Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням Калашникова Елена Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРЫЫЙ ОБЗОР 15

1.1. Достижения и проблемы традиционной селекции растений применительно к изучаемым объектам 15

1.2. Биотехнология - центральное звено современной науки 19

1.3. Селекция растений in vitro 22

1.4. Генетические, эпигенетические и морфофизиологические изменения клеток при селекции in vitro 27

1.5. Клеточной селекции растений на устойчивость к болезням .. 38

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 61

2.1. Объекты исследований 61

2.1.1.Культура клеток и ткани яровой пшеницы 61

2.1.2.Культура клеток и ткани моркови 64

2.1.3.Культура клеток и ткани картофеля 65

2.2. Методы исследований 66

2.2.1. Получение фитотоксичных экзометаболитов из грибов Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani 66

2.2.2.Схемы клеточной и тканевой селекция изучаемых растений: 68

а) Пшеница (Triticum aestivum)

б) Морковь {Daucus carota)

в) Картофель {Solanum tuberozum)

2.2.3.Биохимические и молекулярные методы исследований каллусных, суспензионных культур и растений-регенерантов 70

а) Определение суммы растворимых фенольных соединений в каллусных культурах и растениях-регенерантах 70

б) Определение содержания гормонов в каллусных и суспензионных культурах и растениях-регенерантах 71

в) RAPD анализ каллусной ткани и растений-регенерантов .... 74

2.2.4.Статистическая обработка результатов исследований 75

ГЛАВА 3. КАЛЛУСОГЕНЕЗ И МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ in vitro 77

3.1. Пшеница 78

3.1.1.Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов 79

3.1.2.Каллусогенез и морфогенез различных первичных эксплантов 83

3.1.3. Суспензионная культура 100

3.1.4. Влияние биологически активных веществ и других факторов на морфогенетический потенциал интактных растений и в культуре in vitro 103

3.1.5. Способы получения растений-регенерантов и их адаптация к почвенным условиям 111

3.2. Морковь 113

3.2.1 .Особенности каллусогенеза различных генотипов и первичных эксплантов 114

3.2.2. Рост и развитие суспензионных культур различных генотипов 115

3.2.3.Технология получения и адаптации растений-регенерантов к почвенным условиям 122

3.3. Картофель 124

3.3.1.Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов и эксплантов 125

3.3.2.Особенности роста суспензионных культур различных генотипов 13-

3.4. Заключение и выводы 133

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ДЕЙСТВИЯ НА ИНТАКТНЫЕ РАСТЕНИЯ И В КУЛЬТУРЕ in vitro 134

4.1. Влияние гриба Septoria nodorum и его экзометаболитов на семена и зародыши пшеницы 135

4.1.1.Токсичность гриба S. nodorum на изолированных зародышах 139

4.1.2. Получение культурального фильтрата гриба S. nodorum 141

4.1.3. Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на семена

и изолированные зародыши 143

4.2. Влияние экзометаболитов гриба Alternaria radicina на прорастание семян и рост суспензионной культуры моркови 147

4.2.1.Получение культурального фильтрата гриба A. radicina 149

4.2.2.Особенности прорастания семян моркови на культуральном фильтрате гриба A. radicina, полученном

разными способами 153

4.2.3.Особенности роста суспензионных культур моркови на культуральном фильтрате гриба A. radicina 156

4.3. Влияние экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на рост растений картофеля in vitro, на каллусные и суспензионные культуры 159

4.3.1. Получение культурального фильтрата гриба R. solani 163

4.3.2. Влияние культурального фильтрата гриба R. solani на рост пробирочных растений 164

4.3.3. Влияние культурального фильтрата гриба R. solani на рост каллусной ткани 166

4.3.4. Влияние культурального фильтрата гриба R. solani на рост суспензионной культуры 169

4.4. Заключение и выводы 172

ГЛАВА 5. КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ, МОРКОВИ И КАРТОФЕЛЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕЛЕКТИВНЫХ СРЕД НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ ПАТОГЕНАМ 173

5.1. Тканевая селекция пшеницы на устойчивость к патогену Septoria nodorum 174

5.1.1. Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на формирование каллусной ткани из незрелых зародышей различных генотипов 174

5.1.2. Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на рост каллусной ткани ; 178

5.1.3. Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на рост суспензионной культуры 181

5.1.4. Селекция пшеницы in vitro на устойчивость к действию экзометаболитов гриба S. nodorum 1 83

5.1.5. Получение растений-регенерантов устойчивых к S. nodorum 185

5.2. Клеточная селекция моркови на устойчивость к

патогену Alternaria radicina 188

5.2.1. Влияние экзометаболитов гриба A. radicina на рост суспензионной культуры и клеточная селекция 188

5.2.2. Получение растений-регенерантов устойчивых к

A. radicina 194

5.3. Тканевая и клеточная селекция картофеля на

устойчивость к патогену Rhizoctonia solani 199

5.3.1. Тканевая селекция картофеля на устойчивость к R. solani 199

5.3.2. Клеточная селекция картофеля на устойчивость к R. solani 201

5.4. Заключение и выводы 208

ГЛАВА 6. УЧАСТИЕ ФИТОГОРМОНОВ В КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЭКЗОМЕТАБОЛИТАМ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ 210

6.1.Селективные условия и гормональный баланс клеток

суспензионной культуры и растений-регенерантов моркови 211

6.2.Селективные условия и гормональный баланс клеток

суспензионной культуры картофеля 215

6.3. Заключение и выводы 221

ГЛАВА 7. УЧАСТИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В АДАПТАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР in vitro К ДЕЙСТВИЮ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ 222

7.1.Влияние экзометаболитов гриба Alternaria radicina на образование фенольных соединений в суспензионных культурах

и растениях-регенерантах различных генотипов моркови 224

7.2.Влияние экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на образование фенольных соединений в суспензионных культурах

различных генотипов картофеля 229

7.3. Заключение и выводы 234

ГЛАВА 8. RAPD АНАЛИЗ ДНК КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР И РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ПШЕНИЦЫ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДАМИ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ 235

8.1. ДНК полиморфизм каллусной ткани пшеницы, культивируемой на селективных и опытных средах 236

8.2. RAPD анализ растений-регенерантов пшеницы, полученных методами клеточной селекции 240

8.3. Заключение и выводы 243

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 244

ВЫВОДЫ 246

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 249

• Достижения и проблемы традиционной селекции растений применительно к изучаемым объектам
• Объекты исследований
• Пшеница

Введение к работе

Актуальность проблемы. Создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам является одним из важных направлений селекции. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными и вирусными болезнями и повреждением вредителями. Например, в середине 70-х годов XX века появление нового биотипа бурой ржавчины пшеницы привело к потере устойчивости популярных в то время на Северном Кавказе сортов Аврора и Кавказ; в конце 70-х годов наблюдалось массовое поражение подсолнечника белой и серой гнилями; вспышка фузариоза колоса пшеницы в 80-е годы снизила ее урожайность на 40-45%.

Данную проблему трудно решить, используя только традиционные способы защиты растений и посевов: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью.

Радикальным средством защиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур, и прежде всего, с использованием отдаленной гибридизации. Этим методом созданы многие ценные формы, сорта и гибриды сельскохозяйственных растений. Однако продолжительность такой селекции достигает 15-20 и более лет, а степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства.

Одним из новых, перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование современных методов

ф биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического

разнообразия (сомаклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и

W регенерации из них целых растений.

В настоящее время в нашей стране и в мире достигнуты значительные результаты по клеточной селекции: созданы линии картофеля, устойчивые к фитофторозу; томатов - к альтернариозу; риса - к пирикуляриозу; люцерны и льна - к фузариозу; клевера - к склеротинии и др. Как правило, в качестве селективного фактора используются токсины белковой и небелковой природы, выделенные из патогенных грибов. Устойчивость растений-регенерантов, полученных в процессе клеточной селекции, не всегда коррелирует с устойчивостью растений в условиях in vivo. В связи с этим необходимо разрабатывать нетрадиционные подходы, обеспечивающие повышение устойчивости

0 растений к фитопатогенам.

Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов растений в условиях in vitro особый интерес у исследователей вызывал вопрос о том, какие изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах и причины их вызывающие. Важной проблемой в исследованиях по клеточной селекции на устойчивость к биотическим факторам является выявление механизмов адаптации каллусных и суспензионных клеток к действию стрессового фактора, обусловленных

изменениями на генетическом уровне, в гормональном балансе и метаболизме вторичных соединений клеток, подвергшихся стрессовым воздействиям. Изучению этой проблемы и посвящена настоящая диссертация.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является усовершенствование и разработка методов и технологий клеточной селекции пшеницы, моркови и картофеля in vitro на устойчивость к фитопатогенным грибам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani, а также выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость клеток каллусных и суспензионных культур к действию экзометаболитов исследуемых патогенов.

В соответствии с поставленной целью нами решались следующие основные задачи:

1. разработка методов клеточной селекции растений in vitro путем культивирования клеток каллусных и суспензионных культур на питательных селективных средах; оптимизация способов получения культурального фильтрата патогенов, условий проведения клеточной селекции и состава питательных сред, обеспечивающих получение растений-регенерантов, устойчивых к грибным патогенам;

2. исследование изменений в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов, прошедших селекцию in vitro на селективных средах с использованием экзометаболитов патогенов;

3. определение участия фенольных соединений в адаптации клеток каллусных и суспензионных культур к действию стресс-фактора;

4. оценка на генетическом уровне (RAPD метод) каллусных клеток, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях, а также растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции и отличающихся повышенной устойчивостью к грибным патогенам.

]]

Научная новизна работы. Впервые разработаны и предложены методы клеточной и такневой селекции in vitro, позволяющие получать каллусные линии и растения пшеницы, моркови и картофеля, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani. Предложенные методы основаны на культивировании каллусных или суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих культуральный фильтрат (КФ) патогена в течение 8-10 пассажей.

Установлена зависимость фитотоксичности экзометаболитов возбудителей болезней в условиях in vitro от состава питательной среды. Показана целесообразность использования в качестве селективного фактора КФ патогена, полученного при выращивании изолятов грибов в течение 30-ти дней в жидкой питательной среде Чапека. В этих условиях фитотоксичность КФ в 5-7 раз превышает этот показатель при культивировании фитопатогенов на среде Мурасига и Скуга.

Экспериментально установлено, что культуральный фильтрат патогенов {Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani) в концентрациях 10-20% стимулирует рост интактных растений, а также клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель). Более высокие концентрации экзометаболитов оказывают ингибирующее действие на указанные объекты.

Впервые разработаны индивидуальные схемы селекции in vitro для пшеницы, моркови и картофеля и подобраны оптимальные концентрации КФ патогена. Установлено, что для каллусной ткани пшеницы целесообразно использовать 20%-ый КФ Septoria nodorum; для суспензионной культуры моркови - 30-50%-ый КФ Alternaria radicina; для каллусной и суспензионной культур картофеля - 30-40%-ый КФ Rhizoctonia solani.

Впервые, в результате клеточной селекции получены устойчивые клеточные линии и растения-регенеранты, превышающие устойчивость исходных форм к действию изучаемых патогенов на 10-35%, а для отдельных генотипов до 50%.

