Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
Общая характеристика семейства Opisthorchiidae 14
Биологическая характеристика исследуемых видов 16
Развитие в первом промежуточном хозяине 16
Развитие во втором промежуточном хозяине 18
1.2.3 Развитие в окончательном хозяине 20
1.3 Географическое распространение 22
Ареал O.felineus 22
Ареал С. sinensis 29
Ареал O.viverrini..,.,.. 30
Ареалы М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum 31
Морфологическое строение и систематическое положение изучаемых видов 32
Систематическое положение исследуемых видов 34
п\сем Opisthorchiinae 35
п\сем Metorchiinae 36
Характеристика молекулярных маркеров 37
Характеристика митохондриальных геномов плоских червей...........41
Молекулярно-филогенетические исследования описторхид 48
Работы по изучению внутривидовой изменчивости описторхид 48
1.10 Филогенетические методы анализа последовательностей 52
1.10.1 Методы, основанные на вычислении филогенетических
дистанций 55
Метод максимальной парсимонии 55
Метод максимального правдоподобия 56
10.11 Филогеография трематод 57
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61
2.1 Выделение биологического материала 61
Компрессионный метод выделения метацеркарий 61
Выделение метацеркарий путем переваривания мышц рыбы в искусственном желудочном соке 62
2.1.4 Выделение марит из печени искусственно зараженного
хозяина 62
2.2 Выделение нуклеиновых кислот 62
2.2.1 Выделение ДНК из марит и метацеркарий фенольным
методом 62
Выделение ДНК из марит и метацеркарий перевариванием протеиназой К 63
Выделение ДНК из марит и метацеркарий при помощи гуанидинизотиоцианата 63
Выделение плазмидной ДНК 63
Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях 64
Трансформация плазмидной ДНК в клетки E.coli 65
Подготовка компетентных клеток Е. coli для электропорации 65
Элюция ДНК из агарозного геля 65
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и олигонуклеотиды 65
4
2.8 Компьютерный анализ последовательностей ДНК 66
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 71
Митохондриальные геномы О. felineus, С. sinensis и О. viverrini. 71
Филогеография O.felineus , 86
Филогения видов сем. Opisthorchiidae 96
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 104
Митохондриальные геномы 104
Филогеография О. felineus 105
Филогения видов сем. Opisthorchiidae 108
ВЫВОДЫ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113
5 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
мтДНК - митохондриальная ДНК
яДНК - ядерная ДНК
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ITS 1 - внутренний транскрибируемый спейсер 1
ITS2 - внутренний транскрибируемый спейсер 2
сох - цитохром с оксидаза
nd - NADH дегидрогеназа
cob - цитохром b
atp - ATP синтетаза
Введение к работе
Актуальность работы
Семейство Opisthorchiidae (кл. Trematoda, тип Platyhelminthes) включает в себя паразитов почти всех классов позвоночных, главным образом млекопитающих и птиц. Тремя представителями этого семейства -Opistorchis felineus, Clonorchis sinensis и О. viverrini — заражены около 30 млн человек в мире (King, Scholtz, 2001) и примерно 300 млн человек находится в группе риска. О. felineus является важным паразитом человека на территории России и республик бывшего СССР - Украины, Белоруссии, Казахстана и стран Прибалтики (Беэр, 2005). С. sinensis поражает людей в Китае, Корее, Японии, Лаосе, Вьетнаме и на Дальнем Востоке России (Посохов, 2004; Lun et al, 2005). О. viverrini распространен в Таиланде, Лаосе, Вьетнаме и Камбодже.
