Введение к работе
Актуальность проблемы В последние годы появилось множество работ, свидетельствующих об иммунологической недостаточности у больных наркоманией. [Гамалея Н.Б., 1994; Хотовицкий А.В., 2002; Вавренчук В.В. 2005; Акперов Э.К., 2005; Bouix O., et al., 1995; Eisenstein, 1997; Gaureriaux-Ruff C., et al., 1998]. Однако сведения по изучению биохимических механизмов, лежащих в основе нарушения иммунологических реакций при воздействии наркотических веществ, в литературе весьма ограничены. В связи с этим изучение иммуно-биохимических изменений, происходящих при метаболической перестройке организма у больных наркоманией, позволяет проводимое исследование сделать патогенетически более обоснованным.
Известно, что гранулярные лейкоциты являются важным компонентом защитной системы организма человека и животных. Свою основную функцию они осуществляют с помощью фагоцитоза – филогенетически наиболее древнего механизма защиты от проникающих в организм инородных частиц [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995; Кузнецов В.Ф., 1995; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Klebanoff S.J., 1992; Heufelder A.E., Bahn R.S., 1993; Peterson R.K., Nielsen H.B., 1997; Shiratsuch A., Nakanishi Y., 1999]. Фагоцитоз является частью многообразных функций нейтрофилов, участвующих в промежуточном обмене веществ, реактивности и в системе специфических реакций иммунного надзора и защиты. Однако механизм фагоцитоза до настоящего времени полностью не изучен, что делает актуальной проблему поиска новых подходов и биохимических основ в исследовании естественных и специфических иммунных реакций.
В свете современных представлений поглощение и переваривание микробов осуществляется с помощью разнообразных биохимических реакций: потребление кислорода, гликолиз, а также процессы биосинтеза. Контакт фагоцитарных объектов с поверхностью клетки приводит к функциональным изменениям компонентов плазматической мембраны и стимуляции метаболических процессов в фагоците (рис.1). Повышение активности окислительно-восстановительных реакций при фагоцитозе усиливает окисление глюкозы через гексозомонофосфатный шунт и способствует накоплению перекиси водорода, и свободных радикалов в нейтрофилах Перекись водорода является сильным окислителем клеточных компонентов [Галанкин И.В., Сапрыкин В.П., 1997; Першин Б.Б. и соавт., 2003; Овсянников М.В., 2005; Ambruso D. et al., 1990; Droge W. et al., 1992; Weigent D.A., et al. 1995]. При малой ее концентрации усиливается окислительный метаболизм в фагоцитах, активируются процессы завершенности фагоцитоза и адгезии нейтрофилов к эндотелию сосудов с последующей их миграцией в экстравазальное русло. Высокие ее концентрации приводят к гиперпродукции биологических оксидантов в нейтрофилах с мощным цитотоксическим потенциалом, влияющих на механизм клеточного распознавания антигенов и резистентности самих нейтрофилов.
Для характеристики фагоцитарной активности нейтрофилов первостепенное значение имеет состояние завершенного и незавершенного фагоцитоза. Изучение завершенности фагоцитоза является одним из главных, но наименее изученных звеньев клеточной реактивности организма. Поэтому поиск изучения биохимических особенностей в процессе перестройки и морфофункциональных преобразований нейтрофилов после фазы завершенного фагоцитоза является актуальной в исследованиях естественной резистентности у больных с опийной наркоманией. Изучение биохимических основ единой клеточно-гуморальной защиты организма расширит понятие о патогенезе опийной наркомании и с этих позиций поможет разработать новые пути прогнозирования, диагностики и профилактики наркомании.
Цель исследования. Изучить особенности функциональной активности нейтрофильных фагоцитов в крови больных с героиновой наркоманией, усовершенствовать биохимический подход к фагоцитарному процессу в клинических и экспериментальных исследованиях, разработать способы иммунологической диагностики данного заболевания.
Задачи исследования: 1. Изучить биохимические механизмы фагоцитар- ной реакции сегментоядерных нейтрофилов крови при наркомании в клинических и экспериментальных исследованиях.
-
Исследовать цитоморфологические преобразования и биохимические процессы фагоцитирующих клеток после завершения переваривания микробов.
-
Исследовать состояние адаптационных и компенсаторных возможностей нейтрофилов при моделировании наркотической зависимости в эксперименте.
-
Определить метаболическую активность и функциональные резервы гра-
нулярных лейкоцитов при воздействии наркотических веществ in vitro.
-
Выявить характер изменения показателей фагоцитоза в системе взаимосвязи с показателями клеточного, гуморального иммунитета и биохимических реакций у наркозависимых лиц.
6. Изучить возможность участия сегментоядерных нейтрофилов в процессе
повторного фагоцитоза в циркулирующей крови при усилении окисли-
тельного метаболизма в клетках.
7. Разработать способ определения наличия опиатов в крови с использовани
ем реакций фагоцитоза.
8. Разработать новый способ расчета НСТ-положительных клеток как пока-
зателя кислородзависимых систем бактерицидности гранулоцитов с уче-
том стадий завершенного и незавершенного фагоцитоза.
Научная новизна: Впервые для определения завершенности фагоцитоза в крови больных наркоманией учитывается фаза «созидательного покоя», которая происходит при истощении энергетических ресурсов в микрофагах.
