринемии. Аналогичная картина наблюдается в отношении содержания в крови липопротеидов низкой и очень низкой плотности. Снижение температуры окружающей среды приводит к развитию гиперкетонемии. Наконец, нарушения белкового обмена характеризуются развитием гипоальбуминемии, увеличением содержания глобулинов в крови за счет всех фракций: аь а2, р и у (Василевский Н.Н. и др., 1980).
Варшавский Б.Я., Звездкин Е.Г., Скурятина Ю.В., Ельчанинова С.А. (2001) отмечают, что параллельно накоплению продуктов перекисного окисления липидов при действии холода растет и антиоксидантная активность липидов, в частности, увеличивается концентрация в ткани токоферола, участвующего в детоксикации свободных радикалов и гидроперекисей. На основе опытных данных был сделан вывод, что одним из условий успешного исхода адаптивных преобразований метаболизма при воздействии на организм холода являются достаточная обеспеченность токоферолом, а также комплексное возрастание активности основных антиоксидантных энзимов.
Одной из причин гибели животных в условиях гипотермии является нарушение деятельности сердечно-сосудистой системы. Определенное значение в данном случае, несомненно, имеет нарушение обменных процессов, в том числе и обмена липидов (Застенская И.А., 1989). Механизмы гипотермии у крыс сопряжены с существенными изменениями метаболизма липидов в ткани миокарда. Начальные этапы сопровождаются увеличением содержания общих липидов, общего и свободного холестерина, фосфатидилзтащі)ішмша и фосфатидилхолина и достоверным снижением содержания НЭЖКТнеэёте-рифицированных жирных кислот). Дальнейшее охлаждение животных до 25С приводит к снижению уровня НЭЖК и эфиров холестерина, а до 20С -к возрастанию количества общих липидов, холестерина, общих фосфорв?ри$ дов, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина и кардиолипина с Мщ$ временным уменьшением количества эфиров холестерина и глицеридов.яНан,.. экстремальном холодовом воздействии (ректальная Т=16С) содержэдщ глицеридов остается сниженным, а из всех остальных фракций повышается уровень кардиолипина.
Изучение липидного и углеводного обмена при влиянии низких темпе ч ратур Жихаревой А.И., Тажудиновой СИ. и Грачевой И.В.(1984) показало, что уже через 5 суток от начала охлаждения отмечалось резкое увеличение общего содержания фосфолипидов в основное за счет метаболически активных фракций: фосфатидные кислоты, кардиолипины, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. В этот же период отмечалось повышение содержания сахара в крови.
Анализ данных литературы позволил сделать важный вывод. Для поддержания температурного гомеостаза в условиях действия на гомойотермные организмы низкой температуры окружающей среды особое значение имеет перестройка тканевого метаболизма с преимущественным использованием НЭЖК в качестве энергетических субстратов. Несомненно, возросшая по 26 требность в теплопродукции может быть более эффективно обеспечена за счет окисления НЭЖК, а не углеводов. Кроме этого, использование НЭЖК в целях термогенеза сохраняет уровень глюкозы, необходимый для функционирования тех тканей, которые полностью зависят от нее как источника энергии (Алимова Е.К., Максименко В.А., Шепелев А.ГГ., 1973).
Многочисленные экспериментальные исследования и испытания с участием групп здоровых добровольцев доказали, что состояние энергопродупирующего обмена веществ в организме может являться лимитирующим фактором выживания в условиях гипотермии при пребывании в водной среде. В ходе исследований (Поваженко А.А., Ласточкин Г.И., Сороко СИ., Рыжова Т.И., Козырева Е.В., Целиковский В.А., 1997) установлено, что после окончания иммерсионной гипотермии у лиц с высокой устойчивостью к действию холода были отмечены признаки существенной активизации углеводного обмена, заключавшиеся в уменьшении концентрации глюкозы крови в сочетании с увеличением содержания интермедиатов катаболизма. У них также отмечено двукратное возрастание содержания в крови липидов, свободных жирных кислот и липазной активности, что свидетельствует о выраженной активизации липолиза и мобилизации депонированных жировых источников энергии. У лиц, не тренированных к условиям иммерсионной гипотермии углеводный обмен имел тенденцию к угнетению, что проявилось повышением уровня глюкозы и уменьшением содержания пировиноградиой кислоты в крови. Активизация липидного обмена была у них минимальной.