В то время как важность трех вышеупомянутых видов не вызывает
сомнения, существуют данные, что в некоторых случаях человека могут
поражать ряд других видов описторхид. Pseudamphistomum truncatum
считается настолько же патогенным для человека, как и О. felineus (Ромашов
с соавт., 2005; Скрябин, Петров, 1950). Есть сообщения, что Metorchis bilis и
М. xanthosomus также могут быть опасны для человека (Сидоров, 1983). Это
дает некоторым'' авторам основания полагать, что в некоторых
географических районах заболеваемость может вызываться сразу
несколькими видами опистохид (Ромашов с соавт., 2005), причем
особенности симптоматики и лечения смешанных заболеваний пока не
известны. _
Как сем. Opisthorchiidae, так и кл. Trematoda в целом с молекулярной точки зрения изучены слабо. Различные представители кл. Trematoda значительно отличаются друг от друга по жизненному циклу, в котором различные стадии трематод могут иметь от одного до четырех хозяев, обычно двух или трех. Стадий размножения тоже несколько: на стадии
7 мариты происходит половое размножение, а подробности размножения спороцисты и редии в деталях неизвестны; по наиболее распространенному мнению оно представляет собой бесполое клональное размножение (Гинецинская, 1968).
Больше всего молекулярных исследований проведено на кровяных двуустках, которые значительно отличаются от прочих трематод, в особенности наличием полового диморфизма (все прочие трематоды гермафродитны). Следующими по количеству работ идут фасциолиды {Fasciola hepatica, Fasciola gigantica и Fasciolopsis buski) и Paragonimus westermani. У первых отсутствует стадия метацеркарии; церкария превращается в адолескарий, который напрямую попадает в окончательного хозяина. У P. westermani вторые промежуточные хозяева - ракообразные, которые отличаются от рыб - вторых промежуточных хозяев описторхид -по тем расстояниям, на которые они способны мигрировать, а, следовательно, эпидемиологически P. westermani и описторхиды могут значительно отличаться.
Описторхиды отличаются от фасциолид и парагонимид не только наличием в жизненном цикле второго промежуточного хозяина, но и иным соотношением плодовитости на бесполой и половой стадиях, что оказывает влияние и на популяционные характеристики. Таким образом, возможно, что для каждой изучаемой группы трематод следует подбирать подходящие именно этой группе генетические маркеры.
До сих пор работы на описторхидах по прямому исследованию изменчивости ДНК не предоставили большого количества информации, главным образом, из-за недостаточной вариабельности используемых маркеров. В этой связи перед исследователями в первую очередь стоит задача подбора маркеров с оптимальной вариабельностью, что является непростой задачей для малоизученных на молекулярном уровне организмов со сложным биологическим циклом.
5 ......
. 8
Наибольшее число исследований меж- и внутривидового разнообразия трематод проводится при использовании последовательностей рибосомального кластера и некоторых митохондриальных генов (coxl, ndl). В то время как единообразие используемых разными авторами маркеров удобно при сравнении результатов разных авторов, у такого подхода есть и недостатки. Эти последовательности могут оказаться недостаточно вариабельными для решения некоторых задач. Кроме того, в ряде случаев использование только одного маркера может привести к неверным выводам (Zhang, Hewitt, 2003). Некоторые авторы рекомендуют использовать маркеры из различных геномов (ядерные и митохондриальные), мультигенный анализ и анализ разных по своей функциональности последовательностей (белок-кодирующие последовательности, интроны, межгенные промежутки).
Одной из главных мишеней для решения филогенетических и филогеографических вопросов у животных является митохондриальный геном. Он содержит набор генов, среди которых белок-кодирующие последовательности, рибосомальные и транспортные РНК, а также некодирующие районы. Это дает возможность для выбора маркеров с разной скоростью эволюции; кроме того, используются и такие структурные признаки, как последовательность и ориентация генов, особенности вторичной структуры функциональных РНК.'
Нашей целью было исследовать меж- и внутривидовое разнообразие
описторхид по последовательностям различного происхождения: внутренним
транскрибируемым спейсерам рибосомального кластера, экзонным и
интронным участкам ядерных '-' ^тенов, митохондриальным
последовательностям.
