Содержание к диссертации
Введение
1. Генетика устойчивости пшеницы и ячменя к болезням (обзор литературы) 11
1.1. Генетический контроль ювенильной устойчивости пшеницы к листовой ржавчине 11
1.2. Генетический контроль устойчивости ячменя к карликовой ржавчине 17
1.3. Генетическое разнообразие пшеницы и ячменя по устойчивости к болезням, вызываемым Bipolaris sorokiniana 20
1.4. Генетика устойчивости пшеницы к Stagonospora nodorum 33
1.5. Сомаклональная изменчивость пшеницы и ячменя по
устойчивости к болезням 37
2. Условия, материал и методы исследований 52
2.1. Условия и климатические особенности районов проведения экспериментов 52
2.2. Материал исследований 53
2.3. Методы исследования 54
2.3.1. Оценка устойчивости образцов к листовым ржавчинам 54
2.3.2. Оценка устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости 59
2.3.3. Оценка устойчивости образцов к обыкновенной корневой гнили 69
2.3.4. Оценка устойчивости образцов к септориозу.. 70
2.3.5. Гибридологический анализ 71
2.3.6. Молекулярный анализ образцов, устойчивых к листовой ржавчине 73
2.3.7. Получение сомаклонов ячменя и пшеницы 74
2.4. Статистическая обработка данных 76
3. Генетическое разнообразие образцов родов Triticum L.,Aegilops L. и Hordeum L. коллекции ВИР по устойчивости к болезням 77
3.1. Влияние бензимидазола на поражаемость пшеницы болезнями 77
3.2. Генетический контроль высокоэффективной устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине 93
3.3. Устойчивость видов рода hordeum к карликовой ржавчине .124
3.4. Устойчивость Triticum aestivum и Hordeum vulgare к болезням, вызываемыми, sorokiniana 132
3.4.1. Устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости 132
3.4.2. Устойчивость образцов к обыкновенной корневой гнили 139
3.5. Устойчивость Triticum aestivum к септориозу 141
3.6. Ювенильная устойчивость видов родов Aegilops L. и Triticum L. к болезням 144
4. Индукция сомаклональной изменчивость как возможный способ получения устойчивых к болезням генотипов пшеницы и ячменя 166
4.1. Отбор in vitro на устойчивость к токсинам В. sorokiniana 166
4.2. Сомаклональная изменчивость пшеницы и ячменя по устойчивости к болезням 170
Заключение 186
Выводы 190
Практические рекомендации 192
Литература
- Генетический контроль устойчивости ячменя к карликовой ржавчине
- Оценка устойчивости образцов к листовым ржавчинам
- Генетический контроль высокоэффективной устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине
- Сомаклональная изменчивость пшеницы и ячменя по устойчивости к болезням
Введение к работе
Актуальность исследований. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) и ячмень (Hordeum vulgare L.) - важнейшие зерновые культуры в мировом сельскохозяйственном производстве (Дорофеев и др., 1979; Дорофеев и др., 1987; Лукьянова, Кобылянский, 1990). Одним из главных факторов снижения урожая и его качества у этих культур является поражение грибными болезнями. Наиболее экономически выгодный и экологически безопасный способ защиты от болезней - возделывание устойчивых сортов (Рассел, 1982). На первом этапе селекции таких сортов необходим поиск доноров устойчивости, т.е. форм, защищенных ранее не использованными генами устойчивости, способных легко передавать признак при гибридизации.