Интенсивность метаболизма зависит от влияния на него ферментов, которые являются катализаторами протекающих в организме биохимических процессов. При глубокой гипотермии наблюдается неравномерное торможение или нарушение функций некоторых ферментов, что влечет за собой нарушение гармоничного затухания метаболизма. Известно также, что охлаждение значительно снижает активность окислительно-восстановительных ферментов, в частности, лактиодегидрогеназы и аспартиокоаминоферазы (Василевский Н.Н. и др., 1980). Липиды, особенно жирные кислоты, называют молекулами адаптации.
Как при кратковременном действии холода, так и при холодовой адаптации заметна тенденция к увеличению уровня ненасыщенных жирно-кислотных компонентов фосфолипидов (Баженов Ю.И., Горбачева Л.Р., Ритов В.Б., 1998). Так Гудков А.Б. и Теддер Ю.Р. (1999) изучая роль липопротеидов в холодовой адаптации человека, выявили снижение в крови липидов (при неизменном содержании глюкозы) за счет уменьшения фракции р-липопротеидов (р 0,01). По их мнению это может указывать на ослабление роли углеводов и повышение роли жиров в энергетическом обеспечении мышечной системы.
Агаджанян Н.А., Ермакова Н.В. (1997) показывают, что стойкая адаптация наступает благодаря изменениям в ферментативных антиоксидазных системах. Речь идет, прежде всего, об усилении липидного обмена. У людей, живущих на Севере, повышено содержание в крови жирных кислот. За счет усиления «глубинного» кровотока при сужении периферических сосудов жирные кислоты более активно вымываются из жировой ткани.
Согласно существующим представлениям (Ручкина А.С, Савицкий В.И., 1976), характер действия переохлаждения на динамику обменных реакций в большей мере определяется состоянием нейро-эндокринной системы. Среди факторов гормональной регуляции поддержания резистентности организма к действию холода важная роль принадлежит кортикостероидам и ка-техоламинам, оказывающим существенное влияние на углеводно-фосфорный и белковый обмен и обуславливающим тем самым интенсивность и направленность окислительно-восстановительных, биоэнергетических и компенсаторных процессов.
Изменение функциональной активности дыхательной системы при охлаждении организма
Изучение влияния низких температур на функциональную активность лейкоцитов крови проводилось на 36 белых крысах - самцах с массой тела 470 - 520 грамм. Все животные были поделены на 3 группы: одна контрольная и две экспериментальные.
Животных первой экспериментальной группы охлаждали в воде при температуре 15С до появления признаков холодового паралича физиологических функций. Животным второй экспериментальной группы за 20 мин. до охлаждения вводили через желудочный зонд 30%-ный раствор этилового спирта (І мл на ЮОг массы животного).
Наступление холодового паралича определялось замедлением, а затем и нарушением координации плавательных движений, появлением тонических судорог и погружением на дно аквариума (Арокина Н.К., 2001; Иванов К.П.,2001).
Дня оценки состояния терморегуляции измеряли температуру тела животных в прямой кишке на глубине 3 см посредством электротермометра. Измерения производили у всех крыс экспериментальных групп в начале и конце опыта.
Кровь для исследований брали путем декапитации у предварительно наркотизированных эфиром животных. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в количестве 10 ед/мл. Полученную кровь центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Удаляли верхний слой плазмы. Собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами и лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония. Клетки дважды от 59 мывали изотоничным буферным раствором с рН=7,4 (раствор Дульбекко).
Отмытые клетки ресуспендировали итгодсчйтывалй их концентрацию в камере Горяева.
Одним из наиболее распространенных методов изучения локомоцион ной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов является тест-система миграции под агарозой. Нами был использован модифицированный вариант изучения самопроизвольной и хемокинетической локомоционной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов. За основу взят классический метод, описанный в многочисленных работах (Дуглас С.Д., Куй П.Г., 1983; Соколова Т.Ф., Редькин Ю.В., 1983; Безноселко С.А., Барсуков А.А., Земсков В.М., 1984; Изучение функционального состояния фагоцитов человека, 1988; Мац-нер Я., 1993; Федорова М.З., Левин В.Н., 2001; Nelson R.D., Quie P.G., Simmons R.L., 1975; Leukocyte Chemotaxis, 1978). Агарозу с добавлением клеточной культуральной среды 199 на растворе Эрла с рН 7,6 наслаивали на предметные стекла. В застывшем агаровом геле с помощью пробойника вырезали лунки диаметром 2,5 мм, в которые помещали суспензию лейкоцитов (7-Ю х 105 клеток). Стекла инкубировали в камере при температуре 37С в атмосфере воздуха с 5% содержанием СОг в течение 2 часов, затем погружали в 2% раствор глутарового альдегида на 60 мин. После фиксации и удаления агарозы клетки окрашивали азур-эозином по Романовскому.