Выявлены изменения в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов моркови и картофеля, полученных в результате селекции к экзометаболитам патогенов. Определены различия в содержании гормонов в суспензионной культуре, длительно культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Установлено, что адаптация клеток к стрессовому фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных в результате клеточной селекции, отмечено значительное повышение содержания ауксинов, гиббереллинов и, особенно, цитокининов, по сравнению с контрольным вариантом.

Изучена зависимость способности клеток суспензионных культур к синтезу фенольных соединений от генотипа, времени и условий их культивирования in vitro. Доказано участие фенольных соединений в адаптации клеток к действию стресс-фактора. Более высокое их накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми. Значительная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение культурального фильтрата патогена в клетки за счет лигнификации клеточной стенки. В растениях-регенерантах выявлено не только повышение содержания фенольных соединений, но и изменение их качественного состава.

Установлены различия в нуклеотидных последовательностях ДНК (RAPD методом) в клеточных культурах, культивируемых на селективных и стандартных средах. Для устойчивых каллусных культур

и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, RAPD спектры ДНК отличались отсутствием или присутствием новых фрагментов размером от 330 п.н. до 1200 п.н., которые не были характерны для RAPD спектров ДНК контрольного варианта.

Практическая значимость работы. Предлагаемые в работе схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать растения-регенеранты пшеницы, моркови и картофеля, устойчивых к фитопатогенам Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani, соответственно. Такие растения могут быть использованы в традиционной селекции и служить основой для создания новых сортов и гибридов, обладающие повышенной устойчивостью к грибным болезням. Полученные новые данные об участии эндогенных гормонов и фенольных соединений в адаптации клеток к стрессовым условиям являются теоретической основой для более полной расшифровки механизмов устойчивости клеток к действию экзометаболитов опасных патогенов.

Результаты исследований легли в основу раздела «Клеточная и тканевая биотехнология в селекции и растениеводстве» учебного пособия и 2-х изданий учебника «Сельскохозяйственная биотехнология» (1998, 2003), изданного коллективом авторов под редакцией академика РАСХН B.C. Шевелухи.

Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 10 лет, с использованием существующих современных и разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.

Личный вклад автора. Постановка проблемы, целей и задач исследований; разработка программы и новых методов исследований;

обработка, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором. Экспериментальные работы проведены автором и частично аспирантами под его руководством.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения докладывались на симпозиуме в Вашингтоне « In vitro in Biology» (1996, 1997), на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» ( Минск, 1998), на I и II Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996, 2000), на V и VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1997, 2001), на VII и VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997, Саратов, 2003), на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В.Квасникова (Москва, 2003), на ежегодных научных конференциях МСХА (Москва, 2000, 2001, 2002), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К. А. Тимирязева.

Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 48 работах, в том числе в соответствующих главах учебного пособия и в двух учебниках для вузов «Сельскохозяйственная биотехнология» под грифом Министерства образования РФ.

* Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Достижения и проблемы традиционной селекции растений применительно к изучаемым объектам.

Одним из важных направлений современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой

^ или комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим

стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Эпифитотийный характер распространения наиболее опасных грибных, вирусных и бактериальных заболеваний культурных растений, уничтожающих до 30% (а иногда и более)

^ урожая, создали в России и ряде других стран мира ситуацию, при

которой потребность в обновлении сортовых ресурсов сельскохозяйственных культур на основе сочетания традиционных методов селекции и новых методов биотехнологии стала исключительно острой (Шевелуха, 1992, Шевелуха, Калашникова, Воронин и др., 2003). Посевы пшеницы, ячменя и других зерновых культур на огромных

> территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны

поражаются комплексным заболеванием - корневыми гнилями, а также ржавчинами, септориозом, гельминтоспориозом, мучнистой росой и др. Поражение посевов озимой пшеницы фузариозом колоса ( Fusarium nivale) на Северном Кавказе приводит к накоплению в зерне опасных для здоровья людей и животных микотоксинов. В отдельные, влажные годы этой болезнью поражается половина собранного урожая зерна (Дьяков, Озерецковская, Джавахия, Багирова, 2001). Поражение подсолнечника в этой зоне склеротинией и фомопсисом в годы с

пониженной температурой и повышенной влажностью среды возрастает до 50% и более. Картофель и томаты повсеместно поражаются

ф фитофторозом, что резко снижает урожай этих ценных

продовольственных культур и приводит к большим потерям при хранении (Шевелуха, 1991).

Огромный урон отечественному картофелеводству нанесла вспышка вироидности. Наиболее широко распространился вирой д веретеновидности картофеля (ВВКК), вспышка которого произошла в

^ 90-х годах прошлого столетия в основном в районах Поволжья и

Северного Кавказа. Это заболевание приводит к быстрому вырождению сортов, а при сильной степени заражения к 100%-й потери продуктивности. ВВКК обладает высокой инфекционностью и очень устойчив к повышенной температуре (не гибнет при 100 С) и к спиртам (Леонова, Шалдяева, Гуркин, 2002). Способов борьбы с данным заболеванием нет. Поэтому основным направлением в селекции картофеля является создание сортов, устойчивых к вирусным и грибным заболеваниям.

Несмотря на негативные явления в сельком хозяйстве России отрасль овощеводства в целом выдержала испытание и в последние годы

ІІ наращивает производство. Критическими для отрасли по объему

производства овощей были 1991-1995 гг., когда валовой их сбор в стране составил 91% от уровня дореформенного периода, а в последние 4 года (1999 - 2002 гг.) объемы их производства в открытом грунте существенно увеличились и составили в среднем 110-119%.

Одним из важнейших направлений повышения эффективности овощеводства является сортовой состав отрасли, селекция. По имеющимся оценкам, вклад селекции в повышение урожайности оценивается в 30-40%». В овощеводстве России с ее громадным

разнообразием и жесткостью природных условий роль сорта многократно возрастает. В XX веке в отрасли создан уникальный генофонд овощных культур, который насчитывает более 1600 сортов и гибридов. Из них 63% отечественных и 37% иностранных, которые, в целом, обеспечивают спрос и позволяют создавать конвейер поступления продукции (Литвинов, 2003).

Как правило, гибридный генофонд в отрасли - это принципиально новые формы растений с четко выраженными адаптивными свойствами, более выровненные, имеющие на порядок лучший товарный вид, более продуктивны и качественны, более востребованы на рынке овощей. Имеются и узкие места селекции растений в этой области. Например, нет сортов и гибридов томата для открытого грунта южных регионов, Урала и Сибири, прекращена селекция данной культуры на пригодность к механизированной уборке и на повышенное содержание сухого вещества; на нуле селекция цветной и малораспространенных разновидностей капусты; имеются сложности с селекцией лука репчатого, особенно для подзимнего посева в южных регионах страны. Аналогичная ситуация с корнеплодами - морковью и свеклой, луком пореем, салатом и др.

Таким образом, стратегическая задача селекции для промышленного овощеводства состоит в создании сортов и гибридов с четко выраженными адаптивными свойствами, устойчивых к стрессам, болезням и вредителям, обладающих низкой способностью к накоплению нитратов, тяжелых металлов, радионуклидов, с хорошей сохраняемостью питательных свойств и товарных качеств (Васильев, 1989).

Устойчивый сорт является основным элементом в системе интегрированной защиты растений от болезней, обеспечивающий

стабильность и экологическую чистоту сельскохозяйственного производства. Селекция устойчивых сортов представляет сложную

jk проблему не только в России, но и в других странах мира, так как вновь

создаваемые сорта быстро теряют устойчивость из-за появления в популяциях патогенов новых вирулентных рас и патотипов (Основные результаты научной деятельности ВНИИ фитопатологии за 1996-2000 гг., 2000).

В настоящее время во многих селекционных учреждениях России

Щ оценка и отбор исходного материала проводится без учета

генетического потенциала возбудителей болезней. Бесконтрольное использование в селекции генов устойчивости приводит к тому, что создаваемые сорта по своей генетической природе не способны долго противостоять быстро изменяющимся патогенам. Успех селекции сортов сельскохозяйственных культур с продолжительной устойчивостью к патогенным организмам всецело зависит от того, насколько исходный материал обладает генетическим разнообразием, сдерживает развитие болезни на разных этапах онтогенеза растений, отличается комплексной устойчивостью.

Основным условием решения этой проблемы является системный

Jt подход, так как устойчивость является результатом взаимодействия

двух систем - хозяина и патогена на фоне абиотических и антропогенных факторов. Для управления патосистемой, продления жизни устойчивости сортов необходимо знать не только экологическую и генетическую дифференциацию видов растения-хозяина, но и патогенного организма и их систем взаимодействия во времени и

^ пространстве.

1.2. Биотехнология - центральное звено современной науки.

Развитие современной молекулярной биологии и генетики, методов культивирования растительных, животных клеток и микроорганизмов в условиях in vitro, технологий рекомбинантных ДНК, открыло широкие возможности для их применения в науке и производстве. Главные направления современной биотехнологии - генетическая и клеточная инженерия, получившие интенсивное развитие в 80-е годы прошлого столетия, широко используются в настоящее время во многих странах мира, в том числе и в России. Лидирующее место в этой области занимают научные учреждения США, Англии, Германии, Франции, Японии, Нидерландов, Италии. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологических исследований в Китае, Индии и ряде других стран.

Основные задачи современной биотехнологии в области сельского
хозяйства - создание генетически модифицированных объектов
(растений, животных и микроорганизмов) с заранее заданными
признаками и свойствами; создание высокоэффективных штаммов
бактериальных препаратов, с повышенной активностью

нитратредуктазы и биологического связывания атмосферного азота; уменьшение потерь органического вещества за счет контроля процессов нитрификации и денитрификации; получение регуляторов роста растений и биопрепаратов, защищающих их от болезней и вредителей; разработка приемов, позволяющих ограничить отрицательное антропогенное воздействие на биосферу в результате интенсификации сельского хозяйства и промышленности (Егоров, 1987).

Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, отраслей, объектов производства и задач, объединенных в несколько крупнейших блоков и направлений. Среди них на первое место в XXI

веке в стратегическом плане выходит генетическая инженерия, главной целью которой является создание трансгенных растений (Шевелуха,

Щ 2000). Для успешного решения этой приоритетной задачи необходимо

преодолеть отставание в идентификации и клонировании генов; созданию их банков; расшифровке механизмов полигенной детерминации признаков и свойств биологических объектов; созданию надежных векторных систем и обеспечению высокой устойчивой экспрессии генов. Уже сегодня во многих лабораториях мира с

Щ помощью методов генетической инженерии созданы принципиально

новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, используемые в коммерческих целях. Созданы устойчивые формы сои и рапса к гербицидам; хлопчатника и кукурузы - к насекомым; картофеля - к колорадскому жуку и фитофторозу. Посевные площади, занятые под трансгенными сортами и гибридами сельскохозяйственных растений, достигают в мире уже 58,5 млн. га, которые за последние годы особенно резко возрасли.

Более широкое практическое применение в настоящее время получило второе важное направление современной биотехнологии -клеточная инженерия, основанная на тотипотенстности клеток,

4t способности их регенерировать целое растение, а также синтезировать

важнейшие соединения вторичного метаболизма. Работы в этом направлении носят многоплановый характер и позволяют размножать и сохранять ценные, лекарственные и исчезающие растения (клональное микроразмножение); ускорять селекционный процесс (клеточная селекция); получать неполовым путем гибриды (соматическая гибридизация), а также сохранять неполноценные зародыши (культура изолированных зародышей) и ценные клеточные популяции (криоконсервация).