Одной из задач, которую предстоит решить молекулярными методами -это ревизия систематики семейства. В настоящее время она основывается на морфологии взрослой стадии; главные проблемы ее - это неопределенность относительного веса признаков. при оценке
взаимоотношений видов, большая зависимость морфологии паразита от средовых факторов (вида окончательного хозяина и интенсивности инвазии) и наличие переходных форм у многих признаков (Скрябин, Петров, 1950). Альтернативный подход основывается на морфологии церкарий, которые считаются некоторыми исследователями рекапитуляцией предковых форм (King, S.choltz, 2001); результаты его часто конфликтуют с традиционной систематикой.
Важной задачей является также исследование параметров внутривидовой изменчивости описторхид. Препятствием, тормозящим развитие этих исследований, является недостаток таких работ в целом по классу. Если в случае позвоночных или членистоногих исследователь может сравнить свои данные с данными других авторов по близкородственному виду, то в случае трематод - в лучшем случае с представителем другого семейства или отряда. Работы по изучению внутривидовой изменчивости необходимы для понимания закономерностей эволюции беспозвоночных в целом.. Кроме того, эти результаты могут быть важны для понимания эпидемиологии описторхидозов.
Цель и задачи исследования
Основной целью данного исследования было определение меж- и внутривидовой изменчивости ядерной и митохондриальной ДНК О. felineus и близкородственных видов - С. sinensis, О. viverrini, М. bills и М. xanthosomus.
В работе были поставлены и решены следующие задачи:
1. Определение нуклеотидных последовательностей
митохондриальных геномов О. felineus, С. sinensis и О. vlverrlnl и их анализ.
2. Исследование филогенетических взаимоотношений между О.
felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bills, М. xanthosomus и P. triincatum при
помощи митохондриальных и ядерных маркеров.
10 3. Исследование внутривидовой структуры О. felineus на территории России при помощи митохондриальных маркеров.
Научная новизна
Разработаны новые ядерные (9й интрон гена парамиозина и гистон HI)
и митохондриальные (сохЗ и atp6) маркеры описторхид. Усовершенствованы
системы использования ранее использовавшихся маркеров coxl и ITS2. По
данным маркерам получены нуклеотидные последовательности образцов О.
felineus, С. sinensis, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus и P. truncatum и
реконструированы филогенетические отношения между этими видами.
Впервые проведена реконструкция полных нуклеотидных
последовательностей митохондриальных геномов О. felineus и С. sinensis и частичной последовательности митохондриального генома О. viverrini. Проведено масштабное исследование генетической изменчивости О. felineus на молекулярном уровне.
Практическая значимость работы
Полученные нуклеотидные последовательности митохондриальных геномов и ядерных маркеров найдут применение в эпидемиологических исследований в качестве маркеров видов и популяций, а также в медицинских диагностических наборов на основе ДНК.
Благодарности
Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. В.А. Мордвинову и академику РАН Н.А. Колчанову за чуткое и внимательное руководство работой. Особые слова благодарности автор выражает к.б.н. А.В. Катохину, S. Konkow и К.П. Романову за неоценимую помощь в выполнении экспериментальных исследований, а также всему коллективу лаборатории функциональной геномики ИЦиГ СО РАН за помощь и советы по
выполнению работы. Автор крайне признателен д.б.н. Н.И. Юрловой, к.б.н. ЕА. Сербиной, к.б.н. С.Н. Водяницкой, д.б.н. К.П. Федорову, д.б.н. В.В. Беспрозванных, д.б.н. F. Ohyama, д.б.н. P. Sithithaworn, д.б.н. Б.В. и ВА. Ромашовым, д.б.н. В.Б. Локтеву и д.б.н. ОА. Морозовой за предоставленные образцы описторхид. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. Л.И. Гундериной и д.б.н. Ю.Г. Матушкину за любезно предоставленную возможность воспользоваться их лабораторным оборудованием, а также всех сотрудников Межинститутского Центра Секвенирования СО РАН за проведение капиллярного электрофореза реакции секвенирования и анализ полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность ЕА. Иванкиной, д.б.н. С.А. Демакову, к.б.н. Т.Д. Колесниковой, к.б.н. Н.В. Володько, к.б.н. П.Н. Меныыанову и к.б.н. Ю.Ю. Илинскому за неоценимую помощь и советы по выполнению работы. Отдельно хотелось бы поблагодарить к.б.н. О.Э. Костерина, к.б.н. А.Г. Блинова и к.б.н. Н.С. Юдина за ценные замечания, высказанные при чтении рукописи данной работы.
