Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Род Triticum L.: систематика 8
1.2 Доноры геномов гексаплоидной пшеницы 10
1.3. Происхождение гексаплоидных пшениц 12
1.4. Генетическое разнообразие вида Т. spelta L 17
1.5. Запасные белки пшеницы как генетические маркеры
1.5.1. Классификация белков пшеницы 20
1.5.2. Биохимическая характеристика запасных белков пшеницы 21
1.5.3. Полиморфизм и генетический контроль биосинтеза глиадина 23
1.5.4. Характер наследования компонентов глиадина 27
7.5.1. Использование запасных белков в качестве генетических маркеров в селекции и в исследованиях филогении пшениц 31
1.6. Молекулярные маркеры 35
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Растительный материал 37
2.2. Методы исследований
2.2.1. Электрофорез глиадинов в полиакриламидном геле 37
2.2.2. Статистические методы 41
Глава 3. Генетический контроль компонентов глиадина у вида triticum spelta L 42
3.1. Гибридологический анализ наследования компонентов глиадина в комбинации скрещивания к-20539 х Ершовская 32 42
3.2. Гибридологический анализ наследования компонентов глиадина в комбинации скрещивания к-205 5 8 х Ершовская 32 45
3.3. Каталог аллельных вариантов блоков компонентов глиадинов вида Т.
spelta L 47
Глава 4. Анализ генетического разнообразия аллелей лиадинкодирующих локусов вида triticumspelt А L 56
4.1. Частоты встречаемости аллелей глиадинкодирующих локусов у яровой и озимой спельты 58
4.2. Генетическое разнообразие аллелей глиадинкодирующих локусов у европейских образцов спельты 64
4.3. Генетическое разнообразие аллелей глиадинкодирующих локусов у азиатских образцов спельты 72
4.4. Сравнительный анализ полиморфизма аллелей глиадинкодирующих локусов европейской и азиатской спельты 76
4.5. Генетическая близость европейской и азиатской спельты по генам глиадина 85
Глава 5. Сравнительный анализ образцов triticum spelt a l. и triticum aestivum l. с использованием аллелей глиадинкодирующих локусов и морфологических признаков 89
5.1. Морфологические характеристики Т. speltah. и Т. aestivum L 89
5.2. Анализ частот аллелей глиадинкодирующих локусов у образцов видов Т. spelta L. и Т. aestivum L 91
5.3. Сравнение аллельных вариантов блоков компонентов глиадина среди образцов испанской спельты и местных сортов мягкой пшеницы Испании 93
Обсуждение 100
Выводы 105
Список литературы
- Запасные белки пшеницы как генетические маркеры
- Электрофорез глиадинов в полиакриламидном геле
- Гибридологический анализ наследования компонентов глиадина в комбинации скрещивания к-205 5 8 х Ершовская
- Генетическое разнообразие аллелей глиадинкодирующих локусов у азиатских образцов спельты
Введение к работе
Актуальность исследования
Наиболее важной продовольственной культурой в мире, а также одной из древнейших культур является пшеница. Данная культура представлена на земном шаре большим разнообразием видов. Наиболее распространенной среди зерновых культур и из всех видов пшеницы является мягкая пшеница, занимающая наибольшую посевную площадь (Якубцинер М.М., 1956; Bushuk, 1994; Curtis, 2002). Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) относится к голозерным гексаплоидным видам. К гексаплоидам относится также и пленчатая пшеница спельта Triticum spelta L. (AABBDD).
В настоящее время спельта занимает меньшие площади посевов в мире, по-сравнению с мягкой пшеницей. Она встречается в Германии, Италии, Испании, Франции, США. Спельта привлекает внимание селекционеров ценными свойствами, которые отсутствуют у мягкой пшеницы (Perrino et al., 1996). К ним относят: устойчивость растения к патогенам, лучшую адаптивность к неблагоприятным факторам среды (Ruegger et al., 1990, 1993), повышенное содержание белка в зерне (до 21%), пищевые достоинства зерна (Pruska-Kedzior et al., 2008). Кроме того, мука из зерна спельты обладает уникальными вкусовыми качествами и высоким содержанием витаминов (Campbell, 1997). Однако широкому распространению этой культуры препятствует ее низкая урожайность и ряд морфологических характеристик, отрицательных в производственном отношении, а именно ломкость колоса и трудность его обмолота (Гончаров, 2002). В современных селекционных программах спельту интенсивно используют в скрещиваниях с мягкой пшеницей с целью улучшения последней: для повышения устойчивости к болезням, улучшения реологических свойств теста и качества выпечки хлеба.