В клеточной биотехнологии также существуют острые научные проблемы, решение которых позволит значительно повысить ее эффективность. Главные трудности клеточной инженерии недостаточно высокая частота регенерации клеток и нарушение нормального онтогенеза организмов; узкий спектр сомаклональной вариабельности; слабая экспрессия генов, контролирующих важнейшие хозяйственно-ценные признаки, а также не высокий выход веществ вторичного синтеза. Несмотря на трудности, в этом направлении достигнуты значительные результаты, которые нашли свое применение в селекционном процессе, производстве и промышленности. Большое число работ проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, картофеле, томатах, люцерне и других сельскохозяйственных культурах. Получены растения пшеницы, риса, картофеля, устойчивые к NaCl или Na₂S0₄ ; растения моркови, способные синтезировать в 20 раз больше метионина, в 30 раз - триптофана, в 5 раз - лизина; растения картофеля, устойчивые к кольцевой гнили. Методом гаплопродюсера созданы первые два сорта ячменя Исток и Одесский 115, отличающиеся повышенной продуктивностью и устойчивостью к засухе и болезням (Новолоцкий, 1986). В Госреестр РФ включены (1993-1994 гг.) сорта ярового ячменя Биос 1, Рамос и Эльф, полученные с участием в скрещивании дигаплоидных линий (Неттевич, 1986).

Таким образом, два важнейших направления биотехнологии: генетическая и клеточная инженерия составляют основу нынешних и будущих приоритетов в биотехнологии. Закономерное развитие этого процесса наряду с другими мерами, обеспечит решение стратегических задач России, многих государств мира и всей цивилизации -экологическую безопасность для людей; защиту человека и человечества от болезней; продовольственную безопасность государств;

устойчивое экономическое развитие всех стран мира (Шевелуха, 2000, Скрябин (личное сообщение), 2003).

1.3. Селекция растений in vitro.

Одна из сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для сельского хозяйства - возможность на основе сомаклональнои вариации или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.

Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:

прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток:

непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели неустойчивых делящихся клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;

тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;

визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.)

Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты.

Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования (Кирай, Барабаш, 1990).

Технически не трудно создать селективные условия для отбора клеток на устойчивость к неблагоприятным факторам: высоким концентрациям солей, низким рН, гербицидам, осмотическим стрессам, низкой или высокой температуре, патотоксинам. Для этого селективный фактор либо добавляется в питательную среду, либо чашки Петри с высеянными на поверхность агаризованной среды клетками переносятся в селективные условия (например, экстремальные температуры). Принцип отбора на устойчивость применяют также и в случае необходимости отселектировать клетки, характеризующиеся повышенной способностью к синтезу незаменимых аминокислот и синтезу белка. При этом в качестве селективных факторов используют аномальные аналоги незаменимых аминокислот или сами эти аминокислоты в повышенных концентрациях (Бутенко, 1999).

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способность к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе их культивирования in vitro. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны

эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции in vitro остается для некоторых растений пока единственным.

Получение стабильно устойчивых линий - процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани (50%), и в то же время часть каллусных колоний погибает (50%). Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективным фактором колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4-6 субкультивирований на селективной среде проявляется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2-3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых получают растения-регенеранты (Бутенко, 1999). Однако исследования показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и других солей ( Хромова, 2000, Новые сорта люцерны и амаранта селекции ВНИИ кормов ..., методич. рекомендации, 2003).

Наряду с перечисленными выше объектами ( каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская 29 и Московская 35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость (Беккужина, 1993).

Созданные методами клеточной селекции растения широко используются в селекционном процессе. Вместе с тем уже сейчас ощущается недостаток идей в области создания нетривиальных условий с целью получения растений, толерантных к засухе, высоким и пониженным температурам, болезням и вредителям.

Мутагены и их применение на клеточных культурах.

Известно, что мутагенез значительно повышает эффективность клеточной селекции. В настоящее время накоплены обширные экспериментальные сведения о мутагенной активности различных химических веществ, а также различных ионизирующих (рентгеновское и гамма-лучи) и ультрафиолетового излучений. Например, из химических мутагенов наиболее часто используют этилметансульфонат

(ЭМС). После обработки им клеток растений табака получено 25
фенотипических вариантов. Однако имеются данные,

свидетельствующие о незначительном мутагенном эффекте ЭМС. Другой мутаген, заслуживающий внимания при работе с клеточными культурами - Л^-этил-А^-ниторозомочевина (НЭМ). Данное химическое соединение нестабильно, быстро разрушается в питательной среде и может применяться для обработки клеток без последующей их отмывки. Эффективное мутагенное действие НЭМ продемонстрировано на суспензионной культуре гаплоидного табака, что позволило выделить мутанты, дефектные по нитратредуктазе. Обработка НЭМ гаплоидных протопластов табака увеличивала частоту возникновения хлоратустойчивых клонов в 20 раз, в то время как при мутагенезе диплоидных протопластов этого же вида появление стрептомицинустойчивых клонов повысилось в 30 раз. Наряду с перечисленными выше химическими мутагенами возможно использовать такие вещества как іУ-метил-Л^-нитро-ІУ-нитрозогуанидин (НГ) и iV-нитрозометилмочевину (НММ).

Наиболее широкий спектр мутаций наблюдается при использовании в качестве мутагена ионизирующего излучения. При рентгеновском облучении клеток получены пигментдефектные линии дурмана и петунии, устойчивые к параквату линии табака. Гамма-облученные растения ( лист ) служили источником каллусной ткани и протопластов, из которых были выделены линии, устойчивые к гербициду и валину. Устойчивые линии к валину были получены также и при обработке клеток табака ультрафиолетовыми лучами. Применение этого способа приводило к возникновению разнообразных ауксотрофных мутантов, полученных из гаплоидных протопластов табака.

Выживаемость клеточных колоний может быть различной в зависимости от того, на какой стадии развития культуры применяется обработка мутагеном. При работе с единичными клетками целесообразно проводить обработку их мутагеном до первого деления клеток, так как в другом случае возможно возникновение химерных линий. На изолированных протопластах было показано, что радиочувствительность протопластов зависит от этапов их культивирования. Экспериментально установлено, что облучение протопластов предпочтительнее проводить либо сразу после их выделения, либо на следующий день. Поскольку из-за возможного образования в среде под действием ионизирующего излучения токсических для клеток веществ, в любом случае желательно отмыть протопласты от среды, в которой проводили облучение.

При работе с химическими мутагенами нередко проявляется их токсическое действие на клетки. Высокий процент летальности при их использовании может приводить к гибели всей популяции клеток, поэтому при работе с химическими мутагенами применяют в основном невысокие их дозы. Ионизирующее излучение вызывает меньший токсический эффект. Более того, даже высокие дозы облучения подавляют лишь репродукционную и регенерационную способность клеток, сохраняя, однако, их метаболическую активность.

1.4. Генетические, эпигенетические и морфофизиологические изменения клеток при селекции in vitro. Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, в настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий. С разработкой техники получения растений-

регенерантов из каллуснои ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Такое разнообразие клеточных линий и растений-регенерантов называют «сомаклоны», хотя в 70-80-е годы XX столетия было принято называть растения, регенерировавшие из каллуснои ткани «калликлонами», а из протопластов - «протоклонами».

Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако можно четко выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генотипической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro, прежде всего, составом питательных сред и уровнем концентраций солей и регуляторов роста растений, а также от генотипа и исходного экспланта (Витанова, Влахова, Денчев и др., 1990).

Дифференцированные клетки в интактном растении могут иметь разную степень плоидности, но для отдельных видов характерно наличие только диплоидных клеток. Однако в процессе онтогенеза могут возникать клетки с разной плоидностью. Например, экспериментально доказано, что в меристемных тканях, наряду с факторами видового постоянства числа хромосом, почти у 80% покрытосеменных растений в процессе дифференцировки в соматических клетках может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей различного уровня плоидности. Для вегетативно размножаемых и апомиктичных растений характерно образование с высокой частотой анеуплоидных клеток. Усиление хромосомных перестроек, приводящих к появлению химерности и миксодлоидии у растений, наблюдается при изменении условий

произрастания, особенно при их резком ухудшении: засоление почв, повышенные или пониженные температуры, применение гербицидов или пестицидов, минеральных удобрений в повышенных дозах. Эти и другие факторы могут приводить к физиологическим нарушениям, связанным, в первую очередь, с появлением аномальных митозов и формированием клеток с числом хромосом, отличающихся от такового в материнской ткани.

Цитологические исследования показали, что вариабельность, индуцируемая условиями культивирования in vitro, связана с генетическими изменениями. Прежде всего одним из основных источников появления фенотипических вариантов являются различные кариологические изменения и перестройки (Долгих, Шамина, 1991). Однако выявить, какие из них будут иметь фенотипический эффект и наследоваться как стабильная мутация генов, часто сложно. Как грубые, так и тонкие хромосомные изменения - могут вызывать существенные фенотипические изменения как в растениях-регенерантах, так и в последующем потомстве. Хромосомные изменения часто наблюдаются при мейозе. Анализ мейоза клетки в регенерантах показал такие интенсивные перестройки хромосом, как транслокация, инверсия, субхроматидный обмен, частичная утрата хромосом.

Некоторые случаи соматической изменчивости могут быть объяснены соматическим кроссинговером, который индуцируется условиями культуры тканей. Например, при культивировании сои в условиях in vitro частота соматического кроссинговера увеличивалась от 5,7-10"⁵ до 7,7-10"⁶. В этом случае обмены происходят несимметрично или даже между негомологичными хромосомами, причем в условиях культуры частота сестринских обменов очень велика. Мелкие делеции часто обусловливают потерю гена, например выпадение доминантной

аллели, следствием чего часто бывают рецессивные мутации. В литературе это явление названо культуральным индуцированием

|р гемизигот (Лутова, 2003). Это также является доказательством того, что

большая часть фенотипических изменений обусловлена генетическими механизмами.

Генетическая природа сомаклональных изменений может быть успешно установлена с помощью анализа фрагментов рестрикции ДНК. В настоящее время рестрикционные фрагменты ДНК широко

А используются для классификации и идентификации разновидностей,

биоформ и даже сомаклональных вариантов. Одной из основных задач, связанных с проблемой изучения сомаклональных вариантов, является разработка методов, позволяющих выявлять генетические различия между регенерантами, полученными из каллусной ткани или из клеток, подвергшихся действию стрессового фактора.

Ранее молекулярный анализ сомаклональных вариантов проводился с использованием метода RFLP {restriction fragment length polymorphism), основанном на выявлении полиморфизма рестрикционных фрагментов ДНК. Показано, что метод RFLP может быть использован для классификации и идентификации сомаклональных вариантов (De Klerk,

# 1990). С помощью RFLP метода был выявлен полиморфизм

сомаклональных регенерантов кукурузы, полученных из каллусной культуры, который выражался в изменении копийности гена и ряда других небольших изменений специфических локусов (Brown et ah, 1991). Приведены данные о перестройках нуклеотидной последовательности и метилировании ДНК у растений риса, полученных из каллусной ткани. RFLP метод также активно использовался для доказательства гибридной природы межвидовых соматических гибридов и цибридов растений картофеля, для

вычисления уровня детектируемого полиморфизма у сомаклонов сахарной свеклы и дигаплоидов ячменя {Munthali et al, 1996).

