Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Современное состояние проблемы введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при температуре -20С
1.1. Функциональные свойства лейкоцитов 12
1.2. Методы получения лейкоцитного концентрата и его применение 19
1.3.Сроки хранения лейкоцитов при различных температурах 22
1.4. Концепции и теории криоповреждения и криозащиты плазматических мембран 23
1.5. Криопротекторы и криоконсерванты, используемые при замораживании лейкоцитов 31
1.6. Методы криоконсервирования лейкоцитов 40
Глава II. Материалы и методы исследований 47
Глава III. Результаты экспериментальных исследований
3.1. Разработка метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при-20С 54
3.1.1. Применение экспоненциальной программы для замораживания лейкоцитов до-20С. 54
3.1.2. Выбор оптимального состава хладоограждающего раствора 55
3.1.3. Изучение влияния длительности хранения применяемого хладоограждающего раствора на сохранение его криозащитных свойств... 61
3.2. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека до введения в холодовой анабиоз (-20 С) и после выхода из него 62
3.2.1. Действие криозащитного раствора на сохранность лейкоцитов 62
3.2.2. Определение оптимального срока хранения лейкоцитов 65
3.2.3. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека при оптимальном сроке хранения с разными вариантами хладоограждающего раствора 75
3.3. Изучение биологических особенностей разработанного хладоограждающего раствора для лейкоцитов 78
3.3.1. Изучение «острой токсичности» хладоограждающего раствора. 78
3.3.2. Изучение «хронической токсичности» хладоограждающего раствора 79
3.3.3. Изучение пирогенности хладоограждающего раствора 85
3.3.4. Изучение переносимости экспериментальными животными трансфузий концентрата лейкоцитов, замороженных с разработанным хладоограждающим раствором 85
Глава IV. Обсуждение результатов экспериментальных исследований 88
Выводы 99
Список использованной литературы 101
Список опубликованных работ по теме диссертации 121
- Методы получения лейкоцитного концентрата и его применение
- Методы криоконсервирования лейкоцитов
- Выбор оптимального состава хладоограждающего раствора
- Изучение «хронической токсичности» хладоограждающего раствора
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время многими исследователями (Zhang Q., Tiersch T,R., 1995; Svedentsov E.P. et al., 1998; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001; Сведенцов ЕЛ. и соавт., 2000, 2003, 2004;Осташко В.Ф., Осташко Ф.И., 2004; Смольянинова Е.И.и соавт., 2004) активно изучаются механизмы криоповреждения и криозащиты клеток животного происхождения. Большое внимание уделяется изучению физиологии клеток крови после воздействия различных стресс-факторов, в том числе отрицательных температур (Терентьева Э.И. и соавт., 1966; Цуцаева А.А. и соавт., 2004). Ядерные клетки крови обладают сложной внутренней
^ организацией, повышенными процессами метаболизма и являются весьма
неустойчивыми к. действию факторов холодового стресса (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). Необходимость исследования физиологических свойств белых клеток крови человека и разработки способов сохранения их в
і^ биологически полноценном состоянии, прежде всего, связана с расширением
показаний к применению лейкоцитных концентратов (ЛК). Трансфузии ЛК являются эффективным средством профилактики и лечения инфекционного менингита, разлитого перитонита, сепсиса, лучевой болезни и других заболеваний (Ермолович СВ., 1981; Рыжков СВ. и соавт., 1992, 1995; Мельникова В.Н. и соавт., 1993; Cairo M.S. et. al., 1992; Bhatia S. et. al., 1994; Ханевич М.Д., Маринин A.B., 1995; Мирошниченко А.Г. и соавт., 1996; Neppert J., 1996; Herzog R., 1999; Балашов Д.Н., 2001).