Несмотря на то, что спельта, как и мягкая пшеница, относится к широко изучаемым видам, генетический контроль блоков глиадинов (запасных белков эндосперма) и аллельное разнообразие глиадинкодирующих локусов на данный момент остаются не изучены. В настоящее время для исследований биоразнообразия, филогении и эволюции используются различные молекулярно-генетические маркеры, одним из них у злаков являются запасные белки
(Metakovsky, 1990). Запасные белки являются маркерами устойчивых ассоциаций генов, обуславливающих адаптацию генотипов к определенным условиям среды; хлебопекарные качества, устойчивость к ряду заболеваний, что позволяет их использовать для решения практических задач селекции.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы состояла в анализе полиморфизма и наследования запасных белков - глиадинов у вида гексаплоидной пшеницы ТгШсит spelta L.. Для выполнения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
Методом гибридологического анализа изучить генетический контроль электрофоретических компонентов глиадина у вида Т. spelta L. Провести серию гибридизаций между образцами спельты и мягкой пшеницы.
Исследовать полиморфизм запасных белков - глиадинов у 80 образцов вида Т. spelta L. с помощью метода электрофореза белков.
Идентифицировать аллели глиадинкодирующих локусов у образцов европейской и азиатской спельты.
Составить каталог аллельных вариантов блоков компонентов глиадина вида Т. spelta L.
Определить разнообразие аллелей глиадинкодирующих локусов среди образцов яровой и озимой спельты.
Провести сравнение аллельных вариантов блоков компонентов глиадина, идентифицированных у Т. spelta L., с известными аллельными вариантами глиадина сортов мягкой пшеницы Т. aestivum L.
Научная новизна
Впервые изучен генетический контроль компонентов глиадина и их наследование в виде блоков компонентов глиадина у вида Т. spelta L. Выявлены семейства блоков компонентов глиадина.
Впервые идентифицированы аллельные варианты блоков компонентов глиадина у ряда образцов азиатской и европейской спельты. Выявлено 86 новых аллельных вариантов по глиадинкодирующим локусам первой и шестой гомеологическим группам хромосом у спельты. Создан каталог аллельных вариантов блоков компонентов глиадина спельты, включающий 141 аллель по пяти глиадинкодирующим локусам.
В результате анализа аллельного разнообразия глиадинкодирующих локусов вида Т. spelta L. оказалось возможным подтвердить существование двух подвидов -азиатского и европейского. Установлено различие азиатской и европейской групп спельты (яровых и озимых образцов) по составу и частоте аллельных вариантов по всем глиадинкодирующим локусам.
Показано отличие испанской спельты от других европейских спельт и сходство с мягкой пшеницей по аллелям глиадинкодирующих локусов хромосом шестой гомеологической группы. Результаты данной работы подтверждают разделение европейского подвида спельты на иберийскую и баварскую группы.
Практическая значимость
Результаты генетической структуры образцов спельты по аллелям глиадинкодирующих локусов могут быть успешно применены в селекционно-семеноводческих программах, в которых спельту используют в скрещиваниях с мягкой пшеницей для улучшения хозяйственно-полезных свойств пшеницы. В частности, знание генетического контроля компонентов глиадина позволит повысить эффективность селекционного процесса, направленного на повышение качества зерна за счет направленного отбора ценных аллелей, маркирующих этот признак в гибридных популяциях селекционных питомников.
Изучение разнообразия популяций спельты с использованием блоков компонентов глиадина позволит получить дополнительную информацию о филогенетических отношениях вида Triticum spelta L. в роде Triticum L.
Апробация результатов
Основные результаты работы были представлены на 2-ой научной конференции МОГиС, посвященной 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (МСХА, 2003), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010).
Декларация личного участия автора
Автор самостоятельно получила спектры глиадинов образцов спельты (материал предоставлен ВНИИР им. Н.И. Вавилова руководителем отдела пшениц О.П. Митрофановой и проф. В.А. Пухальским (ИОГен РАН)); провела ряд
необходимых скрещиваний, что позволило изучить генетический контроль и наследование блоков компонентов глиадина у вида Т. spelta L.; провела идентификацию аллелей глиадинкодирующих локусов у образцов азиатской и европейской спельты. Автор лично оформлял результаты своих исследований в виде статей. Суммарное личное участие автора составило восемьдесят пять процентов.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано три статьи, из них две в журналах, рекомендованных ВАК, трое тезисов, один патент на изобретение.