В настоящее время наибольшее распространение при анализе генома растений приобрел метод RAPD PCR (random amply/led polymorphic DNA polymerase chain reaction), основанный на амплификации геномной ДНК с помощью случайных десятичленных праймеров. По сравнению с RFLP методом RAPD является более дешевым и быстрым и не требует большого количества растительного материала для анализа, что позволяет анализировать индивидуальные растения и отдельные каллусы.

Браун с соавторами в 1991 году, использовал метод RAPD анализа для выявления генетических изменений у не отличающихся фенотипически растений-регенерантов пшеницы, полученных из индивидуальных протопластов. Ими было показано, что каждое растение, полученное из протопласта, характеризовалось своим уникальным спектром амплифицированных фрагментов. Кроме того, методом RAPD анализа исследовались также различия между растениями, полученными в результате клеточной селекции и растениями, выращенными из семян (Brown et al, 1991). Установлено, что молекулярные маркеры, базирующиеся на вариациях последовательностей ДНК, оказываются хорошим методом для выявления близкородственных генотипов. Методики, основывающиеся на полимеразной цепной реакции, успешно используются в настоящее время для анализа взаимосвязей между различными группами растений (D'Ovidioetal, 1990, Welsh, McClelland et al, 1990, Williams et al, 1990, Carlson et al, 1991, Quiros et al, 1991, Martin et al, 1991, Weining, Langridge, 1991, Caetano-Anolles et al, 1992). Молекулярные методы исследования применялись также для определения уровня геномного

полиморфизма у длительно культивирующихся клеточных культур. На примере культивируемых в течение двух лет каллусов сахарного тростника было показано, что RAPD спектры таких регенерантов значительно более полиморфны, чем спектры регенерантов, полученных из молодых эмбриональных культур (Taylor et al, 1995). Для каллусной ткани солодки голой, длительно культивируемой в условиях in vitro (10 лет), показаны изменения в тотальной ДНК с использованием RAPD метода, а методом ПДРФ-анализа обнаружен полиморфизм в профилях митохондриальной ДНК (Чибиряев, 2002).

RAPD метод также был успешно использован для выявления полиморфизма сомаклонов персика, регенерированных из эмбриональной культуры (Hashimi et al., 1997), а также для растений томатов (Klein-Lankhorst et al., 1991). Кроме того &4/7>маркирование применялось при генетическом картировании (Raiter et al, 1992), определении связей между биотипами (Rajapaksi et al, 1995; Warburton, Bliss, 1996) и идентификации сортов персика (Lu et al, 1996). Янг с соавт. (Yang et al, 1993) использовали /^PD-маркирование для идентификации образцов сельдерея.

В работах по исследованию регенерантов из каллусной культуры риса (Oryza sativa var. indica) RAPD анализ применялся для маркирования 8 сомаклональных семей растений, имеющих фенотипические различия, такие как повышенная засухоустойчивость, измененная биомасса, длина стебля и др., а также 4 сомаклональных семей, не отличающихся по фенотипическим признакам от родительской формы. Показано, что все анализируемые растения значительно отличались по своим спектрам ДНК как между собой, так и от родительских растений. 28 из 45 амплифицированных RAPD фрагментов у сомаклонов были полиморфными, включая потерю

родительских фрагментов ДНК и возникновение новых, неродительских RAPD фрагментов. Полученные RAPD спектры явились молекулярными характеристиками полученных сомаклональных линий и позволили проследить наследуемость молекулярных маркеров в поколениях (Godwin et al, 1997). Аналогичные исследования были проведены на сомаклональных вариантах гороха ( Pisum sativum). RAPD анализ исходного сорта и его стабильных сомаклональных регенерантов выявил полиморфизм ДНК как между сомаклонами, так и между сомаклонами и исходным сортом гороха. Степень различий между сортами была сравнима со степенью межсортовой дивергенции. При этом выявлен специфический фрагмент ДНК, характерный только для спектров регенерантов и отсутствующий в RAPD спектре исходного сорта ( Кокаева и др., 1997).

RAPD метод применялся также для определения генетической стабильности некоторых видов сосны и ели, полученных в результате соматического эмбриогенеза. Анализ проводили с использованием 2154 амплифицированных RAPD фрагментов. При изучении соматических эмбриоидов и сомаклональных вариантов норвежской ели авторы пришли к выводу, что RAPD анализ не обнаруживает различий между сомаклональными вариантами, несмотря на большие количества проанализированной ДНК, использования значительного числа праймеров и существующей значительной межклоновой изменчивости.

Для подтверждения гибридной природы межвидовых и межсортовых соматических гибридов, полученных в результате слияния протопластов картофеля и томата, также активно используется RAPD анализ. Для полученных гибридов был описан широкий спектр фенотипической изменчивости, у ряда сомаклональных вариантов детектировались изменения на уровне кариотипа. Для исследования молекулярными

методами были отобраны сомаклоны, идентичные фенотипически
(отличия наблюдались лишь по жизнеспособности пыльцы) и не
^1 отличающиеся по белковым спектрам. RAPD анализ позволил выявить

полиморфизм ДНК у таких сомаклональных вариантов.

Высокая разрешающая способность RAPD метода позволяет
обнаружить изменения наследственной информации клеток на разных
этапах их культивирования, что может способствовать изучению
природы сомаклональнои изменчивости.
4Ь Приведенные выше материалы позволяют утверждать, что при

клональном микроразмножении, клеточной селекции или при получении веществ вторичного синтеза для различных культур следует учитывать возможность возникновения сомаклональнои изменчивости в процессе их длительного культивирования in vitro.

Кроме сомаклональнои вариабельности, связанной с наследуемыми перестройками генома, отмечены фенотипические изменения («эпигенетические»), которые могут стабильно передаваться дочерним клеткам, но не проявляться в растениях-регенерантах или их половом потомстве.

Высокая степень разнообразия сомаклонов зависит от исходного
ф генотипа, природы и стадии развития экспланта. Например, у различных

злаков степень изменчивости среди сомаклонов может значительно различаться: у пшеницы ( 2« = 6х - 42) из 192 исследованных растений-регенерантов 29% были анеуплоидными, у гексаплоидного овса ( 2п = 6х - 42) выявлены цитогенетические изменения с такой же частотой, а для кукурузы, частота возникновения анеуплоидных растений не превышала 2-3%. Образование полиплоидных и анеуплоидных растений может наблюдаться и у других видов, например, на картофеле. Причем

частота появления новых вариантов у диких видов значительно ниже, чем у дигаплоидных линий культивируемого картофеля.

Тип исходного экспланта также влияет на появление сомаклональных вариантов, отличающихся количественными и качественными признаками. Для картофеля, например, аномальные растения получены в 12% случаев при использовании в качестве первичного экспланта мезофильных тканей листа, а в случае использования лепестков или оси соцветий частота формирования растений с фенотипическими отклонениями от нормы составила 50%.

Условия культивирования и, в частности, нарушение гормонального баланса питательной среды - одна из причин возникновения генетического разнообразия культивируемых клеток вследствии нарушения клеточного цикла, в частности митоза. От соотношения фитогормонов, входящих в состав питательных сред, во многом зависит цитогенетическая структура клеточных популяций. Одним из наиболее вероятных путей влияния фитогормонов на репрессию и дерепрессию генов является метилирование ДНК, вызывающие усиление или ослабление экспрессии соответствующих генов или полное прекращение их функционирования на том или другом этапе органогенеза. Количество присоединившихся или освободившихся метальных групп, места их локализации в боковых ветвях структур нуклеотидных последовательностей ДНК оказывают при этом существенное влияние на функциональную активность генов, в состав которых входят указанные структуры. Изменения в характере метилирования ДНК влияют на процессы гетерохроматизации и компактизации хромосомного материала. Как известно, гетерохроматиновым участкам свойственна задержка репликации, что может приводить к возникновению анафазных мостов и индукции

хромосомных разрывов. В свою очередь, хромосомные разрывы могут активировать мобильные генетические элементы и повышать мутабильность культивируемых клеток растений (Лутова, 2003). Известно, что мобильные элементы могут инактивировать структурные гены, изменять генную регуляцию, реактивировать молчащие гены и генерировать дупликации и делеции. Шок развития (выражение Ларкина применительно к условиям культивирования in vitro ) могут индуцировать транспозиции мобильных элементов, которые являются эффективным способом повышения адаптивности клеток к стрессовым условиям.

В настоящее время известны ферменты, например, ДНК-метилаза, ответственные за метилирование ДНК в соответствии со следующим уравнением реакции: ДНК + S-аденозилметионин -> Метил-ДНК + S-адвнозилгомоцистеин. С этим процессом связаны многочисленные факты возникновения так называемых эпигенетических, ненаследуемых изменений у растений.

Морфологическая и цитогенетическая разнокачественность клеточных популяций может возникнуть и вследствие влияния отдельных компонентов питательной среды: некоторых минеральных солей, сахарозы или другого источника углеродного питания, витаминов, растительных экстрактов, а также от режима выращивания. Длительное культивирование клеток in vitro также способствует повышению генетического разнообразия сомаклонов. Причем, для некоторых видов показано, что, несмотря на присутствие в культуре in vitro клеток разной плоидности, регенерировавшие растения были преимущественно диплоидными. Это явление было объяснено тем, что в процессе культивирования отбирались растения-регенеранты с более

или менее нормальной морфологией, которые регенерировали, как правило, в первую очередь.

Различные типы морфогенеза - соматический эмбриогенез или органогенез - также могут по-разному сказываться на генетических изменениях и соответственно на фенотипе растений. Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка - растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше.

Таким образом, частота, природа изменчивости, стабильность и наследование в половом потомстве генетической и эпигенетической изменчивости - различны (табл. 1).

Таблица 1

Генетическая и эпигенетическая изменчивость (по Р.Г.Бутенко, 1999).

Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что клетки растений, культивируемые в условиях in vitro, подвергаются ряду генетических, эпигенетических и морфофизиологических изменений. Сохранение клетками генетической стабильности может рассматриваться лишь как исключение. Прямые цитологические наблюдения за числом и структурой хромосом клеток растений свидетельствует, что кариотип культивируемых клеток легко подвергается модификации. Часть таких клеток погибает, часть может размножаться и вытеснять нормальные клетки. Установлено, что клетки

с измененными кариотипами могут обладать морфогенетическими потенциями и давать начало растениям-регенерантам с измененными числом и структурой хромосом. Размер и частота хромосомных нарушений в клетках растений, культивируемых на искусственных питательных средах, достаточно велики.

Установлено, что кроме изменений числа и структуры хромосом в клетках растений in vitro происходят и генные (точечные) мутации, частота которых достаточно велика и может быть использована для повышения генетического разнообразия культивируемых растений.

1.5. Клеточная селекция растений на устойчивость к болезням.

Для увеличения производства продуктов питания экономически важным представляется защита растений от болезней и вредителей. Важность указанной проблемы, прежде всего, обусловлена большими потерями урожая (25%), которые несет сельское хозяйство от фитопатогенов (Коновалов, 1999).

В настоящее время разработаны и широко применяются на практике химические способы защиты растений от болезней. Однако эти методы не всегда позволяют получать желаемый результат, а зачастую приводят к загрязнению окружающей среды и самой продукции. Наиболее эффективным способом защиты сельскохозяйственных растений от болезней и вредителей является селекция. Однако рядом селекционеров отмечено, что получение форм растений, устойчивых к биотическим факторам, задача не из легких, так как работа должна вестись одновременно с двумя группами объектов живой природы. С одной стороны - растительный объект, с другой - живой организм, на устойчивость к которому ведется отбор ( Плащев и др., 1986, 1988).