Бурая или листовая ржавчина пшеницы (возбудитель Puccinia recondita f.sp. tritici Erikss.), карликовая ржавчина ячменя (P. hordei Otth.), септориоз колоса пшеницы (Stagonospora nodorum Berk.), темно-бурая листовая пятнистость и обыкновенная корневая гниль (Bipolaris sorokiniana Shoem.) -вредоносные болезни во многих регионах возделывания этих культур (Русаков, 1938; Щекочихина, 1978; Пыжикова, 1987; Хасанов, 1992). Экономическая значимость данных болезней обусловила проведение многочисленных экспериментов по изучению устойчивости, наследованию признака, а в ряде случаев и к идентификации эффективных генов устойчивости. Следует особо отметить, что в нашей стране большая часть таких исследований проводились достаточно давно (Трофимовская и др., 1972; Мягкова и др., 1981; Одинцова и др., 1990; Макарова и др., 1993; Максимов, 1994), так что выделенные источники и доноры устойчивости в настоящее время могут быть восприимчивыми в результате накопления в популяциях возбудителей вирулентных либо более агрессивных генотипов патогенов. Кроме того, в том случае, когда устойчивость оценивали на естественных инфекционных фонах, неравномерное распределение инфекции могло привести к случайной классификации восприимчивых генотипов как устойчивых. При изучении ювенильной устойчивости пшеницы и ячменя в
нашей стране нашел широкое распространение «бензимидазольный» метод, при котором инокулируют патогенами отрезки листьев растений, помещенных на субстраты, содержащие бензимидазол (Михайлова, Квитко, 1970; Михайлова, Афанасенко, 2005). Однако до нашей работы практически отсутствовали данные о влиянии данного химиката на устойчивость. И, наконец, при выявлении новых генов устойчивости (в первую очередь пшеницы к листовой ржавчине) разные группы отечественных исследователей проверяли их идентичность генам, известным по зарубежным публикациям, но не тем генам, которые идентифицированы в СССР и России (Михайлова и др., 1987; Кривченко и др., 1990; Mikhailova, Gultyaeva, 1996; Вьюшков и др., 2003; Михайлова, 2003). В связи с вышеизложенным, необходима переоценка выделенных ранее источников и доноров устойчивости, оценка устойчивости новейших поступлений коллекции, а также изучение генетического контроля у выделившихся форм.
Родственные виды пшеницы и ячменя рассматриваются как резервуар генов устойчивости к болезням, которые могут быть переданы в генофонд культурных видов при использовании интрогрессивной гибридизации (половой или соматической). Те же причины, которые обуславливают необходимость изучения устойчивости мягкой пшеницы и культурного ячменя, действительны и для их сородичей.
С начала 80-ых годов прошлого столетия одним из перспективных методов получения устойчивых к болезням форм растений рассматривается индукция сомаклональной изменчивости (Larkin, Scowcroft, 1981). Полученные к настоящему времени результаты по изучению диапазона сомаклональной изменчивости пшеницы и ячменя по устойчивости к грибным болезням крайне противоречивы: от отрицания перспективности данного подхода в получении селекционно-ценного материала до утверждения о возможности выделения гомозиготно устойчивых форм уже в первых поколениях самоопыления регенерантов.
Цель работы - выявление генетического разнообразия пшеницы, ячменя
и их сородичей по устойчивости к вредоносным болезням и определение возможности его расширения за счет мутационного процесса в культуре in vitro.
Для выполнения работы необходимо было решить следующие задачи:
модифицировать методы изучения ювенильной устойчивости пшеницы и ячменя к листовым болезням и ее генетического контроля;
оценить эффективность ранее выделенных источников устойчивости пшеницы и ячменя к листовым ржавчинам, темно-бурой листовой пятнистости, обыкновенной корневой гнили и пшеницы - к септориозу;
изучить наследственное разнообразие по устойчивости коллекционных образцов видов родов Triticum L., Aegilops L. и Hordeum L. к болезням;
- исследовать генетический контроль устойчивости коллекционных
образцов мягкой пшеницы и культурного ячменя;
- изучить возможность использования отбора in vitro на устойчивость к
токсинам В. sorokiniana для получения растений, резистентных к болезням,
вызываемым данным патогеном;
- оценить сомаклональную изменчивость пшеницы и ячменя по
устойчивости к болезням и изучить генетический контроль устойчивости
сомаклонов пшеницы и ячменя к болезням.
Положения, выносимые на защиту
1. Система тестов для изучения генетического контроля высокоэффективной
устойчивости пшеницы и ячменя к болезням.
Узость генетического разнообразия мягкой пшеницы и культурного ячменя по эффективной устойчивости к изучаемым болезням (листовые ржавчины, темно-бурая листовая пятнистость, обыкновенная корневая гниль и септориоз пшеницы).
Устойчивые к болезням образцы D-геномной группы рода Aegilops L., родов TriticumL. и Hordeum L., перспективные для интрогрессивной гибридизации.
4. Специализированная форма возбудителя листовой ржавчины эгилопсов D-
геномной группы, непатогенная на мягкой пшенице.
5. Полученные с использованием культуры in vitro линии пшеницы и
ячменя с высоким уровнем частичной устойчивости к болезням.
Научная новизна. Впервые показано, что химическое вещество (бензимидазол) вызывает генотип-специфическую индукцию ювенильной устойчивости пшеницы к листовой ржавчине, септориозу и темно-бурой листовой пятнистости.
Из мировой коллекции ВИР выделено 90 образцов мягкой пшеницы, высоко устойчивых к листовой ржавчине. С помощью гибридологического анализа, STS - анализа или фитопатологического теста изучен генетический контроль устойчивости к ржавчине у 74 образцов: 19 форм защищены геном Lr9,17 форм - геном Zrl9, 37 - геном Lr24,1 - геном 1г41.