На протяжении многих лет (Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С и соавт., 1978; Ермолович СВ., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов СВ. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004) ведется поиск оптимальных методов замораживания и хранения лейкоцитов в состоянии холодового анабиоза. Накопленный опыт
свидетельствует о том, что сохранить в биологически полноценном
состоянии лейкоциты при положительной температуре (+4С) можно до 24
часов (Цуцаева А.А., 1983), при температуре от 0С до -4С - до 48 часов
* (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), при -5С в условиях гипербарии (при
400 атм) - до 3 недель (Павленко Р.А. и соавт., 1988), при -60С -^-80С - до 12 месяцев (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов СВ., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001), а при -196C - в среднем до 20 месяцев (Лобынцева Г.С. и соавт., 1974; Пушкарь Н.С и соавт., 1974; Аграненко В.А. и соавт, 1982, 1997).
Анализ данных литературы позволяет заключить, что существующие методы замораживания до -196С и хранение при данной температуре, хотя и являются наиболее результативными, но в тоже время требуют применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота и привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой и экономически неэффективной, существенно затрудняет ее использование в
1 криобиологической практике.
Поэтому весьма актуальным является создание простого, эффективного и экономичного метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз без использования жидкоазотной технологии при других температурах, в том числе субумеренно-низких (-150О-28С), тем более, что в отечественной и зарубежной литературе метод сохранения лейкоцитов в функционально полноценном состоянии при температуре -20С не описан.
Для защиты различных клеток организма от неблагоприятного
^ воздействия холодового стресса используют различные криопротекторы:
глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО) и другие, которые не являются абсолютно безвредными для организма и требуют удаления перед их применением с помощью отмывания (Аграненко В,А., Тибилова Н.Н.,1997).
л Менее токсичный криопротектор диметилацетамид (ДМАЦ) в нашей стране
не производится. Поэтому необходима разработка нетоксичного, эффективного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора. С другой стороны, для сохранения функциональной активности клеток
^ требуется применение щадящей и нетрудоемкой программы охлаждения.
Данным условиям отвечает экспоненциальная программа замораживания (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994).
Таким образом, для изучения физиологических особенностей лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20 С, актуальной остается разработка технологии замораживания и хранения их в условиях субумеренно-низких температур.
Разработка данного метода сохранения лейкоцитов в полноценном состоянии имеет и большое теоретическое значение, так как касается'
* высоко дифференцированных со сложными функциями клеток организма.
Выяснение условий введения таких клеток в холодовой анабиоз при данной температуре и выведения из него создаст теоретическую основу для разработки подобных методов в отношении высокоорганизованных клеток и
^ тканей организма млекопитающих и человека.
Цель исследования - определить функциональную активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -20С, достигнутый применением экспоненциальной программы охлаждения и нового криозащитного раствора.
Задачи исследования:
1. С целью выбора оптимального хладоограждающего раствора провести
, v сравнительную характеристику влияния трех вариантов растворов (№№
1,2, 3) на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных ло экспоненциальной программе до -20С и хранившихся в условиях холодового анабиоза в течение 24 часов
(*>
2. Изучить жизнеспособность и морфологический состав лейкоцитов,
фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и моноцитов,
перенесших криоанабиоз (-20 С) продолжительностью 1-90 суток под
ф защитой оптимального варианта хладоограждающего раствора.
3. Оценить в опытах на животных острую и хроническую токсичность и
пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и установить
переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов после их
хранения в течение 1 суток при -20С.
Научная новизна. R лабораторно-экспериментальном исследовании
впервые изучены функциональные и морфологические свойства лейкоцитов,
вышедших из холодового анабиоза при -20С, достигнутого с
использованием оригинального хладоограждающего раствора и
экспоненциальной программы замораживания, показано, что в этих условиях
сохранить фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов, целостность
плазматической мембраны лейкоцитов, стабильность их морфологического
^ состава и их общее количество на высоком уровне возможно в течение 21
суток.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы
расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты
лейкоцитов крови человека, в том числе о высокой жизнеспособности
лейкоцитов в условиях применения гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины
(ГМБТОЭМ) и оксиметилэтилпиридипа сукцината (ОМЭПС) при -20С.