Структура и обьем диссертации
Диссертация изложена на 127 страницах, состоит из введения, пяти глав, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 190 источников, и приложения. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 15 таблицами.
Запасные белки пшеницы как генетические маркеры
В пшеничном зерне доля запасных белков превышает 80%. Запасные белки - глиадины и глютелины названы клейковинными белками. Они обладают уникальными физико-химическими свойствами, определяющими технологические, пищевые и вкусовые достоинства пшеничного хлеба. Глиадин придает тесту вязкость и растяжимость, а глютелин — эластичность (Созинов, 1985). Запасные белки в основном накапливаются в электронно-плотных белковых тельцах, величина которых колеблется от 1 до 15 цт (Graham, 1963). Глиадин начинает синтезироваться в эндосперме значительно раньше, чем другие белки, примерно на 14 день после цветения (Бушук, 1977).
Глиадин — гетерогенный белок, состоящий из ряда компонентов. Войчик и соавторы (Woychik et al, 1961), используя электрофорез в кислом алюминий-лактатном буфере, разделили глиадин на отдельные полипептиды. Электрофоретический спектр глиадина ими был разделен на четыре зоны: а-, (3-, у- и оо-зону. При электрофорезе глиадина в крахмальном геле (алюминий-лактатный буфер) число индивидуальных компонентов у разных генотипов составляет от 17 до 32 (Созинов, 1978), а в полиакриламидном геле — от 25 до 35 компонентов (Metakovsky, 1991). Используя метод двумерного электрофореза можно идентифицировать до 40-50 индивидуальных компонентов глиадина (Wrigley, 1973). Глиадины существенно различаются по физико-химическим свойствам. В одну группу входят ос-, (3- и у-глиадины, молекулы которых имеют серосодержащие аминокислоты и формируют третичную структуру за счет образования внутримолекулярных связей. Ко второй группе относятся со-глиадины, практически лишенные серосодержащих аминокислот (Ewart, 1976). Молекулярная масса ю-глиадинов составляет 64-73 кД (Branlard, 1983), а-, (3- и у-глиадинов — 32-42 кД (Shewry and Tatham, 1990).
Молекулярно-биологические методы исследования показали, что в каждом генотипе мягкой пшеницы имеется от 50 до 300 глиадинкодирующих последовательностей ДНК, имеющих разную степень гомологии (Harberd, 1985). Первичные нуклеотидные последовательности генов, контролирующих синтез серосодержащих глиадинов, выделенные из разных сортов, сходны и состоят из пяти доменов. Первый домен представляет собой тандемные несовершенные повторы длиной 36 нуклеотидов. Второй и четвертый домены — это многократно повторяющиеся триплеты, кодирующие аминокислоту глутамин. Третий и пятый домены являются уникальными у разных генов. Исследованные последовательности различаются между собой числом повторов в первом, втором и четвертом доменах, а также многочисленными точковыми заменами, делециями и вставками в различных районах гена (Kreis etal., 1985).
Структура белка а-глиадинов состоит из 20 аминокислотной последовательности сигнального пептида, N-концевого повторяющегося домена (состоит из 7-14 аминокислотных остатков), первой полиглютаминовой последовательности, уникального региона, второй полиглютаминовой последовательности и заканчивается С-концевой уникальной последовательностью (Anderson and Greene, 1997). В аминокислотную последовательность у-глиадина входят: сигнальный пептид, короткий N концевой домен неповторяющихся последовательностей, домен повторяющихся последовательностей, домен неповторяющихся последовательностей, состоящий из шести цистеиновых остатков, полиглютаминовый участок и С-концевой домен, содержащий два остатка цистеина (Anderson et al, 2001). В состав а- и у-глиадинов входит цистеин, который образует дисульфидные связи, тогда как в со-глиадинах отсутствует метионин и цистеин (Tatham and Shewry, 1995; Wieser, 2007). В состав со-глиадинов входят сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков, неповторяющийся N-концевой домен, домен повторяющихся последовательностей и С-концевой домен, со-глиадины классифицируются по N-концевому домену на типы: ARE, ARQ, KEL и SRL (Kasarda et al, 1983). Гены первых трех типов локализованы на хромосомах 1А и ID, тогда как гены SRL-типа - на хромосоме IB (DuPont et al, 2004).