Идентифицировано 2 гена ювенильной устойчивости пшеницы к септориозу, по одному - к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили.
В результате изучения наследственного разнообразия рода Triticum и D-геномной группы рода Aegilops выделены образцы Ае. tauschii и Ае. cylindrica, Т. boeoticum, Т. timopheevii, Т. araraticum, Т. топососсит, обладающие ювенильной устойчивостью к листовой ржавчине, септориозу либо темно-бурой листовой пятнистости. Все высокоустойчивые к листовой ржавчине образцы Ае. tauschii и Ае. cylindrica, защищены геном Lr41.
В результате изучения наследственного разнообразия рода Hordeum выделены образцы Н. agriocrithon, К spontaneum, Н. murinum, Н. marinum и Н. bulbosum, обладающие устойчивостью к карликовой ржавчине либо корневой гнили. Образцы Н. vulgare, высокоустойчивые в ювенильной стадии к карликовой ржавчине, защищены геном Rphl\ образец NB-3002 обладает эффективным геном (генами) взрослой устойчивости.
Идентифицированы 3 рецессивных и 6 доминантных генов устойчивости ячменя к темно-бурой листовой пятнистости; только ген Rcs5 детерминирует высокий уровень резистентности.
Отбор in vitro на устойчивость к токсинам В. sorokiniana приводит к созданию устойчивых каллусных линий пшеницы. Регенераты из этих клеточных линий восприимчивы к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили.
Полинейный отбор в потомстве регенерантов пшеницы и ячменя позволил выделить линии с высоким уровнем частичной устойчивости к болезням; устойчивость созданных линий контролируется не менее чем 3-мя генами.
Практическая ценность и реализация результатов исследований. Обоснована необходимость расширения генетического разнообразия пшеницы и ячменя по устойчивости к изучаемым болезням. Выделены коллекционные образцы, имеющие известные эффективные гены устойчивости к ржавчинам, которые могут быть использованы в качестве доноров этих генов. Выделены образцы Ае. tauschii, Т. boeoticum, Т. monococcum, Т. araraticum и Т. timopheevii, которые могут быть рекомендованы для интрогрессивной гибридизации с мягкой пшеницей; образцы Н. agriocrithon, Н. spontaneum и Н. bulbosum - для интрогрессивной гибридизации с культурным ячменем. Доказана нецелесообразность изучения устойчивости к листовой ржавчине пшеницы у образцов D-геномной группы рода Aegilops на естественных инфекционных фонах. Выделенные высокоустойчивые к болезням сомаклоны ячменя и пшеницы рекомендованы для использования в селекции.
Материалы диссертации используются в учебном процессе Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. Сомаклональные линии переданы в Самарский НИИСХ, сорта пшеницы с идентифицированными генами устойчивости к листовой ржавчине - в СибНИИРС. Формы пшеницы, высокоустойчивые к листовой ржавчине и темно-бурой листовой пятнистости, используются в селекции пшеницы и тритикале на ДОС ВИР.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на или
представлены на:
Всесоюзных совещаниях по иммунитету с.-х. растений к болезням и вредителям (Рига, 1986, Минск, 1991);
съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987, Минск, 1992);
конференции «Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды» (Иркутск, 1991);
- международных конференциях «Генетические коллекции,
изогенные и аллоплазматические линии» (Новосибирск, 1993,2001);
Национальном симпозиуме по иммунитету растений к болезням и вредителям (Болгария, 1994);
съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994, Санкт-Петербург, 2000);
-XIV Конгрессе ЕУКАРПИЯ (Финляндия, 1995);
XIII Международном конгрессе по защите растений (Голландия, 1995);
Всероссийских съездах по иммунитету растений к болезням и вредителям (С.-Петербург, 1995,2002, 2006);
II международном симпозиуме «Взаимодействие злаков с патогенами и стрессовыми факторами» (Польша, 1997).
Менделевском конгрессе (Брно, 2000);
международной научно-практической конференции «Генетические ресурсы культурных растений» (Санкт-Петербург, 2001);
-XVI конгрессе ЕУКАРПИЯ (Эдинбург, 2001);
- Вавиловских чтениях ВНИИ Растениеводства (Санкт-Петербург,
2001,2004,2005);
- конференциях профессорско-преподавательского состава
СПбГАУ (Санкт-Петербург, 2002-2006);
международной конференции по защите растений «Вредители, болезни и сорняки» (Санкт-Петербург, 2002);
международной конференции «Защита растений в Балтийском
10 регионе» (Каунас, 2002);
- 6-ой конференции Европейского фитопатологического общества
(Прага, 2002);
Всероссийском совещании «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии» (Голицыно, 2003);
международной практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2004);
международной конференции по защите растений «Вопросы менеджмента в защите растений и устойчивом земледелии: исследования и развитие и информационные системы »(Санкт-Петербург - Пушкин, 2005);
научной конференции «Стратегия и тактика защиты растений» (Минск, 2006);
- международной научной конференции "Genetic resources of
biodiversity" (Баку, 2006).