v Дано научное обоснование криозащитных свойств разработанного
хладоограждающего раствора, ингредиентами которого являются вещества отечественного производства - криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ и мембраностабилизирующее и антиоксидантное вещество -ОМЭПС. На данный раствор получен патент на изобретение № 2240000
і-
(РФ) от 20.11.2004 года. Кроме того, в опытах на экспериментальных животных доказана безвредность этого раствора на клеточном и организменном уровнях. Для высокой функциональной и морфологической
ф сохранности лейкоцитов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу
при-20С, предложен эффективный недорогостоящий и доступный метод, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы охлаждения, быстрого отогрева. Доказано, что применение экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов обеспечивает высокую эффективность криокоисервировааия и является более предпочтительной, т.к. она значительно сокращает продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания, подходит для взвеси, содержащей разные популяции клеток. Установлено, что для осуществления
'> данной процедуры замораживания не требуется применение дорогостоящей
жидкоазотной технологии, возможно использование электрического морозильника для осуществления экспоненциальной программы и не требуется высокой квалификации обслуживающего персонала. На основе
^ данных об отсутствии пирогенности, острой и хронической токсичности
оригинального хладоограждающего раствора, о полноценной
морфофункциональной сохранности замороженных с ним клеток дано заключение о возможности и безопасности внедрения его в работу научных лабораторий и криобиологическую практику.
Основные положения, выносимые на защиту:
Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, введенных в холодовой анабиоз при —20С, сохраняются на высоком уровне в течение 21 суток.
Хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ и ОМЭПС, и являясь нетоксичным, апирогенным, не требующим отмывания после
(tf
оттаивания биообъекта, способствует сохранению функциональной
активности лейкоцитов, подвергнутых криоанабиозу при -20 С.
3. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз
ф способствует сохранению их жизнеспособности и потому наряду с
разработанным хладоограждающим раствором может использоваться для замораживания лейкоцитов при температуре -20С.
Апробация работы. Результаты работы доложены па Всероссийской
научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического
мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), на заседании
Кировского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова
(Киров, 2004), на научной сессии Кировского филиала Российской Академии
> Естествознания (Киров, 2004), Ученом Совете Института физиологии Коми
ЬЩ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), Международной конференции
«Сохранение генетических ресурсов» (Санкт- Петербург, 2004), заседании
Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов
** (Киров, 2005).
Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных свойств нативных и размороженных лейкоцитов и проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -20С,.в проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в центральной печати; имеется 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122
машинописных страницах, состоит из «Введения», четырех глав (обзор
литературы, материалы и методы исследований, результаты
экспериментальных исследований, обсуждение результатов
экспериментальных исследований), «Выводов», «Списка использованной литературы» (203 источника, в т.ч. 70 зарубежных авторов), «Списка работ, опубликованных по теме диссертации». Диссертация содержит 28 таблиц, 13 рисунков.
Методы получения лейкоцитного концентрата и его применение
В клинической практике применяют лейкоцитные концентраты. Они содержат лейкоциты периферической крови (10-15хЮ9 лейкоцитов в 300-400 мл среды) с примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы.