Особенностью глиадина является почти полное отсутствие межмолекулярных связей, что отличает его от другого запасного белка пшеницы, глютенина. Глютенин состоит из множества субъединиц, связанных между собой межмолекулярными дисульфидными связями. Имея высокую молекулярную массу (от 100 до нескольких тысяч кД), нативный глютенин не входит в гелевые носители. Однако под действием меркаптоэтанола вследствие восстановления s-s связей крупные молекулы глютенина распадаются на субъединицы, молекулярная масса которых составляет примерно от 11 до 133 дальтон (Bietz et al., 1977).
Особенностью запасных белков пшеницы, в частности глиадина, является огромная генетическая изменчивость (полиморфизм) в пределах вида и отдельных популяций.
В настоящее время под биохимическим полиморфизмом (к которому относится полиморфизм запасных белков пшеницы), в узком смысле этого понятия, подразумевается наличие в одной и той же популяции различных молекулярных форм ферментативного или неферментативного (запасного) белка, контролируемых аллельными вариантами одного гена или локуса и различаемых методом электрофореза. Локус можно считать полиморфным, когда частота наиболее обычного аллеля не превышает 0,99 (Салерно, 1982).
Изучение глиадина методом электрофореза выявило обширный внутривидовой полиморфизм по этому признаку, благодаря уникальному компонентному составу глиадина каждого генотипа, имеющего свой набор глиадинкодирующих генов (Созинов, 1985).
Исследование запасных белков методом одномерного электрофореза в кислом буфере (рН 3,1) показало, что электрофоретический спектр этих белков специфичен и генетически детерминирован для генотипа (сорта, линии, биотипа) и не изменяется под влиянием окружающей среды и технологий возделывания. Это послужило основанием для идентификации сортов разных видов пшеницы по их электрофоретическим спектрам (Tkachuk, 1980).
Электрофорез глиадинов в полиакриламидном геле
При гибридологическом анализе степень соответствия наблюдаемого распределения численности классов теоретически ожидаемому, оценивали с помощью критерия і (Доспехов, 1985).
Матрица генетических расстояний подсчитана на основе расчета квадрата евклидовых расстояний (Животовский, 1991): а4 = "(рі - qi)2, ще pi и qi - частоты встречаемости блоков компонентов глиадинов в разных выборках спельт. На основе матрицы генетических расстояний были проведены кластерный анализ по методу Уорда (Ward, 1963) и многомерное шкалирование по методу Крускала (Крускал, 1986). Суть метода многомерного шкалирования заключается в построении конфигурации точек в пространстве небольшой размерности исходя из расстояний между ними, искаженных случайными ошибками или из ранговой информации об этих расстояниях (Эфрон, 1988). Для проведения статистического анализа полученных результатов использовали программу «STATISTICA 7,0 for Windows StatSoft, Inc
Для изучения наследования ранее не идентифицированных у спельты аллельных вариантов блоков компонентов глиадинов (новых аллелей) была проведена гибридизация между генотипами, различающимися по электрофоретическим спектрам. Были получены гибриды F] в ходе следующих комбинаций скрещивания: к-40829/Тау, к-46020/Condor, к-45367/Condor, к-45368/Condor, к-45364/Condor, к-47010/Siete Cerros, к-1731/Condor, к-20568/Siete Cerros, к-20569/Condor, к-20625/Siete Cerros, к-45750/Condor, к-15014/Сибирская erythrospermum (к-08076), к-1728/Сибирская erythrospermum (к-08076), к-20376/Ершовская 32, к-20546/Сибирская erythrospermum (к-08076), к-20539/Сибирская erythrospermum, к-20539/Ершовская 32, к-20558/Ершовская 32, к-20543/Condor, к-20591/Siete Cerros, к-45366/Condor, к-24724/Condor, к-15013/Condor, к-20538/Юна, к-19097/Лютесценс 35, к-52464/Condor, к-52470/Condor, к-52445/Зерноградка 9, к-52437/Безостая 1, к-62951/Сплав, к-6535/Альбидум 188. Изучение наследования аллельных вариантов блоков компонентов глиадинов проводилось в поколении F2.
В качестве одного из родителей для скрещивания с образцами спельты к-20539 и к-20558 был выбран сорт мягкой пшеницы Ершовская 32 с уже известной геномной формулой глиадина по первой гомеологической группе: Gli-Ali, Gli-Ble, Gli-Dla.