Отбор, как метод селекции, имеет большое значение в селекции сельскохозяйственных растений на устойчивость к болезням, особенно в

работе с местными сортами-популяциями (Гиренко, Муханова, 1985). Основой для отбора в пределах сорта растений, устойчивых против болезней, является наследственная неоднородность сорта в отношении к той или иной болезни (Ильина, 1958).

По мнению Д.Д. Вердеревского (1968) любой восприимчивый к болезням вид или сорт растений содержит в своем составе устойчивые к этим же заболеваниям формы, которые могут быть выявлены лишь в условиях сильного инфекционного фона. Эти формы возникают под действием естественного отбора на природном инфекционном фоне. Однако существование устойчивых растений внутри восприимчивого сорта может быть связано и с тем, что в процессе его выведения не проводилась оценка на устойчивость, и сорт оказался неоднородным по этому признаку, внутри которого и возможен отбор устойчивых растений.

Селекция с использованием традиционных методов практически до сих пор не позволяет создавать сорта, обладающие устойчивостью к фитопатогенам, так как селекционный процесс сложный, трудоемкий и весьма длительный. Использование методов биотехнологии, в частности культуры изолированных клеток, тканей и органов растений, позволяет сократить сроки проведения селекции и повысить ее эффективность (Бутенко, 1999). Особое внимание заслуживает клеточная селекция, позволяющая в лабораторных условиях in vitro отбирать из многомиллионных клеточных популяций каллусных или суспензионных культур резистентные клетки, а затем из них получать растения-регенеранты. Уже сейчас просматриваются реальные перспективы применения клеточной селекции на устойчивость к патогенам. Например, если при селекции картофеля на устойчивость к болезням в течение года необходимо в полевых условиях провести оценку от 50 до

100 тыс. сеянцев, то in vitro за один прием можно протестировать около 20 млн. протопластов, выделенных из 9 г листьев картофеля. Перспективность этого метода показана для томатов, люцерны, ячменя, картофеля. Наиболее эффективна она для тех культур, для которых разработаны методы массовой регенерации растений из клеток и протопластов (Бутенко, 1984, Мироненко, Гусева, 1987, Кукушкина, 1987, Рассадина, Хромова, 1988, Родина, Родин, Ефрамова, 1990, Иванова, 1991, Шевелуха, 1991, Масленников, 1994).

Воздействие селектирующего фактора на эмбриогенные и каллусные культуры может приводить к морфологическим изменениям, связанных с изменением плоидности (Бутенко, 1999, Higgins, Mathias, 1987, Jang, Tainter, 1989). Так, например, появление полиплоидных растений клевера лугового наблюдалось уже на 9 этапе культивирования клеточной суспензии и возрастало с увеличением числа циклов выращивания. Клетки с измененным кариотипом давали начало растениям-регенерантам, которые обладали устойчивостью к корневой гнили (Мазин, Солодкая, Кирьян и др., 1998).

В ряде работ установлено, что в тканях восприимчивых растений существенно изменяется характер водообмена, состав и содержание азотных веществ, форм калия, активность некоторых окислительных ферментов. Устойчивые сорта отличались стабильностью ряда показателей, изменением количественного и качественного состава фенольных соединений, гормонов и выделением фитоалексинов (Полякова, 1979, Метлицкий, Озерецковская, 1985, Хайрулин, Шакирова, Максимов, 1993, Поплетаева, Чкаников, 1994, Васюкова и др., 2000, Тарчевский, 2001).

Успешная клеточная селекция возможна лишь при использовании в качестве селектирующего фактора токсичных для растения

РОССИЙСКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА

метаболитов патогена. В качестве селективного агента обычно используют патотоксины, культуральный фильтрат и непосредственно сам патоген. В таблице 2 приведены некоторые данные по использованию методов клеточной селекции для получения форм растений, устойчивых к биотическим факторам.

Таблица 2. Применение методов клеточной селекции in vitro в получении растений,

устойчивых к болезням.

Использование патогенов в клеточной селекции растений на

устойчивость к болезням.

Наиболее простой подход в селекции растений in vitro на устойчивость к болезням связан с культивированием клеток непосредственно в присутствии патогена. Этот подход может быть особенно полезным, когда мало известно о токсических веществах, ответственных за патогенез, или если патоген не продуцирует токсины. В большинстве случаев селекция на устойчивость к вирусным заболеваниям проводилась путем инфицирования культивируемых клеток вирусами с последующим отбором устойчивых форм среди растений-регенерантов. По мере накопления опыта было выявлено, что лучшим объектом исследования в этом случае являются протопласты по сравнению с клетками или клеточными колониями, у которых наблюдается низкая частота инфицирования вирусами и низкая способность к росту (Жук, Рассока, 1992, Жук, 1993).

В селекции на устойчивость к патогенам существуют некоторые сложности отбора устойчивых клеток. Для выбора правильной схемы селекции, прежде всего, необходимо знание жизненного цикла патогена. Многие патогены, например грибы, имеют различные стадии жизненного цикла, несколько стадий спороношения, в зависимости от которых могут изменяться выживаемость, рост и эпидемиология. Поэтому необходимо учитывать стадию спороношения, существенным для инфицирования могут быть световой и температурный режимы, относительная влажность, рН, наличие или отсутствие питательных веществ, что сказывается на прорастании спор. Часто стратегия селекции может зависить от биологии патогена. Например, для

инфицирования некротрофами необходим высокий уровень инокулюма, тогда как заражение биотрофами может вызываться отдельными спорами или клетками. Также некротрофы обычно хорошо растут в культуре in vitro, а биотрофы плохо, так как большинство из них облигатные паразиты. Для многих видов грибов, например, Helminthosporum gramineum, Alternaria solani, Fusarium oxysporum, Sclerotinia trifolium характерен быстрый рост мицелия на питательных средах, используемых для растительных клеток. Это не позволяет идентифицировать устойчивые клетки хозяина, которые так же, как и чувствительные, быстро покрываются мицелием. В этом случае пытаются инфицировать лишь кусочки ткани, а также механически ограничить рост патогена. Для Septoria nodorum и пирикуляриоза риса это явление не характерно. Мицелий этих грибов растет не так стремительно и обходит стороной устойчивые каллусы на некотором расстоянии от них (Дьяков, 1985, Манешина, Обухович, Курицова, 1988, Лети Джое, 1998).

Исследования по культивированию растительных клеток в присутствиии патогена были начаты в середине 60-х годов и направлены на изучение корреляции устойчивости и чувствительности к патогену in vivo и in vitro. Непосредственно эксперименты по клеточной селекции на устойчивость к патогенам не всегда были успешными. Так, для люцерны был предложен способ отбора каллусных тканей на устойчивость к Phytophthora megasperma, путем совместного культивирования каллусных клеток и инокулюма патогена. Аналогичный подход был применен для табака на устойчивость к Phytophthora parasitica var. Nicotianae, для березы - к Peronospora barinosaf, Sp. Beta (Deaton, Keyes, Collins, 1982). В этих исследованиях авторам не всегда удавалось провести клеточную селекцию и получить

устойчивые растения, так как в этом случае каллусная ткань сильно инфицировалась мицелием или спорами патогена, что вело к ингибированию ростовых и морфо-физиологических процессов. Однако китайским ученым удалось получить два новых высокоурожайных сорта риса, устойчивых к пирикуляриозу. Селекция проводилась на культуре изолированных пыльников, а в качестве селективного фактора применялась смесь десяти линий гриба. В настоящее время новые сорта, созданные этим методом, занимают в Китае более 140 тыс. га и дают средний урожай 7,5 тыс. кг/га.

В клеточной селекции растений на устойчивочть к патогенам интересен способ, названный техникой двойного слоя. Этот способ был впервые продемонстрирован на люцерне на устойчивость к фузариозу. Метаболические компоненты культивируемого гриба из нижнего слоя среды диффундируют в верхний слой, создавая, тем самым, селективные условия для развития каллусной ткани. Глубина второго слоя служит своеобразным регулятором токсического эффекта. В результате использования данного метода обнаружены резистентные к фузариозу клетки каллусной ткани люцерны (Игнатова, Лукьянюк, Овсюк, 1988, Лукьянюк, Овсюк, 1992).

В работе Сакристана {Sacristan, 1982) использованы две селективные системы, при которых критерием отбора служило отсутствие роста гриба на тканевых и эмбриогенных культурах рапса, обработанных спорами патогена. Использовали два метода инфицирования: 1 ) каллусы размером 2 -3 мм или изолированные эмбриоиды (зародыши) инкубировали в течение 16 -20 ч на качалке в жидкой питательной среде, содержащей пикнидоспоры в концентрации 10³ - 10⁴ спор/мл, после чего экспланты промывали той же средой без патогена и помещали на агаризованную среду (не содержащую стресс-фактор); 2 )

каллусы и эмбриоды помещали непосредственно на агаризованную среду, содержающую в поверхностном слое среды споры патогена в

концентрации 10-10 спор/мл. Одновременно с этим в обоих случаях
каллусные и эмбриогенные культуры подвергались воздействию КФ
гриба, полученного из патогена, культивируемого в жидкой
питательной среде и изолированного в стационарной фазе роста гриба
(3-4 недели). Селективную среду получали путем смешивания в
соотношении 1:1 КФ и питательной среды Мурасига и Скуга (МС)
(Murrachige, Skoog, 1962). Каллусные и эмбриогенные культуры рапса,
выжившие в течение двух пассажей на селективной среде, были
отобраны как устойчивые. Первый метод инфицирования оказался

неэффективным, так как при отборе устойчивых форм рапса путем заражения каллусных и эмбриогенных культур спорами Phoma lingam не было получено ни одного устойчивого растения. При использовании второго метода инфицирования ингибирующий эффект КФ Phoma lingam проявился через несколько дней выращивания каллусных и эмбриогенных культур рапса в стрессовых условиях. Устойчивые культуры отличались от восприимчивых по интенсивному образованию хлорофилла на свету и развитию более мощной корневой системы. Отобранные каллусные культуры культивировали на селективной среде в течение семи пассажей, после чего их переносили на среды для регенерации растений. Оценка полученных регенератов на устойчивость к патогену в лабораторных условиях показала, что в 2%-ах случаев у отобранных в селективных условиях растений не было отмечено никаких симптомов болезни в течение нескольких месяцев после инфицирования регенерантов. Эта реакция была сравнима лишь с реакцией высоко устойчивого вида Brassica juceae (горчица сарептская ). Кроме того, из каллусных культур были регенерированы растения

(12%), которые поражались патогеном в значительно меньшей степени, по сравнению с растениями контрольного варианта. Эмбриогенные культуры в данном случае оказались неподходящим материалом для отбора устойчивых форм, так как воздействие патогена на них проявлялось слабо. По-видимому, это связано с более плотной структурой тканей эмбриоидов, по сравнению с каллусными клетками (Sjodin,Glimelius, 19S9, Katiyar, Chopra, 1990).