Существуют различные методы получения лейкоцитного концентрата (Гусейнов И.С, Федорова Л.И., 1963; Леонтович В.Л. и др., 1971; Калинин И.Н., 1978,1980): - снятием лейкоцитной пленки, остающейся над эритроцитами после отделения плазмы при спонтанном оседании эритроцитов; - сбором из флаконов плазмы, обогащенной лейкоцитами после спонтанного оседания эритроцитов; - ускоренным осаждением эритроцитов с применением коллоидных осадителеи и получением плазмы, обогащенной лейкоцитами; - выделением из крови лимфоцитов и гранулоцитов путем центрифугирования и спонтанного расслоения (Леонтович В.А. и соавт., 1971); - выделением лейкоконцентрата путем седиментации форменных элементов - метод с гепарином (Козиыец Г.И., 1997, 1998). Таким способом от одного донора получают 2-6х109 лейкоцитов в объеме до 250 мл с плазмой и незначительной примесью эритроцитов и тромбоцитов (Утемов СВ., 1995). В настоящее время все чаще применяют аппаратные методы выделения клеток. Среди них различают лейкоцитаферез на сепараторах и фракционаторах крови с непрерывным и прерывистым током крови. К аппаратным методам относят и фильтрационный лейкоцитаферез с пропусканием гепаринизированной крови через специальные фильтры (нейлон, дакрон и другие), задерживающие лейкоциты. Такими способами получают 20х109-40хЮ9 клеток в лейкоконцентрате (Сведенцов Е.П., 1999). В РНИИГТ были предложены методы получения лейкоцитной взвеси путем повторного двойного и тройного лейко цитаферезов с применением контейнеров «Гемакон-500/300», «Компопласт-300», лабораторных центрифуг К-70 или ЦЛ-4000. При двойном лейкоцитаферезе от донора получают 200 мл лейкоцитной взвеси, содержащей до 4,0x109 лейкоцитов. В тройном лейкоцитаферезе получают 300 мл взвеси, содержащей до 6,0х109 лейкоцитов. В лейкоцитной взвеси, заготовленной приведенным методом, содержатся 47% неитрофильных гранулоцитов, 5% моноцитов и 43% лимфоцитов. За рубежом применяют аппаратный лейкаферез с использованием центрифужных сепараторов непрерывного («Amico», IMB-2997, «Fenwal-3000») и прерывистого («Hemonetics-30», «Hemonetics-50» и др.) потока. Получают концентраты лейкоцитов, содержащие от 14,0х109 до 24,0x109 лейкоцитов, среди которых гранулоцити составляют 70% (Шевченко Ю.Л. и соавт., 2003). Показания к применению лейкоконцентрата: - лейкоцитопения, когда количество лейкоцитных клеток в периферической крови больного менее 1,5х109/л, при различных патологических состояниях с угрозой развития или развивающимися инфекционными осложнениями; - гипо- и апластические состояния кроветворения, медикаментозные агранулоцитозы; - тяжелый сепсис, онкологические и гематологические заболевания с резким угнетением лейкопоэза в результате применения химио- и лучевой терапии (Заривчацкий М.Ф.Д995); - токсическая и терминальная фазы разлитого перитонита с выраженными признаками иммунодефицита (Ханевич М.Д., Маринин А.В., 1995; Рыжков СВ. и соавт., 1995); - гнойные заболевания плевры и легких, обширные глубокие ожоги в стадии генерализации инфекционного процесса с признаками иммунодефицита тяжелой степени и при неэффективности проводимого лечения (Мельникова В.Н, и соавт., 1993); - нейтропения и выраженный сепсис у новорожденных (Cairo M.S. и соавт., 1992;NeppertJ., 1996); - лечебные трансфузии донорских гранулоцитов у детей с нейтропенией (Балашов Д.Н., 2001). Абсолютными противопоказаниями к применению леикоконцентрата служат свежие тромбозы и эмболии различного генеза, тяжелые аллергические реакции и острые нарушения мозгового кровообращения. Переливание леикоконцентрата относительно противопоказано при тяжелых формах сердечной недостаточности, инфаркте миокарда, гипертоническом кризе. Так же противопоказаниями являются: наличие антилейкоцитарных тел у больного и невозможность подобрать совместимый концентрат лейкоцитов по системе HLA; концентраты лейкоцитов, заготовленные от больных хроническим миелолейкозом. Не имеет смысла переливать концентрат лейкоцитов, в котором число лейкоцитов не соответствует лечебной дозе или лейкоциты нежизнеспособны (Сведенцов Е.П., 1999).
Критерием эффективности трансфузий концентрата лейкоцитов является повышение эффективности проводимой антибактериальной терапии и снижение активности воспалительного процесса при одновременном увеличении числа лейкоцитов в периферической крови (Заривчацкий М.Ф., 1995).