Выражаю глубокую благодарность сотрудникам отделов иммунитета, генетики, биотехнологии за помощь в работе.
Особую благодарность выражаю докторам биологических наук И.Г. Одинцовой, Б.В. Ригину, Э.А. Гончаровой, без которых данная работа не была бы сделана.
Приношу искреннюю признательность сотрудникам отделов генетических ресурсов пшеницы, овса, ячменя и ржи ВИР за оказанное внимание и полезные консультации.
Глубоко благодарен М.Э. Гашимову, К.У. Куркиеву, Б.А. Баташевой -сотрудникам Дагестанской опытной станции ВИР за большую помощь в проведении полевых экспериментов.
Выражаю искреннюю благодарность аспирантам М.А. Колесовой, П.М. Курбановой и А.А. Зубову за неоценимую помощь при оформлении диссертации.
Генетический контроль устойчивости ячменя к карликовой ржавчине
Карликовую ржавчину вызывает базидиальный гриб Puccinia hordei Otth. Патоген - двудомный гриб: эцидиальное спороношение происходит на видах птицемлечника, уредо- и телиоспороношение - только на ячмене. Урединии обычно на верхней стороне листьев, реже на влагалищах, расположены в беспорядке, одиночные, округлые, 0,3-0,4 х 0,1-0,2 мкм, порошащие, светло-желтые или коричнево-бурые. Урединиоспоры шаровидные, широкоэллипсоидальные, 21-30 х 18-22 мкм; оболочка светло-бурая, толщиной 1,5-2 мкм, шиповатая. Телии преимущественно на нижней стороне листьев, на влагалищах, черные, прикрытые эпидермисом, точечные или продолговатые, длиной 0,1-0,5 мм, иногда сливающиеся. Телиоспоры двуклеточные и одноклеточные (мезоспоры), причем преобладают последние; 44-56 х 16-24 мкм, на вершине округлые или удлиненные; оболочка бурая, 1-2 мкм, на вершине утолщенная до 7 мкм, гладкая (Пересыпкин, 1989).
Болезнь проявляется обычно к началу молочной спелости ячменя в виде светло-ржавых мелких подушечек-пустул на нижней стороне листа, в отдельных случаях наблюдается поражение верхней стороны листа, влагалища листьев и даже остей. Оптимальная температура для развития спор карликовой ржавчины 15-17 С. Распространение повсеместно, но вредоносность и степень проявления различны. Более сильное проявление наблюдается в районах распространения птицемлечника и посевов озимого ячменя. Гриб может обходиться и без эцидиальной стадии, зимуя в уредостадии на озимом ячмене, падалице, давая весной новые поколения уредоспор (Пересыпкин и др., 1991).
Вредоносность карликовой ржавчины зависит от времени ее проявления. При раннем проявлении болезни нарушается синтез органических веществ в листьях, что снижает фотосинтетический потенциал растений и отражается на урожае зерна и его качестве. В Европе болезнь в основном вредоносна в регионах с умеренным и теплым климатом, таких как Англия и Франция, и менее значима в северных частях Европы. Потери урожая культуры от P. hordei на восприимчивых сортах в США превышают 32% (Griffey et al., 1994), в Чешской республике от 10 до 25% (Dreiseitl, 1990). В России сильное проявление болезни наблюдается в Поволжье, Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке (Лукьянова и др., 1990).
В настоящее время описано 16 главных генов устойчивости к карликовой ржавчине (обозначены символами Rph\-Rph\6) (Franckowiak et al., 1997). Все эти гены, кроме Rphl и Rphl6, преодолены в Европе вирулентными патотипами P. hordei (Fetch et al., 1998).
В СССР как эффективные определены гены устойчивости к карликовой ржавчине Rph3, Rphl и как частично эффективный ген Rph9 (Хохлова, 1982; Кривченко и др., 1988).
Ген устойчивости Rph3 был впервые идентифицирован у сорта Baladi 16. Широкое возделывание в Европе сорта Карат, защищенного этим геном, привело к потере его эффективности (Dreiseitl, 1990). Ген Rph3 картирован с использованием морфологических маркеров в хромосоме ячменя 7HL (Jin et al., 1993).