С целью оценки изменений содержания в плазме крови веществ, обладающих стимулирующим и ингибирующим хемотаксическим действием, в качестве хемоаттрактанта применяли аутологичную плазму. Самопроизвольные локомоции оценивали по миграции лейкоцитов из одиночной лунки; индуцированную миграцию - по распространению клеток из лунки, находящейся в паре со второй, содержащей аутоплазму.
Для получения более точной информации о локомоционной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов измеряли не путь, а площадь распростра 60 нения клеток. Кроме того, рассчитывали хемотаксический дифференциал отношение площади индуцированной миграции по сравнению со спонтанной к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции (%).
Площадь миграции под агарозой измеряли с помощью дипроектора «Свитязь», снабженного объективом х12, дающим приблизительно 40-кратное увеличение. Картина проецировалась на экран и переносилась на миллиметровую бумагу, по которой высчитывали в см2 площадь распространения лейкоцитов. Зная истинную площадь лунки, рассчитывали площадь миграции лейкоцитов на стекле.
Для изучения адгезионных свойств лейкоцитов нами был выбран способ, описанный Mege IX. et al. (1989), позволяющий оценивать силу сцепления клеток с подложкой. 40 мкл суспензии лейкоцитов помещали в толстостенный капилляр с внутренним диаметром 0,56 мм. Клетки инкубировали во влажной камере при 37С в течение 60 мин. Затем капилляр перфорировали раствором Дульбекко при напряжении сдвига 0,1 Н/м2 и повторно 30 Н/м . Указанные величины были выбраны с учетом напряжения сдвига на стенке кровеносных сосудов в естественных условиях кровотока. Подсчитывали число клеток в исходной суспензии, а также первом (неадгезировавшие и имеющие малые силы сцепления клетки) и втором (клетки со средней силой сцепления) смывах. Рассчитывали число клеток, оставшихся в капилляре (клетки с большой силой сцепления).
Методы изучения реактивности лейкоцитов с использованием экспозиционных нагрузок
Примечания: деформационные изменения лимфоцитов происходили при аспирации клеток в микрокапилляр с приложением отрицательного гидростатического давления; гипоосмотическое набухание регистрировали при 60-секундной инкубации клеток в 0,2% растворе хлорида натрия с последующей фиксацией глутаровым альдегидом. Звездочкой отмечены величины, достоверно отличающиеся от исходного состояния по критерию Стьюдеита (р 0,05 + 0,01).
В неблагоприятных для жизнедеятельности организма условиях, в частности при воздействии стрессорных факторов, для оценки морфофункцио-нального статуса той или иной системы целесообразно использовать, наряду с изменениями абсолютных величин, анализ структуры корреляционных отношений. Корреляционные отношения позволяют оценить причинно-следственную зависимость процессов, происходящих в различных звеньях биосистемы, а также показать сходство временной организации этих процессов. Для показателей функциональной активности лейкоцитов животных контрольной группы характерно большое число статистических взаимосвязей. Среди них есть и внутригрупповые, и межгрупповые связи (табл. 11). Прослеживается четкая взаимосвязь числа неадгезировавших клеток и числа клеток, обладающих способностью к адгезии. Также существует взаимосвязь между хемотаксическим дифференциалом и площадью распространения клеток в присутствии аутоплазмы.
Важным центром корреляционных отношений у контрольных животных является показатель адгезионной способности (рис. 9). Доля неадгезировавших клеток имеет отрицательные связи с долей клеток, имеющих большую силу сцепления и объемным изменением клеток в гипоосмотической среде после часовой инкубации. В то же время доля неадгезировавших клеток имеет положительную связь с долей клеток, имеющих малую силу сцепления. Увеличение объема клеток в гипоосматической среде происходит одновременно с ростом количества фагоцитирующих клеток.