В результате анализа электрофореграмм 104 зерен F2 в комбинации к-20539/Ершовская 32 были обнаружены две группы компонентов у образца к-20539, генетический контроль которых ранее установлен не был. В первую группу входили компоненты 3, 4, 18, во вторую — 7, 8, 9, 13 (рис. 3.1). В ходе гибридологического анализа было установлено, что данные компоненты наследовались сцеплено (блоками). Исходя из аналогичного расположения компонентов глиадина электрофоретических спектров у мягких пшениц можно было предположить, что компоненты 3, 4, 18 контролируются локусом Gli-Al, а 7, 8, 9, 13 - локусом Gli-Bl. Для подтверждения наследования этих компонентов были выбраны две аллельные пары: первая была представлена компонентами 3, 4, 18 и аллелем Gli-Al і сорта Ершовская 32, вторая пара -компонентами 7, 8, 9, 13 и аллелем Gli-Blе сорта Ершовская 32. В электрофоретических спектрах исследованных зерен каждая из этих групп компонентов либо присутствовала, т.е. была представлена полным набором компонентов, либо отсутствовала. Число зерен с присутствием или отсутствием каждого из блоков (80:24 и 74:30, соответственно) соответствовало теоретически ожидаемому соотношению 3:1 (%2=0,20, Р 0,50 и х2=0,82, Р 0,25, соответственно). Компоненты 3, 4, 18 и аллель Gli-Ali (Ершовская 32), а также 7, 8, 9, 13 и аллель Gli-Blе (Ершовская 32) наследуются блоками, т.к. число зерен в фенотипических классах по каждой паре (24:53:27 и 30:49:25, соответственно) было близко к соотношению 1:2:1, ожидаемому в случае кодоминантного моногибридного наследования (х2=0,21, Р 0,50 и х2=0 82, Р 0,25, соответственно) (табл. 3.1).
У образца к-20558 были определены следующие аллели: Gli-Dla, Gli-A2f, GIi-D2a. При анализе 112 зерновок F2 от скрещивания к-20558/Ершовская 32 был обнаружен ряд совместно наследуемых компонентов в спектре образца к-20558 (рис. 3.2). Установлено, что число зерен с присутствием и отсутствием данного аллеля (компоненты 1 , 2 , 3 , 5 , 6 , 7 ) в спектрах гибридных зерен соответствовало теоретически ожидаемому соотношению 3:1 (х2=0,19, Р 0,50). Поскольку, аллель Gli-Ble сорта Ершовская 32 и компоненты 1 , 2 , 3 , 5 , 6 , 7 , наследующиеся совместно в виде блока сцепленных компонентов у образца к-20558, составляют аллельную пару, то можно считать, что генетический
Гибридологический анализ наследования компонентов глиадина в комбинации скрещивания к-205 5 8 х Ершовская
спельт (в девяти из десяти образцов - к-20538, к-20539, к-20541 (биотип), к-20543, к-20558, к-20568, к-20569, к-20591 (биотип), к-20625), являлся типичным для современных сортов мягкой пшеницы. Необходимо отметить, что у мягкой пшеницы есть несколько разных вариантов данного аллеля, принадлежащих одному семейству глиадинкодирующих генов (Gli-A2n, Gli-A2m, Gli-A2r, G/i-A2h, Gli-A2a, Gli-A2o) (Metakovsky et. al., 1984). Однако у испанских спельт встречался только аллель GH-A2/ (80%). Между тем, в электрофоретических спектрах образцов спельты других стран (Иран, Таджикистан, Азербайджан, Туркменистан, Швейцария, Австрия, Германия, Югославия, Польша) данный аллель не был найден или встречался крайне редко с частотой 4% (в образцах Чехословакии - к-45766, к-45768) (рис.4.2.4). to - с
Интересно, что результаты дифференциального окрашивания хромосом также подтверждают четкие отличия образцов испанской спельты от баварской. По данным хромосомного анализа спельты Испании, в отличие от баварских спельт, представляют собой довольно однородную группу, имеют невысокий уровень полиморфизма по рисунку С-бэндинга. Данный факт может быть связан с «эффектом основателя» или с независимой эволюцией испанских и баварских спельт (Дедкова и др., 2004). Таким образом, в результате сравнительного анализа полиморфизма глиадинов испанских и баварских спельт установлено, что генетические формулы испанских спельт имеют существенные отличия от формул глиадина других европейских спельт. Таким образом результаты наших исследований совпадают с известным раннее подразделением европейского подвида спельты на две эколого-морфологические группы - иберийскую (испанские спельты) и баварскую (Дорофеев и др., 1979). В целом уровень полиморфизма аллелей глиадинкодирующих локусов баварских спельт очевидно превышал таковой у испанских спельт. Интересным является факт того, что у испанских спельт, в отличие от баварских спельт и мягких пшениц, уровень полиморфизма по локусам хромосом первой и шестой гомеологических групп оказался примерно на одном уровне, тогда как у последних уровень полиморфизма по шестой гомеологической группе был всегда выше. Возможно, это свидетельствует об отсутствии отбора по локусам хромосом первой гомеологической группы. Также необходимо отметить, что отличительной особенностью испанских спельт является наличие аллеля GU-A2/, очень характерного для современных мягких пшениц и фактически не встречающегося в группе баварских спельт. Дополнительным отличием испанских спельт являлось полное отсутствие эндемичных, характерных только для спельты, аллельных вариантов глиадина по локусу GU-A2, что служит одним из подтверждений вторичного гибридного происхождения от мягких пшениц.