Ген Rph9 картирован в хромосоме 5Н (Borovkova et al., 1998). Этот ген аллелен гену устойчивости Rph\2 сорта Triumph. Ген Rph\2 широко использовался в селекционных программах ячменя Восточной Германии. Первые сорта с этим геном Trumph и Nadja были районированы в 1973 и 1975 гг. Вирулентные патотипы патогена, отмеченные в 1977 г., впоследствии перевели ген Rph\2 в разряд неэффективных (Walther, 1987).
Доминантный ген Rphl впервые выявлен у сорта ячменя Cebada Сара (PI 539113). Сорта с этим геном устойчивости были впервые изучены Брюкнером (Bruckner, 1970; Bruckner, 1971). С использованием трисомного анализа ген Rphl картировали в хромосоме ЗН ячменя (Tuleen, McDaniel, 1971; Tan, 1978). Патотипы, вирулентные к Rphl, обнаружены в Марокко (Parlevliet et al., 1981), США (Steffenson et al., 1993) и Израиле (Brodny, Rivadeneira, 1996). В Европе этот ген устойчивости не преодолен патогеном (Graner et al., 2000; Niks et al., 2000). Экспрессия гена Rphl зависит от генетической среды сорта. Так, наблюдали снижение его экспрессии в сортах Зефир и Вада по сравнению с таковой в Cebada Сара.
Эффективный ген Rph 16 привнесен в геном культурного ячменя от Н. spontaneum и локализован на хромосоме 2Н (Ivandic et al., 1998).
В России идентифицированы новые эффективные гены устойчивости ячменя к карликовой ржавчине. При изучении генетического контроля устойчивости у 8 коллекционных образцов ячменя было показано, что образцы кк-4468, 10468, Tasman имеют ген Rph3, а сорт Birka - ген Rphl (Месриева, 2000). У 4 форм - кк-13238,13497, Daphine, Дагестанский 239 -идентифицировали 9 новых эффективных генов устойчивости, которым присвоены временные символы РаБ\.5,раЛ6,раЛ1,раДаг8,раДаг9.
Помимо генетических исследований, в нашей стране проводилась массовая оценка коллекционных образцов на устойчивость к карликовой ржавчине. Так, при оценке 950 образцов выделены 23 формы, высокоустойчивые в стадии колошения к карликовой ржавчине на естественном инфекционном фоне, причем большая их часть это местные образцы из Китая и Индии (Трофимовская и др., 1972). 128 образцов выделены как высокоустойчивые в течение нескольких лет в полевых условиях (Хохлова и др., 2001). Учитывая опыт исследователей из стран Европы, можно предположить, что поиск новых высокоэффективеых генов устойчивости среди сортов современной селекции неперспективен. В то же время староместные сорта, особенно из центров происхождения культуры, могут представлять интерес в качестве возможного резервуара эффективных генов устойчивости.
Оценка устойчивости образцов к листовым ржавчинам
Пушкинский филиал ВИР. Опытные поля Пушкинского филиала ВИР (ПФ ВИР) расположены в 20 км к юго-востоку от Санкт-Петербурга. Рельеф выровненный. Почвы дерново-подзолистые легко-суглинистые, супесчаные, средне-окультуренные с пахотным горизонтом 20-25 см и содержанием гумуса 3-4%.
Климат данного региона характеризуется теплым летом и продолжительной, неустойчивой, с частыми оттепелями зимой. Весна и осень имеют затяжной характер: повышение температуры воздуха от 0 до 10С весной происходит в среднем за 45 дней, падение температуры осенью от 10 до 0С за 55 дней. Период со среднесуточной температурой выше 10С, определяющей время продуктивной вегетации большинства сельскохозяйственных культур в условиях региона, колеблется в пределах 115-120 дней с суммой активных температур 1600-1800С.
Самым теплым месяцем года является июль. Средняя температура воздуха в этом месяце равна 16,5-17,5С, однако в отдельные годы температуры существенно отличаются от средних. Самым холодным месяцем является январь с температурой воздуха -9, -11С.
По количеству осадков г. Пушкин относится к зоне достаточного увлажнения, осадки компенсируют возможное испарение. В течение года выпадает от 550 до 700 мм осадков. За вегетационный период (май-сентябрь) выпадает 204-444 мм, при средней многолетней 365 мм, однако для них характерна неравномерность распределения. Острый недостаток влаги обычно наблюдается в мае-июне, наибольшее их количество выпадает во второй половине лета, особенно в августе. Летние осадки часто носят ливневый характер и сопровождаются грозами. В зимний период из-за частых оттепелей мощного снежного покрова не образуется. За зиму отмечается 110-115 дней со снежным покровом. Средняя продолжительность безморозного периода составляет 120-130 дней (Агроклиматические ресурсы Ленинградской области, 1971).