Методы криоконсервирования лейкоцитов
Криоконсервантами называют многокомпонентные системы, в состав которых входят криопротекторы и различные многофункциональные соединения, выполняющие мембраностабилизирующую, антиоксидантную и антиокислительную роль. В состав криозащитных растворов включают активаторы метаболизма и восстановления. Такие смеси часто готовят на основе стандартных сбалансированных сред (Рингера, Дюльбекко, среды 199, Альсевера, Рингер-Локка, Коллинза, Хенкса, Игла и др.) для урегулирования осмотических и других процессов, способствующих сохранению структурно-функциональных свойств плазматических мембран.
Состав консервантов вариабелен, так как различные по своей природе клетки по-разному переносят замораживание в такого рода сложных средах. Например, разработана методика консервации гранулоцитов при -196С под защитой лейкокриодмаца. Этот препарат разработан в ГНЦ РАМН (Трошина В.М. и соавт., 1977; Аграненко В.А., Тибилова Н,Н.,1997). Состав консерванта следующий: диметилацетамид - 20,0 мл; глюкоза - 20,0 г; динатриевая соль диаминтетрауксусной кислоты ЭДТА Na2 - 0,4 г; вода для инъекций - до 1 л; рН 4,5-5,5. Лейкокриодмац предназначен для замораживания и длительного хранения в жидком азоте при ультранизкой температуре (-196С) лейкоцитов крови с целью их последующего клинического применения. Прозрачная, бесцветная или слегка желтоватая жидкость. Срок хранения препарата при комнатной температуре в защищенном от света месте 2 года.
В ГУ Кировском НИИ гематологии и переливания крови на основе криопротектора ГМБТОЭМ был разработан новый криоконсервирующий раствор для лейкоцитов (Сведенцов Е.П. и соавт., 2Q02). Криоконсервант содержит в конечной концентрации: криопротектор ГМБТОЭМ - 15 %, лимонную кислоту - 0,03 %, антигипоксант (фумарат натрия) - 1,4 % и бидистиллированную воду - остальное. Хладоограждающий раствор предназначен для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (Сведенцов Е.П. и соавт., 2003), при которой эти клетки сохраняют свои морфологические и функциональные свойства. Криозащитный раствор еще требует углубленного исследования при различных температурных режимах замораживания и различных сроках хранения.
В состав консервантов часто вводят сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу или рафинозу и их комбинации, Обязательным требованием при создании консервантов является их гипертоничность, так как такие растворы хорошо и быстро уравновешивают осмотическое давление, особенно после диффузии глицерина в клетки. Сахара являются соединениями, регулирующими осмотические и метаболические процессы в клетках, способствуя тем самым более эффективной репарации нарушенных структур клеток крови в цикле замораживания отогрева. Кроме того, в раствор для замораживания вводится какой - либо антикоагулянт (ЭДТА Na2, ацетат натрия, цитрат натрия и др.), так как при хранении in vitro клетки приобретают способность образовывать необратимые агломераты. В состав консервантов часто вводят предшественников нуклеиновых кислот (инозит, аденин) в комбинации с фосфатами и глюкозой, которые служат веществами, способствующими активации восстановительных процессов. Комплексные среды, активирующие процессы восстановления поврежденных мембранных и метаболических систем клетки после замораживания - отогрева, получили название реставрирующих.