Эксперименты по клеточной селекции на устойчивость к патогенам с использованием в качестве селективного фактора самого патогена не всегда были успешными. Например, при заражении зооспорами Plasmodiophora brassicae и конидиями Leptosphaeria maculans каллусной ткани капусты, устойчивых линий выделить не удалось. Эти исследования еще раз подтвердили сложность работ по селекции in vitro с использованием непосредственно патогена. Положительный результат исследований зависит от правильного выбора стадии жизненного цикла патогена и подбора соответствующих условий совместного культивирования клеток растения и гриба. Использование при клеточной селекции культурального фильтрата

патогена.

В отношении многих патогенов, для которых патотоксины в чистом виде не выделены или не изучены, для селекции in vitro на устойчивость реальным представляется использование культуральных фильтратов ( КФ ) патогенов. Необходимым условияем их применения является наличие его активности как селективного фактора. Отсюда важен: способ получения КФ; агрессивность штаммов, вводимых в культуру; питательная среда, как фактор накопления неизвестных токсинов; сохранение инфекционных свойств патогенов в культуре (Берестецкий, 1973, Иванова, 1987, Рассадина, Хромова и др., 1991,

Гирко, Волощук, 1993, Мазин, Солодкая и др., 1998). Например, штаммы грибов Alternaria alternata, Alternaria macrospora, Alternaria tenussima (возбудители альтернариоза хлопчатника) выращивали на среде Чапека-Докса и в жидкой картофельно-морковной среде, после чего проверяли действие полученных КФ по прорастанию семян. Установлено, что подавляющее действие более чем на 50% оказал КФ, полученный на среде Чапека-Докса (Родева, Станчева, 1990, Белякова, Ермолинский и др., 1991, Лихачев, 1994).

Культивирование возбудителя ризоктониоза риса на картофельно-декстрозной среде приводило к снижению инфекционных свойств. Замена картофельно-декстрозной среды на среду Чапека с кукурузным экстрактом и сорбитом приводило к возвращению к исходной патогенности (Хотин, Полякова, 1991). Нгуен Хонг Мин показал, что выращивание Alternaria solani на каллусной ткани томата значительно увеличивало его агрессивность и способность индуцировать fi-глюкозидазу, используемой в качестве теста на устойчивость, по сравнению с культивированием на картофельной среде (Нгуен Хонг Минь, 1991).

Первые обнадеживающие результаты по селекции получены М. Бенке в 1980 году, применявшего нефракционированную культуральную жидкость Phytophthora infestans в клеточной селекции картофеля. Были выделены устойчивые клеточные клоны, давшие начало растениям. При механической инокуляции листьев растений-регенерантов спорами Phytophthora у 3 из 34 выделенных растений обнаружились очаги поражения, значительно меньше по сравнению с контролем.

Известны различные способы отбора клеток на селективных средах: быстрый (разовый) отбор, прямой ступенчатый,

многоступенчатый и прерывистый. Американскими учеными из университета штаты Невада был проведен ступенчатый и прямой отбор устойчивых к фузариозу форм люцерны in vitro. В первом случае каллусные линии, культивировали в течение двух пассажей на среде с 20% КФ, а затем переносили на среду с 50% КФ и инкубировали еще в течение четырех месяцев в стрессовых условиях. Во втором случае исходную каллусную ткань сразу помещали на среду с 50% КФ и после трех пассажей, каллусы, сохранившие рост в стрессовых условиях, переносили на среды для регенерации (Chawa, Wenzel, 1987). Использование ступенчатой схемы селекции, позволило получить большее количество растений-регенерантов, проявившие стабильную устойчивость к фузариозу.

Работы по устойчивости к фузариозу были проведены и на томатах. При ступенчатом отборе выделена каллусная линия Regen S-A, способная хорошо расти на селективной среде. Однако при подсчете хромосом у растений, регенерированных из клеток данной линии, обнаружено измененное их число ( 2гс=48 и 2п=64). Устойчивые к культуральному фильтрату линии были получены и при прямом отборе. Эти регенеранты имели диплоидный набор хромосом ( 2«=32), что говорит о преимуществе такого отбора {Kasenberg, Traguair, 1988).

Германович СТ. использовал многоступенчатый отбор, который заключался в последовательной пересадке клеток клевера лугового с меньшей на большую концентрацию КФ патогена в среде (Германович, 1991). В работе итальянских ученых показана возможнось получения резистентных растений люцерны из восприимчивого исходного материала. Отбор каллусов на устойчивость проводили с использованием двух направлений. При первом - шести недельные каллусы переносили на среду В₅, содержащую 10% культурального

фильтрата, и инкубировали три месяца; при втором - каллусы предварительно выращивали на среде 2?₅ с добавлением 1, 5, 7,5% КФ, а затем переносили на среду с содержанием его 10%. Концентрации ниже 10% существенно не снижали рост каллусной ткани, поэтому данную концентрацию использовали для отбора устойчивых линий. При первом отборе регенерировало 6, а при втором способе - 2 растения {Deadon, Keyes, Collins, 1982).

Устойчивые к фузариозу формы растений были отобраны in vitro у другого представителя семейства Solanaceae - картофеля ( Вепке, 1980). В качестве селектирующего агента использовали КФ, полученный из двух изолятов F. oxysporum, который с целью увеличения выхода токсинов культивировали на обогащенной среде. Культуральную жидкость, после отделения конидий, стерилизовали фильтрованием через мембраны (0,2 мкм) и смешивали со средой Гамборга {В₅). Отбор проводили на питательной среде, содержащей 40% КФ, на которую помещали каллусы размером Змм по 16 штук на каждую чашку Петри ( d = 5 см ). В этих условиях для большинства каллусной ткани было характерно появление некрозов, что приводило к гибели клеток в течение 3 недель.

Во ВНИИ льна проводились исследования по культивированию гипокотильных сегментов и каллусной ткани восприимчивого к фузариозному увяданию сорта льна-долгунца Славный 82 на селективной среде. Выполненная работа показала, что добавление в питательную среду культурального фильтрата 39 штамме возбудителя фузариозного увядания льна в концентрации 2,5-5,0% позволяет проводить отбор каллусной ткани, на устойчивость к данному патогену.

Что касается работ по клеточной селекции растений на устойчивость к септориозу малочислены и носят поисковый характер. Так, Михаил Е.

с соавторами сделали попытку определить устойчивость 10 видов тополей к Septoria musiva. В качестве первичного экспланта они использовали изолированные листья, которые культивировали в условиях in vitro на питательной среде, содержащей КФ гриба. Устойчивость определяли по образованию бурых пятен по всей листовой пластинке {Michal, Ronald et all, 1988). Однако добиться регенерации растений им не удалось.

Келлар В. и другие сравнивали токсическое действие культурального
фильтрата гриба и токсина "миланин" на 9 сортах пшеницы.

Первичным эксплантом служили изолированные незрелые зародыши, которые культивировали на питательной среде МС, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 мг/л, с целью получения первичной каллусной ткани. Учет действия КФ и токсина осуществляли на 9-ый день после посадки. Авторы пришли к выводу, что КФ имеет большее токсическое действие на зародыши, чем токсин "миланин". Использование КФ даже в концентрации 10% было токсичным для зародышей для всех исследуемых генотипов пшеницы. Исходя из этого, в своих дальнейших исследованиях по клеточной селекции Келлер В. и др. использовали только КФ гриба {Keller, Winzeler, et all, 1994).

Американскими учеными проведена работа по клеточной селекции сельдерея к грибу Septoria apicola с использованием каллусной и суспензионной культур, которые были получены из молодых черешков. В качестве селектирующего фактора применяли КФ гриба или совместное культивирование эксплантов с патогеном. В результате проведенной работы были получены растения-регенеранты, устойчивые к Septoria apicola {Evenar, Pressman et all, 1994).

Семал Д. и Визер Д. в результате клеточной селекции пшеницы на устойчивость к септориозу получили растения-регенеранты. Однако

анализ, полученных растений не был проведен (Semal, Viseur et all, 1988).

Важным представляется изучение корреляции устойчивости к патогену у растений и культивируемых in vitro клеток. Так, А.Варди с соавт. предостерегает использовать КФ Phytophtora citrophthora в качестве селективного фактора для отбора in vitro устойчивых клеток лимона. Чувствительность четырех исследуемых сортов лимона к КФ была противоположной тому, что наблюдалось при тестировании этих сортов in vivo и, таким образом, указывало на непригодность КФ данного патогена как селективного агента. Подобные результаты получены и для других культур. Вероятно, это связано с тем, что в данных работах не был отработан способ получения КФ и не изучено проявление его инфекционных свойств, которые зависят от ряда факторов (Масленников, 1995,^^,1986,^^/(25, Grafton, 1992).

В противоположность негативным результатам для многих комбинаций патоген-хозяин селекция in vitro к КФ является положительной. Например, прямая корреляция отмечалась у гвоздики между устойчивостью in vivo к Fusarium и на уровне клеток к КФ этого патогена. Во ВНИИ кормов установлено, что в потомстве растений-регенерантов клевера лугового, полученных после селекции in vitro, показатель устойчивости к раку растений колебался от 1 до 70% (Плащев, 1987, Солодкая, Новоселова, 1989).

В настоящее время известно незначительное количество работ по селекции in vitro на устойчивость к альтернариозу. Например, в результате селекции in vitro на основе высокочувствительного к А. solani сорта Талалихин-186 получены формы томата, устойчивые к КФ этого гриба. Установлено, что устойчивость к A. solani сохраняется в 1-м и 2-м потомстве от самоопыления растений-регенерантов. КФ гриба

получали путем выращивания A. solani с каллусной тканью томата в течение 6 суток. Такой нетрадиционный подход в получении КФ связан с тем, что развиваясь совместно с каллусными клетками, гриб A. solani синтезирует больше экзометаболитов, которые образует патоген при поражении растений (Аврова, 1994).

Аналогичные исследования были проведены на хлопчатнике, а также на моркови. Для моркови селекция in vitro проводилась с использованием КФ таких патогенов как A. alternata, A. clauca, A. dauci, A. solani (Угарова, Тесля, 1994, Kurasaki, Tashiro, Nishi, 1987, Nascaril, Broggio, 1990, Tulkowska, 1974, 1995). Работы по селекции in vitro к A. radicina не встречаются.

Интерес к работам по клеточной селекции в последнее время возрастает и имеются положительные примеры применения КФ в качестве стресс-фактора в селекции растений на устойчивость к болезням (табл. 3).

Таблица 3

Клеточная селекции на устойчивость растений к КФ патогенов

Селекция растений к патотоксинам.

Многие фитопатогенные грибы образуют опасные для теплокровных токсины, загрязняющие продукцию растениеводства и животноводства. Например, подавляющее большинство штаммов грибов родов фузариум, аспергиллус и пенициллиум, образуют микотоксины и заражают широкий круг диких и культурных растений. Вместе с тем, токсины фитопатогенных грибов играют важную роль в патогенезе многих заболеваний растений. Почти все известные микотоксины являются комплексом компонентов, близких по химической природе, но обладающих различной биологической активностью. Токсины многих видов грибов, как и антибиотики, применяют в биохимических исследованиях в качестве более или менее специфических ингибиторов отдельных биохимических процессов (Дудка и др., 1982).

Перспективным методом селекции растений in vitro на устойчивость к болезням является метод, основанный на использовании в качестве селективного агента патотоксинов синтезируемый патогенами. Применение токсинов в качестве заменителей живых культур удобнее, проще, эффективнее по следующим причинам: ускоряется процесс отбора при селекции на устойчивость, поскольку реакция растений на токсин проявляется непосредственно после

обработки; обеспечиваются стандартные условия заражения: реакция растений на токсин в меньшей степени зависит от окружающей среды; появляется возможность контролировать стабильность условий проведения опытов, потому что токсин можно выделить, накопить и хранить в нужных количествах, используя точные дозировки (Балашова и др., 1986, Никуленко, Чкаников, 1987, Простакова и др., 1992).