Дагестанская опытная станция ВИР расположена в южной плоскостной зоне Дагестана (в 6 км к югу от города Дербента, в полупустынной зоне Прикаспийской низменности, в 1,3 км от берега Каспийского моря).
Почвы каштановые, среднегумусные, глубоко столбчатые солонцы, тяжело суглинистой разновидности. Содержание перегноя в гумусном горизонте колеблется от 2 до 3,5%, а запасы гумуса в метровом слое равняются 190-220 т/га.
Климат сухой, субтропический. Зима мягкая, непродолжительная. Самые холодные месяцы - январь, февраль. Весна ранняя, затяжная, прохладная. Лето жаркое, сухое. Самые теплые месяцы июнь-июль.
При годовом количестве осадков 400-500 мм, на испарение тратится 1000 мм. Близость моря, искусственное орошение обуславливает постоянно высокую относительную влажность воздуха. Сумма активных температур в год составляет 3400-4500С (Агроклиматические ресурсы Дагестанской АССР, 1975).
Материалом исследований служили 3765 образцов мягкой пшеницы и 2365 культурного ячменя из Мировой коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. В набор вошли образцы новейших поступлений коллекции, староместные формы, а также образцы, обладающие устойчивостью к изучаемым болезням по литературным данным.
Кроме того, оценивали устойчивость видового разнообразия D-геномной группы рода Aegilops L. (1146 образцов) (табл. 2.2.1) и 26 видов рода Triticum L. (846 образцов) (табл. 2.2.2). В настоящей работе придерживались классификаций рода Triticum, Aegilops, принятых в отделе генетических ресурсов пшеницы ВИР (Дорофеев и др., 1979; Дорофеев и др., 1987; Богуславский, Голик, 2004). Для анализа были взяты образцы, происходящие из различных эколого-географических регионов, однако у Т. aethiopicum, Т. persicum, Т. turgidum анализировали только формы, ранее описанные как высоко устойчивые к листовой ржавчине (Макарова и др., 1993).
Изучена также устойчивость образцов дикорастущих видов рода Hordeum L.: 17 образцов Н. agriocrithon, 11 - Я. bulbosum, 29 - Я. spontaneum, 20 - Я. murinum и 3 - Я. marinum.
При изучении сомаклональной изменчивости оценивали устойчивость поколения R2 1196 растений регенерантов 7 образцов пшеницы и 1678 - 5 сортов ячменя. В каждом последующем поколении оценивали только потомков устойчивых форм.
В лабораторных условиях образцы высевали на смоченную водой вату в кюветы, которые после прорастания семян помещали на светоустановку (20-22 С, постоянное освещение) (рис. 2.3.1.1.) При инокуляции интактных растений 10-15 проростков в стадии 1-2 листьев опрыскивали суспензией уредоспор возбудителей. Кюветы заворачивали в полиэтилен, который через сутки снимали.
Генетический контроль высокоэффективной устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине
В настоящее время известно 55 генов устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине (Mcintosh et al., 2003; Mcintosh et al., 2004; Mcintosh et al., 2005). На европейском континенте и в России высокоэффективны гены ювенильной устойчивости Lr9, Lr\9, LrlA (Csosz et al., 2000; Gultyaeva et al., 2000). Вследствие широкого возделывания сортов с геном Lr\9 он потерял свою эффективность в Поволжье и Волго-Вятском регионе (Вьюшков, 1998; Коваленко и др., 2003). При заражении проростков почти изогенных линий серии Thatcher используемой в данной работе сборной популяцией Р. recondita реакцию восприимчивости наблюдали на линиях с Lr генами: 1, 2а, 2Ь, 2с, 3, 3bg, Зка, 10, 11,12, 13, 14а, 14Ь, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 25, 27+31, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 42, 44, W (=52). Линии с генами Lr9, Lrl9, Lr24, LrA\ (=39) были высоко устойчивы. На листьях сорта Кавказ (Lr26) наблюдали редкие пустулы; частота клонов, вирулентных к Іг26 в популяции составляла 5%. Образцы с остальными Lr генами в нашей работе отсутствовали.