Внешнее холодовое воздействие на организм животных приводит к появлению новых связей. При этом изменяется не только их число, но и структура (табл. 12). В структуре корреляционной решетки параметры, характеризующие поглотительную способность клеток. Важным центром связи по-прежнему остается число неадгезировавших клеток. Особая роль принадлежит хемотоксйческому дифференциалу, который иммеет положительную связь с площадью распространения клеток при стимулированной миграции и отрицательную связь с площадью распространения клеток при спонтанной миграции (рис. 10). Отмеченный в контрольной группе параллелизм в изменениях показателей сопротивляемости лейкоцитов среде с низкой осмоляр-ностью, в данном случае нашел отражение в виде наличия положительных корреляций между параметрами клеток в гипоосмотической среде и числом клеток, проявляющих способность к адгезии (рис. 11).
Во второй экспериментальной группе корреляционные отношения выглядят по-другому (табл. 13), в отличие от первой экспериментальной груп 82 пы. Следует отметить, что центром корреляционных связей по-прежнему остается способность клеток к адгезии. В данной группе регистрируются в основном те же связи, что и в контрольной группе (рис. 12). Но число их уменьшилось. Сходство с первой экспериментальной группой состоит в том, что здесь имеется отрицательная связь между хемотаксическим дифференциалом и площадью распространения клеток при спонтанной миграции.
Анализ изменений корреляционных отношений на разных этапах эксперимента показывает, что в условиях гипотермии появляются отсутствовавшие у контрольных животных связи между показателями функциональной активности лейкоцитов. Появление этих отношений является признаком напряжения системы неспецифической защиты. Перестройка отношений во второй экспериментальной группе с возвращением показателей к исходным взаимоотношениям отражает, вероятно, проявление компенсаторных реакций.
Геометрические и динамические характеристика лейкоцитов при деформации
Данных по совместному действию охлаждения и алкоголя на поглотительную способность лейкоцитов нам не встретилось. Однако, есть данные о том, что введение крысам алкоголя вызывало статистически достоверное снижение фагоцитарного индекса нейтрофильных гранулоцитов. При этом изменения фагоцитарного показателя не были существенными (Мельников О.Ф., Веремеенко К.Н., Тимченко СВ. и др., 1989). Установлено, что некоторые виды стрессового воздействия, в том числе и холод, уменьшают концентрацию эндогенного этанола у лабораторных животных. Под влиянием холода концентрация эндогенного этанола уменьшается в несколько раз по сравнению с его концентрацией до стрессового воздействия (Ушакова М.М. с соавт., 1988).
Самые неблагоприятные изменения защитных функций организма происходят в начальный период адаптации. В это время развиваются дисфункции, в механизме возникновения которых ведущее значение имеет нарушение фагоцитарной и бактерицидной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеарной фагоцитирующей системы (Новиков B.C., 1996).
По данным литературы (Земсков A.M. с соавт., 1997) естественная резистентность включает, как минимум, два механизма. Первый обусловлен механическими и биологическими барьерами, нормальной микрофлорой, ферментативными системами клеток, специфическими белками крови, фагоцитами и т. д. Второй механизм индуцирует при парентеральном или перо-ральном введении в организм чужеродной сыворотки, солевых растворов, высоко - и низкомолекулярных нуклеиновых кислот и др., приводящих к формированию повышенной неспецифической устойчивости к патогенным агентам разной природы. Главным компонентом в этом случае являются фагоцитарные клетки. Естественным механизмам присущи и элементы специфичности (Земсков A.M. и соавт., 1997). Так Фомичева Е.Е. и Рыбакина Е.Г. (1998) отмечают, что определенные виды стресса (холод, плавание и холодной воде, комбинированный стресс и др.) вызывают выраженную иммуносу-прессию, в формировании которой принимают участие различные субпопуляции иммунокомпетентных клеток. Считается, что за феномен иммуносу-прессии в основном ответственны Т - лимфоциты. Физиологическая функция этих клеток заключается в торможении (ограничении) величины иммунного ответа.
Выявленные в нашем исследовании изменения поглотительной способности относятся к неспецифическим реакциям защиты фагоцитирующих клеток, так как частицы латекса, используемые нами в опытах, не являются антигенными и могут поглощаться нейтрофилами при отсутствии опсонинов (Потапова С-Г. с соавт., 1977).
Нейтрофилы выполняют фагоцитарную функцию как в крови, так и за пределами кровеносного русла. Для осуществления данной функции клетки должны путем черезэндотелиальнои миграции покинуть кровоток. Часть из них движется вдоль сосудистой стенки и иногда адгезируется к ней. Другая часть мигрирует через эндотелий. Таким образом, адгезия нейтрофилов является необходимой в процессе черезэндотелиального транспорта и фагоцитоза (Редчиц Е.Г., Гузеева О.В., 1991).