Роль токсинов в болезнях растений до конца пока не ясна. Известно, что незначительное количество патотоксинов играет существенную роль в инициации или развитии болезни. По их действию некоторые авторы условно делят патотоксины на три категории (Симонян, Адешвили, 1988, Сидоров, 1990, Fish, Gones, 1988). К первой относятся токсины, которые не являются определяющими в заболевании, но они обладают неспецифическим токсическим действием по отношению к хозяину и токсичны для широкого круга растений. Примером может служить табтоксин, продуцируемый Pseudomonas cyriugae pv. tabaci, являющийся возбудителем бактериальной рябухи табака (Никуленко, 1987, Foroughi, Stalle, Nachr, 1985).

Вторая категория патотоксинов обладает такой же специфичностью по отношению к растениям, как и патоген, но они также не ответственны за развитие болезни. Сюда относится Г-токсин Drechslera maydis расы Т, патоген, вызывающий гельминтоспориоз кукурузы. Раса О D. Maydis не продуцирует Г-токсин, но все же обладает патогенным эффектом, хотя симптомы болезни менее значительны. Раса Т патогена образует Г-токсин, который специфичен для растений кукурузы, несущих цитоплазматический ген Ттз. ответственный за цитоплазматическую мужскую стерильность. Растения

с нормальной цитоплазмой не поражаются токсином (Никуленко, 1987, Сидоров, 1990).

Третья категория включает патотоксины, которые

хозяиноспецифичны и вызывают типичные признаки болезни. Хорошим примером являются 10-викторин - токсин Drechslera victoriae -возбудитель гельминтоспороза овса, вызывающий корневую гниль и пятнистость листьев. Специфичность токсина зависит от присутствия у хозяина гена Victoria, отвечающего за устойчивость к Puccinia coronata.

Выбор схем клеточной селекции на устойчивость растений к патогенам может непосредственно зависеть от механизмов действия токсинов. Отдельные виды патогенов поражают клетки, а затем выделяют токсин. Другие - сначала выделяют токсины, которые убивают клетки, а затем используют продукты их распада для питания. Естественно, в первом случае не будет наблюдаться корреляции между устойчивостью in vitro и in vivo. Проведение селекции на клеточном уровне целесообразно лишь во втором случае (Мезенцева, 1990, 1991, Brunok, Smolka, 1981, Jensen, 1986) .

В настоящее время из патогенов растений выделено большое количество различных токсических или биологически активных веществ, действие которых схоже с природными патотоксинами (табл. 4). У ряда видов рода Alternaria были получены и изучены фитотоксины: АК (A. kikuchiana), AM (A. mali), AC ( A. citri), AL (A. alternata), AF (A. frarania), AL (A. longipes), AS (A. solani). Однако они не являются определяющими в заболевании, обладают неспецифическим токсическим действием к хозяину и токсичны для широкого круга растений. На их фоне нельзя проводить отбор устойчивых форм. Поэтому целесообразно использовать культуральный фильтрат

патогена, содержащий значительное количество метаболитов гриба (Никуленко,1987, Магди Гад Аль-Раб, 1992).

Таблица 4

Токсические и биологически активные вещества, продуцируемые патогенами
растений.

Возможность отбора in vitro растений, устойчивых к болезням, впервые продемонстрирована П. Карлсоном в 1973 году, который, проводя селекцию табака на устойчивость к метионинсульфоксимину ( аналог таботоксина ), получил клеточные линии, а затем растений с повышенной устойчивостью к патогену. Некоторые результаты исследований по клеточной селекции на устойчивость к патотоксинам приведены в таблице 5.

В селекционной практике в основном применяют хозяин-специфические токсины, вызывающие такие же внешние симптомы и биохимические изменения, как грибы, их продуцирующие. Токсины используются с целью отбора устойчивых к заболеванию форм у различных культур. Например, были получены устойчивые формы гвоздики, томатов, люцерны, клевера к фузариозу, путем культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений на средах, содержащих фитотоксические вещества рода Fusarium {Hartman, McCoy, Knous, 1984, Toyoda, Tanaky, Hirai, 1984). Для

гвоздики подтверждено существование корреляции между устойчивостью к токсину in vitro и полевой устойчивостью полученных растений-регенерантов.

Таблица 5

Примеры клеточной селекции на устойчивость к патотоксинам

Для ряда культур (томаты, картофель, ячмень ) отбор устойчивых форм на клеточном уровне осуществляется так же с использованием в качестве селективного фактора фузариевой кислоты ( 5-н бутил-2-пиридин-карбоновая кислота). Эта кислота синтезируется различными видами фузариев ( Davis, 1969; Arcioni, Pezzotti, Damiani, 1987). Японские исследователи {Toyoda et al, 1984) проводили отбор каллусной ткани томатов, обладающих устойчивостью к фузариевой кислоте. Установлена идентичность этого соединения, полученного из КФ гриба Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici и коммерческого

препарата фирмы Sigma. На каллусных клетках, культивируемых на агаризованной среде МС, изучен дозовый эффект фузариевой кислоты.

Клетки инкубировали 1-3 дня при непрерывном освещении (3-4 тыс. лк)

о и температуре 26 С, а затем окрашивали флюоресцеином диацетатом

(0,01%) для определения жизнеспособности. Результаты тестирования

показали, что 70 мкМ фузариевой кислоты достаточно, что бы убить

практически все клетки. Отдельные клетки, высеянные на эту среду,

начинали делиться через 4-6 дней, а через 30-40 дней образовывали

каллусную ткань размером 3-4 мм. После пяти пассажей на селективной

среде, каллусы переносили на среду без токсина. Через 5-12 дней масса

каллусной ткани на этой среде удваивалась, что соответствовало

скорости роста исходной каллусной ткани. Отобранные на

устойчивость к фузариевой кислоте каллусы переносили на среду,

содержащую КФ патогена (50%). Установлено, что в этих условиях

каллусная ткань не была способна к пролиферации. По-видимому, это

связано с тем, что в состав КФ наряду с фузариевой кислотой входят и

другие токсические экзометаболиты патогена.

В работе ученых из Института генетики (Грюнбах) изучена

возможность отбора резистенных каллусов ячменя на среде с

добавлением фузариевой кислоты (Chawia, Wensel, 1987). Каллусные

культуры получали из 7-10-дневных незрелых зародышей сорта Dissa и

гибрида W 193 на среде В с 2 мг/л 2,4 -Д. Предварительно были

проведены исследования по изучению воздействия фузариевой кислоты в концентрации 0,1-2 мМ на каллусогенез ячменя вышеназванных генотипов. После 3-недельной инкубации каллусной ткани в этих условиях отмечено, что при использовании токсина в концентрации 0,8 мМ наблюдалась гибель около 80% каллусов. Эта концентрация была выбрана авторами как селективная. Для проведения клеточной селекции

использовали 3-4-месячные каллусы, которые после четырех циклов отбора помещали на среду без токсина или постоянно культивировали с фузариевой кислотой. После первого цикла селекции погибало около 75% каллусов, а после второго - 5-10%. В дальнейшем ( третий и четвертый пассаж ) отмечали устойчивость отобранной ткани к воздействию токсина. Отобранные на селективной среде каллусы размножали на среде без токсина. Резистентные клетки сохраняли свою устойчивость при 3-х месячном субкультивировании на среде без токсина. После четырех циклов селекции отобрано 8 и 11 % резистентной каллусной ткани сорта Dissa и W 193, соответственно. Хорошо пролиферирующую каллусную ткань помещали для регенерации на среду В₅ с 0,4 мг/л НУК и 1 мг/л бензиламинопурина ( БАП). Из устойчивых каллусных линий сорта Dissa было регенерировано 23 зеленых растения, а из линий W 193 - 8 растений -альбиносов.

Во ВНИИльна проведены исследования по культивированию изолированных пыльников и каллусной ткани льна-долгунца на питательных средах, содержащих в качестве селективного агента фузариевую кислоту. В результате отбора получены растения-регенеранты, характеризующиеся высокой комплексной устойчивостью в полевых условиях к фузариозу и ржавчине. Вместе с тем было показано, что растения-регенеранты во втором-четвертом поколении существенно превосходили исходные генотипы и сорт-стандарт Алексим по семенной продуктивности, а также массе волокна и массе технической части стебля (Поляков, 2000, Пролетова, 2002).

Сложность применения токсина в клеточной селекции была выявлена в работе Г. Рассадиной и Л. Хромовой (1987), использовавших метод клеточной селекции для получения картофеля, устойчивого к кольцевой

гнили, вызываемой Corinebacterium sepedonicum. В качестве селективного фактора применяли грубо очищенный токсин этой бактерии, вызывающий те же симптомы заболевания, что и сам патоген. На питательную среду, содержащую разные концентрации токсина, высевали клетки двух сортов картофеля - более устойчивого и неустойчивого к патогену. На клеточном уровне различие их в устойчивости к токсину коррелировало с устойчивостью растений к патогену. Были отобраны стабильно устойчивые клеточные клоны и на их основе получены растения. Однако не все растения из стабильных клонов были устойчивы к токсину, и не все растения, устойчивые к токсину, оказались устойчивыми к самому патогену. Более того, авторам удалось обнаружить среди растений-регенерантов, полученных из каллусных клеток не прошедших селекцию, сомаклоны, устойчивые к токсину и патогену. Эти данные свидетельствуют о сложности оценки результатов клеточной селекции в случае использования растений с высоким уровнем сомаклональной изменчивости in vitro.

Анализируя имеющиеся в литературе данные по применению методов клеточной селекции для получения устойчивых к патогенам растений следует отметить, что практически все существующие схемы клеточной селекции на устойчивость к патогенам характеризуются существенным недостатком, так как рассчитаны на создание устойчивости, как правило, лишь к одному определенному токсину или его аналогу. Поэтому актуален поиск новых оригинальных и более эффективных схем селекции на устойчивость к патогенам, особенно на комплексную устойчивость к нескольким патогенам.

Достижения и проблемы традиционной селекции растений применительно к изучаемым объектам

Одним из важных направлений современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Эпифитотийный характер распространения наиболее опасных грибных, вирусных и бактериальных заболеваний культурных растений, уничтожающих до 30% (а иногда и более)

урожая, создали в России и ряде других стран мира ситуацию, при

которой потребность в обновлении сортовых ресурсов сельскохозяйственных культур на основе сочетания традиционных методов селекции и новых методов биотехнологии стала исключительно острой (Шевелуха, 1992, Шевелуха, Калашникова, Воронин и др., 2003). Посевы пшеницы, ячменя и других зерновых культур на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются комплексным заболеванием - корневыми гнилями, а также ржавчинами, септориозом, гельминтоспориозом, мучнистой росой и др. Поражение посевов озимой пшеницы фузариозом колоса ( Fusarium nivale) на Северном Кавказе приводит к накоплению в зерне опасных для здоровья людей и животных микотоксинов. В отдельные, влажные годы этой болезнью поражается половина собранного урожая зерна (Дьяков, Озерецковская, Джавахия, Багирова, 2001). Поражение подсолнечника в этой зоне склеротинией и фомопсисом в годы пониженной температурой и повышенной влажностью среды возрастает до 50% и более. Картофель и томаты повсеместно поражаются фитофторозом, что резко снижает урожай этих ценных продовольственных культур и приводит к большим потерям при хранении (Шевелуха, 1991).