Генетические формулы глиадина были определены у 26 образцов азиатской спельты. Показано, что спельты Ирана, Таджикистана, Азербайджана и Туркменистана отличались между собой по генетическим формулам глиадина, а также частотой встречаемости отдельных аллелей (табл. 4.3). Таблица 4.3. Частота (%) встречаемости аллельных вариантов глиадинкодирующих локусов у азиатской спельты
У азиатских спельт по локусу GU-A1 идентифицировано 16 аллелей, среди которых найдено семь новых аллелей (Gli-АІҐ, Gli-AlT, GIi-A13s, Gli-A14s, GH-AI5", GH-A165, Gli-AlS ) ранее не встречавшихся у мягких пшениц по данному локусу. Среди всех исследованных аллелей с наибольшей частотой встречался аллель Gli-Alm (57,1%) в иранских образцах (к-45750, к-45546, к-45814, к-45817, к-47010). Выявленные новые аллельные варианты Gli-АІҐ, Gli-AIT, Gli-A13s встречались только в Иране (к-45546, к-45817, к-45818, к-45819). В целом, новые аллели по локусу Gli-АІ обнаружены у 35% азиатских спельт.
По локусу GU-B1 идентифицировано 17 аллелей (из них девять новых). Наиболее часто встречался аллель Gli-Blb в образцах Ирана (к-45750, к-45546), Таджикистана (к-52445, к-52457, к-52459, к-52467), Туркменистана (к-52434, к-52452, к-56591). При этом 46% спельт имели новые аллели по данному локусу.
По локусу GU-D1 найдено 12 аллельных вариантов глиадина (из которых - четыре новых - Gli-Dll", Gli-D12s, Gli-D13s, Gli-D14s). Новые аллельные варианты обнаружены у 19% образцов азиатской спельты, за исключением образцов из Ирана. В ряде образцов наиболее часто встречался аллель Gli-Dla. Чаще других (55%) встречался аллель Gli-Dlg среди образцов спельты Таджикистана.
Наибольшим разнообразием по составу аллелей глиадинкодирующих локусов и по встречаемости новых аллелей выделялся локус GU-A2 (24 аллеля, из которых 15 - новые). Новые аллельные варианты по данному локусу встречались у 81% азиатских спельт. Они были идентифицированы в образцах иранской спельты (к-45750, к-45546, к-45817, к-45818, к-45819), таджикской спельты (к-52445, к-52449, к-52453, к-52454, к-52459, к-52464, к-52467, к-52469, к-52470), азербайджанской спельты (к-45365, к-45366, к-45367, к-453 68) и в образцах туркменской спельты (к-52434, к-52452, к-56591).
По локусу GU-D2 идентифицировано 17 аллелей, из них новые аллельные варианты (Gli-D21s, Gli-D22s, Gli-D23s, Gli-D24s, Gli-D25s) были найдены у 19% образцов спельты. Аллель Gli-D21s идентифицирован в образце к-52438 (Таджикистан), аллель GU-D2T - в образце к-52453 (Таджикистан), аллель GU-D23s - в образце к-52454 (Таджикистан), аллель Gli-D24s - в образце к-52469 (Таджикистан), аллель Gli-D25s - в образце к-45366 (Азербайджан). Среди исследованных образцов спельты Ирана и Туркменистана новые аллельные варианты блоков компонентов глиадина не встречались.
Следует отметить, что по локусам Gli-Al, Gli-Bl, Gli-Dl, GH-A2 и GU-D2 в образцах азиатской спельты не были обнаружены устойчивые ассоциации аллельных вариантов блоков компонентов глиадинов, а именно повторяющиеся одинаковые сочетания аллельных вариантов по глиадинкодирующим локусам, составляющие генетическую формулу глиадинов.