Таким образом, в криозащитные растворы для различных клеток вводят разнообразные по составу вещества как криопротекторы, так и другие мембранотропные вещества, биокатионьт, метаболиты, позволяющие улучшать состояние физиологических и метаболических систем клеток, подвергнутых замораживанию и отогреву. При разработке метода криоконсервирования клеточных суспензий важно учитывать способность хладоограждающего раствора стабилизировать фракции вне- и внутриклеточной воды, продолжительность экспозиции криозащитной среде до начала охлаждения, скорость и программу введения биообъекта в состояние ходового анабиоза и способ размораживания. Для введения лейкоцитов в холодовой анабиоз используют ряд методов. tf Н. Н, Абезгауз и В.А. Леонтович (1966) предлагают следующие ограждающие растворы: 15% глицерин, 15 % ДМСО, 20 % ПВП. В любом случае с каждым из этих криопротекторов вводили в раствор сахарозу или лактозу, глюкозу и ЭДТА Na2. Перед замораживанием лейкоциты, взвешенные в плазме, смешивали с равным объемом одного из названных ограждающих растворов. Использовался термоизолированный сосуд с налитым в него этиловым спиртом, который постепенно охлаждали: вначале путем периодического опускания в него металлического цилиндра с сухой углекислотой, затем (по достижении отрицательной температуры) применяли цилиндр с отверстиями, который обеспечивает соприкосновение сухого льда со спиртом и дальнейшее снижение температуры. Быстрого снижения температуры (порядка 10С в 1 мин) удается достичь, если насыпать лед непосредственно в спирт. Такая установка удобна для экспериментальных исследований при замораживании небольших объемов (до 10 мл) лейкоцитной массы. Для замораживания больших объемов используют специальные машины с программным замораживанием, действующие на основе жидкого азота и обеспечивающие снижение температуры до -196С. Для длительного хранения сосуды с лейкоцитами переносили в жидкий азот. Лейкоцитную массу замораживали в алюминиевых контейнерах с волнистой поверхностью, придающей им прочность при резкой смене температуры. Программа замораживания предусматривала снижение +\ температуры по 1С в мин до -15 С, а затем по 10С до -79С.
Выбор оптимального состава хладоограждающего раствора
Для замораживания лейкоцитов была использована экспоненциальная программа, при которой процессы внутриклеточного кристаллообразования в период смены фаз (вода - лед) замедляются. Свободная вода при этом успевает покинуть клетку и закристаллизоваться за ее пределами. При замораживании по экспоненциальному режиму различные популяции лейкоцитов входят в холодовой анабиоз постепенно на разных уровнях охлаждения, поэтому на термограмме не отмечается резкого выброса кристаллизационного тепла, что положительно сказывается па состоянии клеточной взвеси. Данная программа каждому виду лейкоцитов создает благоприятные условия вхождения в состояние холодового анабиоза.
Замораживание лейкоцитов производили в течение 10+1,83 мин по двухступенчатой экспоненциальной программе (рис.1): на 1-ом этапе со скоростью 10 7мин до точки эвтектики (-2Д С), на 2-ом - 2-3 7мин до температуры -20С. После этого переносили для хранения в электроморозильник на -20С.
Быстрое размораживание лейкоконцентрата проводили в 20-литровой водяной ванне при температуре + 38С в течение 35-45 сек (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании контейнера, отогревали до +2С.Выбор оптимального состава хладоограждающего раствора для лейкоцитов В предложенный хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре, содержащий криопротектор гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (кратко ГМБТОЭМ), нами впервые включено отечественное вещество — оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающее, кроме антиоксидантного, мембраностабилизирующим действием. ОМЭПС восстанавливает нарушенные структуры и функции мембран клеток, а также тормозит процессы перекисного окисления липидов, которые имеют место при криоконсервировании. Надо отметить, что сукцинат - производное янтарной кислоты (Мецлер Д., 1980) участвует в энергетическом обмене клетки, обеспечивающем ее жизнедеятельность, а пиридин - в нуклеиновом обмене (Герман А.