Публикации
Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. The complete mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda) II Parasitology International. 2010. V. 59. P. 100-103.
Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Romanov K.V., Besprozvannykh V.V, Fedorov K.P. , Yurlova N.L, Serbina E.A., Sithithaworn P., Kolchanov N.A., Mordvinov V.A. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) II Parasitology Research. 2009. V. 106 P. 293-297.
Катохин A.B., Шеховцов СВ., Konkow S., Юрлова Н.И., Сербина E.A., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Локтев В.Б., Муратов И.В., Ohyama F., Махнева Т.В., Пельтек С.Е., Мордвинов ВА. Оценка генетических отличий
12 Opistorchis felineus от Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis no ITS2- и СОЇ-последовательностям II Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421. № 4. С. 549-552.
4. Мордвинов В.А., Марданов А.В., Равин Н.В., Шеховцов СВ.,
емаков С.А., Катохин А.В., Колчанов Н.А., Скрябин К.Г. Определение
полной нуклеотидной последовательности митохондриального генома
возбудителя описторхоза, Opisthorchis felineus II Живые системы. № 1. С. 95-
100.
Патент на изобретение № 2332456. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Шеховцов СВ., Пельтек СЕ. Фрагмент FR316 митохондриального гена ndl, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза. Приоритет изобретения 05 декабря 2006 г.
Шеховцов СВ., Катохин А.В., Конков С, Юрлова Н.И., Сербина Е.А., Водяницкая С.Н., Федоров К.П., Беспрозванных В.В., Охияма Ф., Сититаворн П., Локтев В.Б., Мордвинов В.А. Исследование генетического разнообразия описторхид - О. felineus, О. viverrini, С. sinensis и М. bilis II «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения». Том 3. (под ред. К.В.Галактионова и А.А.Добровольского). Санкт-Петербург: «Лема». 2008. С.223-226.
Katokhin A., Shekhovtsov S., Konkow S., Yurlova N., Serbina E., Vodianitskaia S., Fedorov K., Besprozvannykh V., Ohyama F., Peltek S., Mordvinov V. Analysis of Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis (Trematoda, Digenea, Opisthorchiidae) ITS2 and COl Sequences Variations IIXX International Congress of Genetics. Berlin. 2008. p 235.
Shekhovtsov S.V., Katokhin A.V., Konkow S., Yurlova N.I., Serbina E.A,, Vodianitskaia S.N., Fedorov K.P., Besprozvannykh V.V., Ohyama F., Sithithaworn P., Loktev V.B., Mordvinov V.A. Comparative phylogenetic analysis of opisthorchiid species based on nuclear and mitochondrial sequences II Proceedings Of The Sixth International Conference On Bioinformatics Of Genome Regulation And Structure. 2008. p. 735.
9. Катохин А.В., Шеховцов СВ., Романов К.В., Брусенцов И.И.,
Юрлова Н.И., Мордвинов В.А. Молекулярно-генетическая филогения видов
семейства Opisthorchiidae // Материалы III межрегиональной научной
конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-
летию профессора Константина Петровича Федорова 15-20 сентября 2009 г.
Новосибирск. ООО Компания "Талер-Пресс" 2009. С. 121-123.
10. Шеховцов СВ. Изменчивость митохондриального генома у
кошачьей двуустки на территории России // Матеріали IV Міждународноі
конферениціі молодих науковців «Біология: від молекули до біосфери».
Харків. 2009 г. С 153-154.