На основании полученных результатов установлено, что аллельный состав блоков компонентов глиадина в азиатской группе спельт значительно отличался от аллельного состава в европейской группе (табл. 4.4). По каждому глиадинкодирующему локусу можно выделить доминирующие и редко встречающиеся аллельные варианты блоков компонентов глиадина. Также выявлены новые аллели, ранее не встречавшиеся у других видов пшеницы. Доля новых аллельных вариантов блоков компонентов глиадина по всем глиадинкодирующим локусам у европейских спельт преобладала, по сравнению с азиатскими (рис. 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3, 4.4.4, 4.4.5). Необходимо отметить, что по локусам Gli-Al, Gli-Bl, GU-A2, GU-D2 количество обнаруженных новых аллельных вариантов преобладало над уже известными аллелями. Исключение составлял локус Gli-Dl, один из аллелей которого (Gli-Dlа) встречался с доминирующей частотой как в азиатских, так и европейских спельтах
Генетическое разнообразие аллелей глиадинкодирующих локусов у азиатских образцов спельты
Гексаплоидные мягкие пшеницы, произраставшие ранее в Европе и Азии, существенно отличались по многим морфологическим признакам. Так, в Европе встречалась разновидность var. europaeae с характерным хрупким колосом и легким обмолотом. В Азии обнаруживалась разновидность var. asiaticae с жестким, труднообмолачиваемым колосом (Вавилов, 1926; Фляксбергер, 1935). Среди европейских пшениц преобладали безостые формы, азиатские были представлены, в основном, остистыми формами. В отношении спельты известна дифференциация на европейский (ssp. spelta) и азиатский (ssp. kuckuckianum) подвиды, разделение которых осуществлялось на основании морфологических особенностей и географического происхождения образцов (ботаническая классификация) (Фляксбергер, 1935; Дорофеев и др., 1979).
Данные по аллельному разнообразию глиадинкодирующих локусов, а именно составу и частоте идентифицированных ранее известных и эндемичных аллелей глиадинкодирующих локусов, подтверждают разделение спельты на европейский и азиатский подвиды. Наибольший полиморфизм по аллелям глиадинкодирующих локусов наблюдался среди озимых образцов у азиатской спельты, среди яровых - у европейской спельты. Всего идентифицирован 141 аллель по пяти глиадинкодирующим локусам хромосом первой и шестой гомеологических групп. Наряду с известными аллелями, согласно каталогу мягкой пшеницы, определены новые ранее не идентифицированные аллели глиадинкодирующих локусов спельты. Причем, данные аллели можно назвать эндемичными для Европейского и Азиатского регионов, за исключением аллеля Gli-A26s, который встречался в образцах азиатской яровой спельты (частота 16,67%) и в образцах европейской озимой спельты (частота 3,23%). Не были выделены устойчивые ассоциации аллельных вариантов блоков компонентов глиадинов спельты. В то время как у сортов современных и местных сибирских пшениц были выявлены генотипы с устойчивыми ассоциациями аллельных вариантов глиадина по хромосомам первой гомеологической группы (Николаев, 2008).
Как известно, Вавилов (1926) определял основным центром видообразования и разнообразия мягкой пшеницы горные и предгорные районы Юго-Западной Азии. Вавилов впервые высказал предположение о переднеазиатском происхождении спельты. Он считал горные районы хранителями сортового разнообразия и историческими центрами происхождения. Результаты наших исследований показали, что наибольший полиморфизм по аллелям глиадинкодирующих локусов был отмечен в образцах азиатской спельты, причем наиболее гетерогенными оказались спельты Ирана. Также наибольшее разнообразие спельты по имеющимся разновидностям сосредоточено в азиатских странах. Исходя из выше изложенного, можно предположить, что первично спельта возникла в Азии.
По результатам аллельного разнообразия глиадинкодирующих локусов спельты, была определена наибольшая частота новых аллельных вариантов по локусу GU-A2 как у европейской, так и азиатской спельты. Возможно, это можно было бы объяснить большей склонностью к возникновению мутаций по данному локусу. Однако, известно, что частота встречаемости как спонтанных, так и индуцированных мутаций по локусам хромосом первой и шестой гомеологических групп, примерно одинакова (Упелниек, 1994). Поэтому можно предположить, что уменьшение разнообразия аллелей блоков компонентов глиадина по первой гомеологической группе хромосом вероятно связано с отбором в процессе селекции на хозяйственно-ценные признаки, адаптивностью к экологическим условиям или одновременно сочетанием этих факторов отбора.