Впервые приводятся теоретическое и практическое обоснование, а также биохимические подходы к проявлению феномена повторного фагоцитоза нейтрофилов в кровеносном русле.
Впервые выявлена новая форма фагоцитарной недостаточности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющаяся в высокой активности (гиперактивности) завершения фагоцитоза при низкой способности к поглощению и перевариванию микробов, вызванная дискоординацией обменных процессов при наркомании.
Разработан простой иммунологический тест определения опиатов в крови с помощью реакции фагоцитоза, основанный на усилении метаболичес-
кой активности клеток после введения наркотических веществ in vitro.
Модифицирован способ расчета НСТ-позитивных клеток внутри гранулярных лейкоцитов после восстановления нитросинего тетразолия с учетом цитоморфологических изменений нейтрофилов в стадии завершенного и незавершенного фагоцитоза.
Практическая значимость: Разработанный новый способ определения фазы «созидательного покоя дает возможность более четкого выявления стадии завершенности фагоцитоза и может быть использован в качестве дополнительного теста в прогнозировании заболевания и эффективности проводимых лечебных мероприятий.
Выявленная новая форма фагоцитарной недостаточности мало фагоцитирующих и быстро переходящих в стадию завершения и «покоя» позволяет оценить тяжесть абстинентного синдрома, степень наркотической интоксикации и помочь в разработке новых биохимических подходов к патогенезу наркомании.
Феномен повторного фагоцитоза расширяет понимание функцио-нального значения нейтрофилов в крови и биохимических механизмов формирования наркомании.
Разработанный фагоцитарный тест, определяющий наличие опиатов в крови людей и животных, повышает эффективность иммунологической диагностики наркомании.
Модификация способа расчета НСТ-теста упрощает подсчет зерен формазана внутри фагоцита и позволяет более четко дифференцировать стадию переваривания и завершения фагоцитарной реакции, а также степень активности окислительно-восстановительных реакций в микроцитах при наркомании.
Определение показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности антиоксидантной защиты в сыворотке крови позволяет определить накопление свободных радикалов и активности метаболического взрыва в нейтрофилах.
Результаты исследований можно использовать в учебном процессе, в научно-исследовательских и в клинических лабораториях биохимического, микробиологического и гематологического профиля.
Положения выносимые на защиту:
* У больных с опийной наркоманией в период абстиненции увеличиваются показатели завершенности фагоцитоза, снижается активность НСТ-восстанавливающей и адгезивной способности лейкоцитов. Хроническая опийная интоксикация увеличивает реактивность и скорость фагоцитарного процесса, функционально ослабленные фагоциты мало фагоцитируют и быстро переходят в стадию завершенности и «покоя». У пациентов, страдающих опийной зависимостью, в период отмены наркотиков снижается содержание Т- и особенно В-лимфоцитов, Т-хелперов, наряду с этим увеличивается содержание Т-супрессоров, ЦИК, а также IgM и IgA.
* У наркозависимых больных в период лишения употребления наркотика увеличивается содержание конечных продуктов ПОЛ – малонового диальдегида (МДА) в начале абстиненции и умеренно снижается в постабстинентном состоянии, а активность супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови снижена в течение всего периода абстиненции.
* В крови лабораторных белых мышей наибольшие показатели завершенности фагоцитоза отмечены в стадии отмены введения наркотических веществ, дисфункция нейтрофилов (повышение НСТ-восстанавливающей и снижение адгезивной способности) менее выражена, чем у людей. Активность нейтрофилов, принимающих участие в повторном фагоцитозе у животных выше, чем у больных в состоянии абстиненции.
Внедрение результатов исследования в практику. Имеется 3 патента Государственного патентного ведомства Республики Таджикистан (№ 0800168 от 10.01.2008 г.; № 080071 от 10.01.08 г.; № 0800336 от 18.06.2008 г.), получено 8 удостоверений на рационализаторское предложение, выданное ТГМУ им. Абуали ибни Сино, изданы 2 методических рекомендаций по совершенствованию метода определения фагоцитарной реакции нейтрофилов в крови.
Материалы исследований используются в учебном процессе на кафедрах нормальной физиологии, патологической физиологии, микробиологии и хирургических болезней №1.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на II Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергии (М.,2004), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); на международной конференции «Актуальные проблемы физиологии человека и животных» (Душанбе, 2003), в научно-медицинском журнале «Паёми Сино» («Вестник Авиценны») Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино; в научном журнале «Вестник национального университета» (Душанбе, 2004-2005 гг.), а также в материалах 53-й научно-практической конференции ТГМУ (с международным участием) (Душанбе, 2005), в материалах научно-практической конференции с международным участием «Семейная медицина и здоровье человека» (Душанбе, 2005), обсуждены на заседании межкафедральной экспертной комиссии по теоретическим дисциплинам ТГМУ им. Абуали ибни Сино (29 июня 2008 г), на расширенном межкафедральном заседании кафедры биохимии биологического факультета ТНУ (31 марта 2009 г)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 научные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 257 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с общей характеристикой материала и методов исследования, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель включает 370 названий, из них 240 на русском и 130 на иностранных языках.