Помимо этих генов в СССР, России и странах СНГ идентифицировали методом гибридологического анализа и фитопатологического теста десятки эффективных генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине, отличающихся от Lr9, Lr 19, LrlA (Аманов, Одинцова, 1985; Вьюшков, 1998; Кривченко и др. 1990; Лапочкина и др., 1996; Макарова, 1993; Макарова, 1994, Макарова, Одинцова, 1990; Михайлова, 2003; Михайлова, Тырышкин, Дерова, 1987; Тырышкин, 1988; Михайлова, Гультяева, 1994; Mikhailova, Gultyaeva, 1996; Одинцова и др., 1990; Одинцова, Пеуша, 1984; Танкиманова и др. 1993; Танкиманова и др., 1993; Христов, 1981; Шулембаева, 2004). Мы оценили 27 образцов пшеницы, по литературным данным имеющих по крайней мере 32 новых эффективных гена ювенильной устойчивости к ржавчине (табл. 3.2.1). Только 5 образцов - TR/55P 6628, STW 646252, Torres, Эритроспермум-609 и Тулайковская 5 - были высоко устойчивы при инокуляции патогеном интактных растений. Шесть образцов были восприимчивы как при инокуляции интактных растений, так и отрезков листьев; в данном случае наиболее приемлемым объяснением несовпадений результатов является использование различных инокулюмов патогена.
Из 64 образцов, описанных как высоко устойчивые к болезни (Мягкова и др., 1981; Одинцова и др., 1982; Одинцова и др., 1990; Лоскутова и др., 2000) только 6 - АНК-2, Эритроспермум 14/83, Collin, Hand, Мс Nair 23 и Payne -проявили устойчивый тип реакции при заражении интактных растений; 33 образца были устойчивы при инокуляции отрезков листьев на бензимидазоле.
Мы изучили устойчивость к листовой ржавчине 3765 образцов мягкой пшеницы из Мировой коллекции ВИР (Тырышкин и др., 1999; Тырышкин и др., 2000; Тырышкин, 2002; Тырышкин и др., 2004). В интактном состоянии в стадии 1-2 листьев к используемой нами сборной популяции P. reconduct были устойчивы (тип реакции 0; и е.п.) 202 образца.
При инокуляции растений этих образцов 2 клонами патогена, вирулентными к гену Lr26 112 образцов проявили восприимчивый тип реакции 3 (табл. 3.2.2), и, следовательно, имеют этот ген устойчивости (Тырышкин, 2002; Тырышкин и др., 2004). Вероятность ошибки постуляции гена устойчивости примерно равна частоте встречаемости тест-клона в популяции, т.е. в нашем случае 0,05. Ген устойчивости Lr26 не является эффективным в полевых условиях в России. В наших исследованиях, образцы с этим геном, поражались в условиях Пушкина и Дербента на уровне восприимчивого контроля. Даже в случае возможной ошибочной классификации части образцов данной группы, как несущих ген Lr26, очевидно, они не могут рассматриваться в качестве источников высокоэффективных генов устойчивости, поскольку с относительно высокой частотой в популяции встречаются вирулентные к ним клоны. Высокая частота форм пшеницы с геном Lr26 не удивительна. Этот ген передан в геном мягкой пшеницы от сорта ржи Petcus в транслокации 1BL/1RS (Mcintosh et al., 1998); помимо неэффективного гена устойчивости к листовой ржавчине, в ней находятся гены устойчивости к стеблевой (SV31) и желтой (Уг9) ржавчинам и мучнистой росе (PmS), а также гены, повышающие адаптацию растений и урожайность (Shepherd, 1968; Singh et al., 1990; Moreno-Sevilla et al., 1995; McKendry et al., 1996). Частота встречаемости сортов с геном Lr26 крайне высока (Lukaszewski, 1991; Hanusova et al., 1996; Mcintosh et al., 2003).
Девяносто образцов, устойчивых к сборной популяции P. recondita, инокулировали 2 клонами, вирулентными к гену Lrl9; 17 образцов проявили восприимчивый тип реакции (табл. 3.2.3) (Тырышкин, 2002; Тырышкин и др., 2004; Тырышкин, 2006), что позволяет постулировать у образцов данной группы наличие этого гена
Сомаклональная изменчивость пшеницы и ячменя по устойчивости к болезням
В результате регенерации растений в культуре каллусов 2-го пассажа получили 1196 фертильных растений пшеницы и 1678 - ячменя.