Отмечается, что перемещение нейтрофилов происходит посредством образующегося на переднем конце движущейся клетки распластанного гиа-лоплазмэтического выпячивания - ламеллоподии, или «вуали»: в него переливается жидкая зернистая цитоплазма тела лейкоцита. Ламеллоподии образуются беспорядочно на различных краях клетки, но способность передвигать клетку приобретает только та ламеллоподия, которая вступила в контакт с субстратом (Галкин А.А., 1997).
В отсутствие аттрактанта цитоплазма перетекает внутрь ламеллоподий произвольно, часто образуются полиплоидальные формы нейтрофилов, а движение имеет характер случайного блуждания. При направленном движении, в случае хемотаксиса, цитоплазма клетки перетекает преимущественно в ламеллоподию, обращенную к аттрактанту.
Оценка миграционной активности нейтрофилов показала, что аутоло-гичная плазма оказывает слабое действие на локомоции клеток у интактных животных и у животных, подвергшихся охлаждению. Но влияние аутоплаз-мы возрастает в том случае, когда животных не только подвергают охлаждению, но и дополнительно дают им алкоголь. В условиях сочетания охлаждения с дачей алкоголя наблюдается значительный прирост площади миграции клеток. Можно предположить, что охлаждение организма не влияет на миграционную активность лейкоцитов, а активизирующий эффект, вызванный приемом умеренных доз алкоголя до начала охлаждения связан, скорее всего, с гуморальными сдвигами, опосредуемыми этиловым спиртом.
В опытах на животных показано, что этанол нарушает метаболизм различных нейромедиаторов: дофамина, норадреналина, серотонина, ГАМК. Алкоголь увеличивает содержание в крови глюкокортикоидов (Степанен-ко Г.Д., Чотоев Ж.А., 1986). А как известно, повышение уровня глюкокортикоидов в крови - главное составляющее сложных нейрогормональных сдвигов при действии стрессорных раздражителей (Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1985), влияющих, в том числе, и на локомоторные реакции белых клеток крови. Функциональная активность Т- лимфоцитов может изменяться в условиях повышения уровня глюкокортикоидных гормонов в крови, инициированного стрессом (Фомичева Е.Е., Рыбакина Е.Г., 1998).
Лейкоциты способны формировать отростки спонтанно будучи сус-пендированнными в плазме или физиологических растворах. Формирование отростков представляет активный процесс, так как движущая сила и энергия заложены внутри самой клетки. Второй фазой локомоции является прикрепление отростков к субстрату (Галкин А.А., 1997). Поэтому при оценке адге 101 зионной активности учитываются два ряда явлений: 1) прочность физического контакта между клетками и матриксом; 2) распластывание лейкоцитов на подложке, что затрудняет их удаление с субстрата (Редчиц Е.Г., Гузеева О.В., 1991).
В наших опытах показано, что охлаждение существенно влияет на адгезионные способности лейкоцитов. Так, при охлаждении животных адгезионная способность лейкоцитов достоверно снижалась преимущественно за счет клеток с большой силой сцепления. Сочетание охлаждения с введением алкоголя приводило к возвращению числа адгезировавших клеток к уровню контрольных животных. Стабилизирующий эффект в данном случае связан, как указывалось выше, с гуморальными сдвигами, опосредуемыми этиловым спиртом.
Стоит учесть также, что используемые в эксперименте дозы вводимого этилового спирта (1 мл 30%-ного спиртового раствора на 100г массы животного) считаются малыми (Рзаев М.Н., Мурсалиев A.M., 1974; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996).
Относительно употребления алкоголя в больших дозах, в литературе описаны грубые дистрофические и деструктивные изменения железистых элементов коры надпочечников, дистония и кровоизлияние, свидетельствующие о значительном повреждении морфологических структур надпочечников под влиянием алкогольной интоксикации, что обуславливает в свою очередь эндокринопатию надпочечных -желез и снижение адаптационных компенсаторных реакций организма (Сидоров П.И. с соавт., 2000). Вместе с тем исчезновение аскорбиновой кислоты и снижение окраски на липиды в корковом слое надпочечников подтверждает усиленный выброс гормонов (Казанцева ГЛ., 1976).