Часто встречающимся аллелем среди образцов азиатской и европейской спельты был аллель Gli-Dla. Можно с большей долей вероятности предполагать адаптивную значимость данного аллеля у спельты. Известно, что аллель Gli-Dla встречается достаточно широко среди сортов мягкой пшеницы, как современных, так и стародавних (Николаев, 2008).
Данный факт, вероятнее всего, объясняется селекционно-адаптивным преимуществом (Метаковский и др., 1986). Данный аллель является также возможным маркером адаптивности, участвующем в процессе протеолиза проламинов при прорастании зерна (Упелниек и др., 2003).
Результаты полиморфизма глиадинкодирующих локусов европейской спельты позволили выделить испанскую спельту. Так, аллели локусов Gli-A 1, Gli-Bl, встречающиеся у испанской спельты, не обнаружены у других европейских спельт. Эндемичные аллели по локусу GU-A2 практически не встречались, преобладал по частоте аллель GH-A2/, являющийся типичным аллелем для сортов мягкой пшеницы. Испанские спельты, по сравнению с баварскими, отличались низким уровнем полиморфизма по аллелям глиадинкодирующих локусов и представляли собой однородную группу по данным хромосомного анализа (Дедкова и др., 2004).
Необходимо отметить, что исследование полиморфизма показало генетическую близость спельты и мягкой пшеницы. Так, яровые и озимые образцы спельты значительно различались по частотам встречаемости аллелей. Данная картина также характерна и для мягкой пшеницы. Также у спельты наиболее полиморфными по числу аллельных вариантов были локусы хромосом шестой гомеологической группы - GU-A2, GU-D2, что также соответствует данным по аллельному разнообразию глиадинкодирующих локусов у мягкой пшеницы (Николаев и др., 2005). Установлено, что уровень аллельного разнообразия глиадинкодирующих локусов у испанской мягкой пшеницы был выше, чем у испанской спельты. На этом основании можно допустить более древнее происхождение мягкой пшеницы в Испании, чем спельты.
Наличие генетического материала ржи в германских образцах указывает на их вторичное происхождение, поскольку известно, что для создания современных сортов спельты интенсивно используют мягкую пшеницу (Siedler et al., 1994; Luo et al., 2007), сорта которой могли содержать данную хромосомную перестройку. Следует отметить, что образцы пшеницы с наличием в их клейковине белков ржи (секалинов) имеют низкие хлебопекарные качества (Попереля, Созинов, 1977; Zeller et al., 1982). Наличие аллеля Gli-Bll является характерной особенностью современных сортов селекции Мироновского института пшениц им. В.М. Ремесло. Данный аллель является также маркером генов устойчивости растений пшеницы к возбудителям ржавчинных болезней (Попереля, Бабаянц, 1980), так как в коротком плече хромосомы 1R находится ряд генов (Рт8, Yr9, Sr31, SrR, Lr26), придающих пшенице устойчивость к грибным патогенам (Koebner et al.,1986). Транслокация 1BL/1RS входит в геном многих европейских сортов мягкой пшеницы (Zeller, Hsam, 1983).
Наиболее типичный аллель Gli-Alm для таджикской и иранской спельты, не встречался в германских спельтах. Тогда как аллель Gli-Blb, типичный для «южных» регионов (Драгович, 2008), встречался как в таджикской и иранской спельте, а также в германской, но при этом не встречался в швейцарской спельте, которая также относится к «северной» группе. Вероятно, аллели, характерные для «южных» стран передались путем скрещиваний с мягкой пшеницей в европейские страны («северные»). Проведенная кластеризация спельты указала возможное сходство туркменской и чехословацкой спельты. Аллель Gli-Alf, характерный для «северных» регионов, встречался в образцах швейцарской и чехословацкой спельты, но не в туркменской и других азиатских спельтах. Это свидетельствует о том, что аллели, характерные для азиатской спельты не были переданы путем скрещиваний в европейские спельты. Данный факт еще раз подтверждает независимое происхождение европейской и азиатской спельты. Испанские и азербайджанские спельты выделились в отдельный кластер по общим аллелям локусов Gli-Al, Gli-Bl, GU-D1 - Gli-Ala, Gli-Blg, Gli-Dla, Gli-Dlj. Тогда как, аллели локусов Gli-Al, Gli-Bl, встречающиеся в образцах испанской спельты, не обнаружены в образцах европейской спельты.