С. , 1981). Химическая формула ГМБТОЭМ: (HOCH2CH2)2NCONH(CH2)6 NHCON(CH2 СН2ОН)2 Молекулярная масса ГМБТОЭМ - 378. Химически чистый криопротектор ГМБТОЭМ представляет собой мелкокристаллическое вещество белого цвета без запаха, горьковато-сладковатого вкуса, хорошо растворимое в воде, а при нагревании - в метаноле, этаноле, хлороформе, четыреххлористом углероде. Температура плавления - +89 ++91 С (Сведенцов Е.П., 1987). Водные растворы криофилактика прозрачны, имеют основную реакцию (рН=7,6-7,8). ГМБТОЭМ образует прочные связи с внеклеточной водой, замедляет скорость образования кристаллов и изменяет их структуру, взаимодействует с мембраной клеток, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов, тем самым, проявляя экзоцеллюлярное воздействие. Так же он оказывает и эндоцеллголярное воздействие: проникает в клетку, связывает воду, способствует образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании, снижает концентрацию солей внутри и вне клеток, предохраняя их от чрезмерного обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток, образует связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании. ОМЭПС (3-Окси-6-метил-2-этил пиридина сукцинат) представляет собой белый или белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок. Легко растворим в воде. По химической структуре ОМЭПС является соответствующей эмоксипину солью янтарной кислоты (сукцинатом). Сукцинат является стимулятором синтеза восстановительных эквивалентов в клетке за счет быстрого окисления его в цитоплазме, которое сопровождается быстрым ресинтезом АТФ, на этом основана его антиоксидантная резистентность. Подобно эмоксипину, ОМЭПС является ингибитором свободнорадикальных процессов, но оказывает более выраженное антигипоксическое действие (Лукьянова Л.Д., 1990; ВИДАЛЬ, 2001). Наряду с этим сукцинат мексидола легко проникает в клетки и окисляется в цикле трикарбоновых кислот, что способствует поддержанию уровня макроэргов при стрессовой гипоксии (Девяткина Т.А. и соавт.,1999). ОМЭПС обладает широким спектром фармакологической активности. Он эффективен при различных видах гипоксии: оказывает более выраженное и длительное действие, чем дибунол (ионол) (Смирнов Л.Д., 1989). ОМЭПС повышает устойчивость организма к кислородзависимым патологическим состояниям. Хладоограждающий раствор имеет оптимальный для лейкоцитарных клеток рН среды 7,0-7,4. Все ингредиенты, примененные в данном растворе, тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации. Изучены три варианта хладоограждающего раствора для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов (табл. 3.1).
Изучение «хронической токсичности» хладоограждающего раствора
Разработка нового метода сохранения функции лейкоцитов длительное время, прежде всего, включает в себя выбор эффективной программы замораживания. Широкое применение получили быстрые и медленные линейные программы замораживания различных клеток (Лаврик С.С. и соавт., 1971; Леонтович В.А. и соавт., 1973, 1974, 1975; Лобынцсва Г.С. и соавт., 1974; Махатадзе И.К. и соавт., 1975; Аграненко В.А. и соавт., 1986;
Гордиенко Е.А., H.G. Пушкарь, 1994). Нами была впервые применена нелинейная двухступенчатая экспоненциальная программа для введения лейкоцитов крови человека в состояние криоанабиоза при -20С (на первом этапе происходит замерзание внеклеточной воды, а на втором внутриклеточной). Известно (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994), что применение экспоненциальной программы замораживания тканевых лимфоцитов обеспечивает высокую эффективность криоконсервирования и является более предпочтительной, т.к. она значительно сокращает продолжительность и трудоемкость процедуры замораживания, не требует применение дорогостоящей жидкоазотной технологии и высокой квалификации обслуживающего персонала. Данная программа подтвердила свою эффективность и при замораживании лейкоцитов крови человека до Л 80С (Утемов СВ., 1995), до -50С и -40С (Сведенной Е.П. и соавт., 2003, 2004).
