Введение к работе
Актуальность темы. Одной из наиболее чувствительных популяций лейкоцитов к воздействиям различных стресс-факторов являются гранулоциты, что связано с их более сложной структурной организацией (Гребенюк А.Н. с соавт., 1998; Давтян Т.К., Аванесян Л.А., 2001). Благодаря своему уникальному положению в системе неспецифической резистентности и иммунитета, а также наличию рецепторов к огромному числу биологически активных веществ, они быстро реагируют на состояние окружающей их среды, изменяя деятельность различных систем клетки (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов С.В., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001).
Данный компонент крови является крайне необходимым для клинических целей при лейкопении, угнетении функциональной активности фагоцитов, признаках вторичного иммунодефицита в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета, заболеваниях инфекционного характера: менингите, перитоните, сепсисе и других (Шалаев С.А. и соавт., 1990; Рыжков С.В. и соавт., 1992, 1995; Cairo M.S. et. al., 1992; Абдулкадыров К.М., 1994; Мельникова В.Н. и соавт., 1995; Ханевич М.Д., Маринин А.В., 1995; Neppert J., 1996; Vamvakas E.C. et al, 1996; Нerzog R., 1999; Muncunill J., 1999; Schiffer C., 1999; Балашов Д.Н., 2001; Гордеев В.И., 2003; Sputtek A., 2004). Широкому распространению использования гранулоцитов мешает ряд нерешенных проблем, в том числе связанных с их низкой устойчивостью, необходимостью наличия больших доз для получения терапевтического эффекта.
Ранее лейкоцитный концентрат (ЛК) сохраняли только криоконсервацией, то есть замораживанием биообъекта (–20С–196С), при этом лейкоциты находились в состоянии анабиоза (Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1966; Пушкарь Н.С. и соавт., 1978; Ермолович С.В., 1981; Аграненко В.А. и соавт., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004; Деветьярова О.Н., 2005; Утемов С.В. и соавт., 2005; Щеглова О.О., 2005). Однако после размораживания ЛК функциональная активность гранулоцитов часто оказывалась на низком уровне, что негативно сказывалось на качестве ЛК и его терапевтическом эффекте. Поэтому проблема оптимизации условий сохранения функций гранулоцитов крови человека вне организма является весьма актуальной на сегодняшний день. По существующей классификации отрицательных температур (Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., 2007) температура –10С относится к температурам переохлаждения, при которой не замерзают все виды внутриклеточной и внеклеточной воды. Биообъект, охлажденный до данной температуры, не замерзает, а входит в состояние гипобиоза, характеризующееся незначительным замедлением метаболизма в клетке. В отечественной и зарубежной литературе нами не было обнаружено метода сохранения функций гранулоцитов в данном состоянии. Использование температуры переохлаждения позволит избежать последствий холодового стресса, в частности разрушения мембран кристаллами льда, вымораживания воды, гиперконцентрации солей, и применять ЛК в физиологически полноценном состоянии для клинических целей.
Цель исследования – изучить функциональную активность лейкоцитов крови человека при использовании переохлаждения (–10С) под защитой специально созданных хладоограждающих растворов.
Задачи исследования:
-
Разработать способ введения лейкоцитов без потери их функциональной активности в холодовой гипобиоз путем нелинейного охлаждения до –10С.
-
Создать незамерзающие при температуре переохлаждения и не требующие отмывания от биообъекта хладоограждающие растворы, позволяющие сохранять функциональную полноценность лейкоцитов человека при их переохлаждении до –10С.
-
Изучить физиологическое состояние гранулоцитов, подвергнутых холодовому стресс-воздействию под защитой созданных хладоограждающих растворов.
-
Определить токсичность, апирогенность предложенных хладоограждающих растворов и переносимость трансфузий ЛК, подвергнутого переохлаждению.
Научная новизна. Впервые сохранена физиологическая активность лейкоцитов крови человека в течение 12 суток путем их переохлаждения до –10С.
Впервые показано, что влияние холодового стресс-фактора температуры переохлаждения устраняется при помощи созданного метода введения клеток в гипобиоз, включающего нелинейную программу охлаждения и оригинальные незамерзающие при -10С хладоограждающие растворы.
На основании исследования функциональной активности гранулоцитов крови человека, перенесших холодовое стресс-воздействие, выявлен оптимальный состав и дано научное обоснование криозащитных свойств предложенных хладоограждающих растворов (получен патент РФ № 2261 595 от 10.10.2005).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили создать метод сохранения лейкоцитов периферической крови в функционально активном состоянии, что создало основу для разработки надежных и безопасных методов хранения высокоспециализированных клеток. Работа развивает представления о механизмах холодового повреждения и защиты ядерных клеток крови человека в условиях температуры переохлаждения.
Предложенный эффективный и доступный метод отличается простотой в техническом исполнении и требует применения только электрического холодильника с морозильной камерой на -100С и разработанных хладоограждающих растворов.
Установлено, что разработанный способ сохранения лейкоцитов и их функциональной активности в течение 12 суток путем введения в холодовой гипобиоз (-10С) под защитой созданных хладоограждающих растворов может быть рекомендован для внедрения в практику научных биологических и медицинских учреждений.
Положения, выносимые на защиту:
-
При использовании температуры переохлаждения (-10С) гранулоциты под защитой растворов, содержащих желатиноль или модежель, сохраняют функциональную активность после холодового воздействия в течение 12 суток (максимальный срок хранения).
-
Для введения в состояние холодового гипобиоза (-10С) лейкоцитов крови человека предлагается применять разработанные хладоограждающие растворы, включающие глицерин, сукцинат 3-гидрокси-6-метил-2-этилпиридина (ОМЭПС) и препараты желатина (модежель или желатиноль) с использованием нелинейной трехэтапной программы охлаждения клеток.
-
Разработанный хладоограждающий раствор, содержащий желатиноль, является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносится экспериментальными животными и не требует отмывания от биообъекта после его отогрева.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003); на XV Коми Республиканской молодежной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004); на XIX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург, 2004), на объединенном заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов и Кировского отделения общества физиологов им. И.П. Павлова (Киров, 2008), на Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар, 2008).
Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал участие в создании метода введения лейкоцитов в гипобиоз при –100С, в определении оптимального состава незамерзающих хладоограждающих растворов, проводил все экспериментальные работы по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и вышедших из холодового гипобиоза гранулоцитов, статистическую обработку полученных результатов, участвовал в написании статей и докладов по теме диссертации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано пятнадцать печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, одна в республиканском журнале и одна в международном. Получен патент на изобретение «Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре –100С» № 2261595 от 10.10.2005.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, списка литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 186 и 70 источников отечественных и зарубежных авторов соответственно.