Огромный урон отечественному картофелеводству нанесла вспышка вироидности. Наиболее широко распространился вирой д веретеновидности картофеля (ВВКК), вспышка которого произошла в

90-х годах прошлого столетия в основном в районах Поволжья и

Северного Кавказа. Это заболевание приводит к быстрому вырождению сортов, а при сильной степени заражения к 100%-й потери продуктивности. ВВКК обладает высокой инфекционностью и очень устойчив к повышенной температуре (не гибнет при 100 С) и к спиртам (Леонова, Шалдяева, Гуркин, 2002). Способов борьбы с данным заболеванием нет. Поэтому основным направлением в селекции картофеля является создание сортов, устойчивых к вирусным и грибным заболеваниям.

Несмотря на негативные явления в сельком хозяйстве России отрасль овощеводства в целом выдержала испытание и в последние годы

ІІ наращивает производство. Критическими для отрасли по объему

производства овощей были 1991-1995 гг., когда валовой их сбор в стране составил 91% от уровня дореформенного периода, а в последние 4 года (1999 - 2002 гг.) объемы их производства в открытом грунте существенно увеличились и составили в среднем 110-119%.

Одним из важнейших направлений повышения эффективности овощеводства является сортовой состав отрасли, селекция. По имеющимся оценкам, вклад селекции в повышение урожайности оценивается в 30-40%». В овощеводстве России с ее громадным разнообразием и жесткостью природных условий роль сорта многократно возрастает. В XX веке в отрасли создан уникальный генофонд овощных культур, который насчитывает более 1600 сортов и гибридов. Из них 63% отечественных и 37% иностранных, которые, в целом, обеспечивают спрос и позволяют создавать конвейер поступления продукции (Литвинов, 2003).

Как правило, гибридный генофонд в отрасли - это принципиально новые формы растений с четко выраженными адаптивными свойствами, более выровненные, имеющие на порядок лучший товарный вид, более продуктивны и качественны, более востребованы на рынке овощей. Имеются и узкие места селекции растений в этой области. Например, нет сортов и гибридов томата для открытого грунта южных регионов, Урала и Сибири, прекращена селекция данной культуры на пригодность к механизированной уборке и на повышенное содержание сухого вещества; на нуле селекция цветной и малораспространенных разновидностей капусты; имеются сложности с селекцией лука репчатого, особенно для подзимнего посева в южных регионах страны. Аналогичная ситуация с корнеплодами - морковью и свеклой, луком пореем, салатом и др.

Таким образом, стратегическая задача селекции для промышленного овощеводства состоит в создании сортов и гибридов с четко выраженными адаптивными свойствами, устойчивых к стрессам, болезням и вредителям, обладающих низкой способностью к накоплению нитратов, тяжелых металлов, радионуклидов, с хорошей сохраняемостью питательных свойств и товарных качеств (Васильев, 1989).

Объекты исследований

Объектом исследования служили: пшеница, морковь и картофель.

Исследования с яровой мягкой пшеницей проводили на 8 генотипах, обладающих различной устойчивостью к Septoria nodorum Berk. К устойчивой группе относятся - WW-15370, Gaterin, 81S-8, 9IS-10; среднеустойчивой - Московская 35, Энита; неустойчивой - Саратовская 29, Fortuna. Семена, всех изучаемых генотипов, предоставлены сотрудниками кафедры селекции и семеноводства полевых культур МСХА им К.А.Тимирязева.

Эксперименты с морковью проводили на 6 генотипах, обладающих различной полевой устойчивостью к грибу Alternaria radicina М, Dr. et Е. К среднеустойчивой группе относятся - 906, 805, неустойчивой -Rondo, 225П, 6700, 1268. Семена всех изучаемых генотипов предоставлены сотрудниками лаборатории селекции и семеноводства овощных культур Всесоюзного научно-исследовательского института овощеводства.

Исследования с картофелем проводили на 4 генотипах, обладающих различной устойчивостью к патогену Rhizoctonia solani Kuhn: среднеустойчивые - Жуковский ранний, Удача, средневосприимчивые -Невский, Дезире.

Пробирочные растения предоставлены сотрудниками Научно-исследовательского института картофельного хозяйства.

2.1.1. Культура клеток и ткани яровой пшеницы. В качестве первичного экспланта использовали зрелые и незрелые зародыши, а также семена пшеницы. Каллусную ткань получали из зрелых и незрелых зародышей, изолированных с растений после начала цветения на 14-16 день, а так же из базальной части флагового листа проростков. Изолирование зародышей осуществляли только из зерновок, располагающихся в средней части колоса.

Стерилизация семян (зрелые зародыши). Растительный материал обрабатывали 10% раствором КМп04 в течение 45 минут, после чего зерновки промывали проточной водой и оставляли на ночь (12-15 часов) в воде, что обеспечивало их набухание и облегчало процесс изолирования зародышей. После этого в стерильных условиях проводили повторную стерилизацию материала 0,1% раствором сулемы в течение 45 мин, после чего зерновки трижды промывали стерильной дистиллированной водой.

Стерилизация семян (незрелые зародыши). Зерновки освобождали от покрывающих чешуи, помещали в марлевые мешочки и стерилизовали 0,1% раствором сулемы в течение 15 мин, а затем промывали стерильной водой 3 раза. Изолирование зародышей проводили с помощью металлических игл в стерильных условиях. Посадку зародышей осуществляли горизонтально, щитком вниз на агаризованную питательную среду по 20 шт. в одну чашку Петри.

Листовые экспланты изолировали из стерильных проростков, которые получали путем выращивания in vitro зерновок на модифицированной безгормональной питательной среде Мурасига и Скуга. В качестве первичного экспланта для индукции каллуса использовали базальную часть флагового листа. Изучали зависимость этого процесса от размера первичного экспланта и времени выращивания проростков (от 3-х до 14-ти дней) in vitro. Изолированные листовые сегменты размером 3-5 мм помещали на твердые питательные среды в чашки Петри по 15 шт. в каждую.

В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА принципов стерилизации питательных сред, инструментов и посуды, изложенных в "Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии" (1996).

Условия получения и культвирования каллусной ткани. Для индукции каллуса и ее субкультивирования использовали модифицированную питательную среду Мурасига и Скуга (1962), содержащую аспарагин -120 мг/л, нитрат серебра - 10 мг/л, сахарозу 2% и агар 0,7%. В качестве веществ ауксинового типа действия испытывали 2,4-Д в различных концентрациях (2, 3, 4, 5 мг/л) в сочетании с цитокининами: кинетин (0,5 мг/л), зеатин (0,5 мг/л), 6-бензиламинопурин (БАП) (0,5 мг/л), а также с биологически активными веществами: кризацин, фумаран и эмистим в концентрациях 0,1-100 мг/л.

Культивирование эксплантов и каллусной ткани проводили в о климатических камерах, где поддерживалась температура 25 С, относительная влажность воздуха 70%, 16-часовой фотопериод и интенсивность освещения 3 тыс. лк.

Пересадку каллусной ткани осуществляли один раз в месяц, при этом учитывали следующие показатели: число эксплантов, образующих каллус (%), интенсивность каллусогенеза (балл), фрмирование морфогенного и неморфогенного каллуса (%), прирост сырой массы (мг), цвет и консистентность.

Пшеница

Клеточная и тканевая селекция базируется на культивировании в стрессовых условиях in vitro каллусных и суспензионных клеток. Однако клетки, прошедшие цикл селекции in vitro, как правило, частично или полностью теряют способность к морфогенезу. Получение устойчивых растений к стрессовому фактору является необходимым и главным условием селекционного процесса. Поэтому изучение влияния генотипа, состояния первичного экспланта и гормонального состава питательной среды на процесс каллусогенеза и морфогенеза, является первостепенной задачей при проведении работ по клеточной селекции. Для пшеницы эти работы являются особенно актуальными, что объясняется большой зависимостью регенерационного потенциала ее клеток и тканей от генотипа и продолжительности их культивирования in vitro (Сидоров, Моргун, Логвиненко, 1988, Шаяхметов, Иштерякова, Хабирова, 1988).

Для злаков источником индукции каллуса, способного к регенерации растений, могут быть апикальные меристемы, мезакотиль проростка, зрелые и незрелые зародыши, незрелые соцветия, интеркалярная меристема листа, микроспоры. Среди перечисленных эксплантов пока только незрелые зародыши могут быть с успехом использованы для индукции каллусной ткани, как надежной системы получения растений-регенерантов.

Впервые о регенерации растений в культуре незрелых зародышей сообщил Grenn в 1975 году и с тех пор этот эксплант стал одним из наиболее часто используемых в работе со злаками (Иванов, 2001). В первую очередь это относится к пшенице, овсу, ячменю, тритикале, для которых получены фертильные растения-регенеранты в культуре незрелых зародышей.

. Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов.

Необходимым условием использования каллусных клеток с целью повышения генетического разнообразия и улучшения сельскохозяйственных культур является их способность к регенерации растений. Поэтому на первом этапе работы по клеточной селекции особое внимание следует уделять изучению образования каллусной ткани и зависимости этого процесса от генетических и физиологических факторов.

Зрелые и незрелые зародыши 8 исследуемых генотипов пшеницы культивировали на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 мг/л (табл. 6). Эта среда была выбрана в качестве базовой, универсальность которой экспериментально доказана различными авторами для получения каллусной ткани из зародышей злаковых культур (Еаттатохоттам, 1991, Диас, 1994, Нгуен Тхи Ли Ань, 1995, Иванов, 2001).

Наши исследования показали, что под влиянием 2,4-Д клетки зрелого и незрелого зародыша неорганизованно делятся, образуя каллусную ткань, состоящую из рыхлых, оводненных и более плотных, структурированных участков с выраженными меристематическими очагами (Рис.1). Независимо от возраста первичного экспланта наблюдалось развитие зародышей в проростки. Причем в случае использования зрелых зародышей этот процесс происходил более

Похожие диссертации на Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням

Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезнямПопадьин Павел Владимирович

Поиск изоферментных маркеров многолетности и устойчивости к грибным болезням у ржи (Secale L. )Забродина Марина Владимировна

Разработка методов селекции и повышения продуктивности штаммов-продуцентов эргоалкалоидов в сапрофитных условиях культивированияБарсегян Антон Геворкбекович

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенамХалилуев, Марат Рушанович

Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены : экспрессия и устойчивость к фитопатогенным грибамШукуров, Рахим Рахманкулыевич

Роль белкового ингибитора полигалактуроназы в устойчивости растений к болезнямБуза Наталья Леонидовна

Биологические особенности сортов яровой пшеницы как исходного материала для селекции на продуктивность и устойчивость к болезням в степной зоне Южного УралаСасин Игорь Александрович

Использование молекулярно-генетических маркеров у яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом для идентификации хромосомных перестроек и генов устойчивости к болезнямГайнуллин Наиль Рифкатович

Генетическое разнообразие пшеницы и ячменя по эффективной устойчивости к болезням и возможности его расширенияТырышкин Лев Геннадьевич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОККОМИКОЗА ВИШНИ , И ИСТОЧНИКИ УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНИЩекотова, Людмила Алексеевна