Мы полагаем, что экспоненциальная программа создает условия непринудительного режима вхождения в состояние холодового анабиоза f) каждой популяции лейкоцитов, что помогает избежать неблагоприятног воздействия факторов холодового стресса и колебаний температуры на этапе замораживания. Вся процедура охлаждения лейкоцитов до -20С по экспоненциальной программе составляла в среднем 10,00±1,83 мин. Кроме того, при данном замораживании не наблюдается выброса кристаллизационного тепла, а, следовательно, не происходит механического повреждения клетки за счет растущих кристаллов льда при рекристаллизации. Гипотеза о данном механизме криоповреждения была выдвинута в 60-е годы коллективом авторов во главе с Е.Асахиной. При изучении механизмов морозоустойчивости растительных и животных клеток показано, что некоторые клетки могут выживать при возникновении внутриклеточного льда при условиях формирования мелкозернистых кристаллов, не способных к росту. Если при этом отогрев клеток проводить очень быстро, то они полностью сохраняют свои биологические свойства Для избежания образования крупных кристаллов льда на этапе размораживания биообъекта нами был выбран быстрый режим отогрева, который включал в себя энергичное (2-3 раза в секунду) покачивание контейнера с клетками, погруженного в водяную баню при температуре +38С. С помощью интенсивного покачивания мы обеспечивали быстрый и равномерный нагрев всей поверхности контейнера и постоянное удаление с границы биообъект - внешняя среда образующегося теплового слоя. Благодаря этому весь объем замороженной лейковзвеси отогревался почти одновременно за 30-40 секунд. Для защиты различных клеток организма от неблагоприятного воздействия холодового стресса используют различные хладоограждающие растворы, эффективность которых определяется их способностью хорошо растворяться в воде и растворах электролитов, свойством предотвращать кристаллизацию воды, поддерживая в растворенном состоянии соли и белки } до эвтектического перехода в аморфное состояние, отсутствием токсичност на клеточном и организменном уровне. Хладоограждающие растворы включают в свой состав вещества, обладающие криопротекторными, мембраностабилизирующими, антиоксидантними и антигипоксантными свойствами, биокатионы и метаболиты, что позволяет улучшить " физиологическую активность клеток, вышедших из холодового анабиоза. При подборе ингредиентов для нового хлад о ограждающего раствора мы старались учесть все вышеперечисленные требования. Основным компонентом разрабатываемого нами раствора явилось криопротекторное вещество - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ) (Сведенцов Е.П. и соавт., 1995, 1997), образующее прочные связи с внеклеточной водой, замедляющее скорость образования кристаллов льда и изменяющее их структуру. Кроме того, это вещество за счет оксиэтильных, метальных и гидроксильных радикалов образует прочные связи с молекулами воды, расположенными вблизи мембраны, тем самым повышает ее устойчивость к повреждающему действию. Наряду с описанным экзоцеллюлярным действием данное вещество обладает и эндоцеллюлярным, проникая в клетку, связывает воду, предотвращая тем самым ее чрезмерное обезвоживание, "и способствует зарождению и росту только мелких кристаллов льда, что уменьшает риск механического повреждения мембран клеток. Впервые о механической гипотезе повреждения- цитоплазматических мембран и межклеточных контактов растущими кристаллами льда упоминается в работах Н.А. Максимова (1913), в дальнейшем она рассматривается рядом исследователей (Иткин Ю.А. и соавт., 1983; Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994). В работах В. I. Luyet (1949) установлено, что в основе разрушения биообъектов лежит образование вне- и внутриклеточных кристаллов льда. Выявлено существование прямой зависимости характера кристаллизации от присутствия в среде различных криопротекторных добавок и скорости Р снижения температуры. Установлено, что при быстром снижении температуры происходит коагуляция белков цитоплазмы клетки и нарушение нормального хода процессов их перехода из золя в гель и обратно, что приводит к гибели клеток в процессе замораживания-отогрева. Т. Nei (1962) и С- Lusena (1965) считали, что плазматические мембраны клеток проявляют устойчивость только к медленно растущим кристаллам льда и сильно повреждаются в случае взрывного роста кристаллов внутри клетки, что приводит к механическому разрыву мембраны. Используемый нами криопротектор защищает , клетки также и от неблагоприятного воздействия гиперконцентрации солей, способствуя равномерному их распределению в канальцах между мелкими кристаллами льда.