Полученные растения-регенеранты пшеницы оценивали в поколении R2 (два самоопыления исходных регенерантов) по устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости, листовой ржавчине и обыкновенной корневой гнили, ячменя - к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили. При однократной оценке частота измененных по сравнению с исходными для каллусогенеза образцами очень высока (до 79,8% у образца 181-5 по устойчивости к корневой гнили) (табл. 4.2.1). Можно было предположить, что высокая частота сомаклонов, устойчивых к листовой пятнистости и корневой гнили, вызвана тем, что в среде для индукции каллусогенеза присутствует КЖ В. sorokoniana - возбудителя этих болезней. Этому, однако, противоречат полученные нами данные о том, что регенераты из устойчивых к КЖ клеточных линий неустойчивы к данным болезням.
При проверке устойчивости выделенных сомаклонов в нескольких независимых экспериментах большинство из них проявили восприимчивый тип реакции. Следует подчеркнуть, что в данной части работы использовали методику инокуляции отрезков листьев в бензимидазоле при изучении устойчивости к листовым болезням и метод заражения в рулонах при оценке устойчивости к корневой гнили. Резкое расхождение данных однократной и многократных оценок связано либо с зависимостью экспрессии генов устойчивости сомаклонов от незначительных изменений условий окружающей среды (влажность, освещенность, температура), либо было вызвано несовершенством методики инокуляции (Тырышкин, 1995; Tyryshkin, 1997; Tyryshkin et al., 2002; Tyryshkina-Shishelova, Tyryshkin, 2002). Частота устойчивых форм в поколении 1 сомаклонов пшеницы была выше у тех исходных генотипов, которые обладали каким-либо уровнем устойчивости к конкретной болезни. Мы предложили следующее объяснение этому факту: частота мутаций по «главным» генам устойчивости значительно ниже частоты мутаций по генам-модификаторам, взаимодействующим с генетическими системой исходных образцов и повышающим уровень устойчивости сомаклональных вариантов (Tyryshkin et al., 2000; Тырышкин и др., 2001).
В последующих поколениях проводили полинейный анализ устойчивости всех выделенных устойчивых сомаклонов: семенное потомство каждого растения собирали раздельно и анализировали по пораженности болезнями (Tyryshkin, 1997). В поколения R3.4 не удалось выделить устойчивые сомаклоны, являющиеся потомством регенерантов тех исходных форм, которые не обладали каким-либо уровнем резистентности к конкретной болезни (за исключением сомаклонов сорта ячменя Golden Promise, устойчивых к корневой гнили). К поколению R5 в анализе остались только сомаклоны образцов пшеницы 181-5 и Spica и ячменя - Golden Promise, Roland, Одесский 115 (Тырышкин, 2001; Tyryshkin, Tyryshkina-Shishelova, 2002; Tyryshkin et al., 2002). Однако и для этих форм вплоть до поколения R7 не удалось выделить линии, устойчивые к изучаемым болезням, и дающие в потомстве только устойчивые растения. Особо хотелось бы подчеркнуть, что оценку устойчивости проводили при ипользовании тех же методов, которые применялись для изучения R2.
Полученные результаты с нашей точки зрения могли быть объяснены одной из следующих гипотез: - неполная пенетрантность устойчивости анализируемых линий. В этом случае мы не должны наблюдать сомаклонов, все растения которых устойчивы к болезням. Данной гипотезе противоречит факт выделения стабильно устойчивых линий в поколении Rg. - постоянная реверсия мутаций устойчивости к аллелям восприимчивости. В этом случае можно было бы предположить, что в поздних поколениях происходит стабилизация аллелей устойчивости. - контроль устойчивости несколькими генами, взаимодействующими по принципу комплементарности либо полимерии. В этом случае следует принять, что исходное растение-регенерант было гетерозиготно по относительно большому количеству генов устойчивости (Тырышкин, 2001).
В настоящее время, мы предполагаем также, что результаты исследования сомаклонов ранних поколений могут быть связаны с зависимостью экспрессии генов устойчивости от конкретных условий внешней среды. Кроме того, как показала наша работа с коллекционными образцами, на экспрессию устойчивости к листовым болезням мог влиять и бензимидазол, т.е. выделенные устойчивые формы могли быть восприимчивы к болезням в интактном состоянии. Результаты изучения устойчивости к болезням при использовании рулонного метода тоже не всегда совпадают с результатами, полученными при выращивании растений в твердых субстрата, инокулированных конидиями возбудителя, что также могло привести к ошибочной классификации восприимчивых растений как устойчивых. В тоже время следует подчеркнуть, что выделяемые в каждом поколении восприимчивые растения, очевидно, были восприимчивы и при инокуляции интактных растений (в случае листовых болезней), и при выращивании растений в песке, инфицированном возбудителем обыкновенной корневой гнили.
