Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время белокочанная капуста {Brassica oleracea convar. (L.) Alef. var. capilaia L. f. alba Dc.) является наиболее распространенной овощной культурой в Российской Федерации. Её выращивают на площади 161,7 тыс. га, что составляет 21,6% от всех площадей, занятых под овощами. Многочисленные заболевания, которым подвержена белокочанная капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции. Ситуация осложняется отсутствием разрешенных для применения на продовольственной капусте химических средств защиты. Это вызывает необходимость выведения устойчивых сортов. Однако редкая встречаемость доноров устойчивости среди видов, скрещивающихся с белокочанной капустой, делает эту задачу трудновыполнимой методами традиционной селекции.
Л'*корить решение данной проблемы можно при помощи генной инженерии.Тем не менее, известна лишь одна работа по генетической трансформации белокочанной капусты с целью повышения устойчивости к болезням, причем она ограничивалась приданием устойчивости к вирусу мозаики турнепса, проведена на сортах и гибридах зарубежной селекции и осуществлена в Германии (Радчук и др., 2000).
Среди генов иммунного ответа растений особое вршмание привлекли к себе гены де-фензинов. кодирующие короткие цистеинсодержащие пептиды широкого фунгицидного и бактерицидного действия. Трансгенные растения, экспрессируюшие гены растительных де-фензинов, в настоящее время успешно проходят полевые испытания, где проявляют устойчивость к грибковым болезням на уровне и даже выше, чем контрольные нетрансгенные, обрабатываемые фунгицидами (Gao et al., 2000). Из обнаруженных к настоящему времени де-фензинов, одними из наиболее активных и широкоспецифичных в отношении фитопатогенов являются дефензины редьки {Raphanus sativus) (Broecaert et al., 1995).
В связи с этим, разработка методик регенерации и агробактериальной трансформации инбрелных самонесовместимых родительских линий F| гибридов, а так же изучение наследования и экспрессии гена дефензина редьки rs-ap и оценка устойчивости к грибковым заболеваниям трансгенных растений, в том числе к киле, являются весьма актуальными.
Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось получение растений белокочанной капусты, экспрессирующнх редечный дефензин RS-AP, и оценка их устойчивости к заболеваниям. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
1) Разработать методику регенерации из соматических тканей растений депрессирован-
ных инбредных самонесовместимых родительских линий Fi гибридов белокочанной
капусты, в том числе:
оценить морфогенетический потенциал линий различных сроков созревания;
выяснить лпнтгпТГі іі'і ГЦ liijiiiii і|і і і'іі ri'rrg гпгтппп птттітгптimi'i среды, типа экс-планта и гипотеГ «5^рда^,БЛИ0ТЕг0\
Моск. евльзкокоз академии им. К. А. "имирязвва
_Инв. №crprii
2) Разработать методику агробактериальной трансформации растений инбредных ли
ний, а том числе:
подобрать оптимальные концентрации селективного агента и агробактериальной суспензии;
оценить влияние типа экспланта и агробактериальных штаммов на эффективность генетической трансформации.
3) Охарактеризовать полученные трансгенные растения, в том числе:
проанализировать характер наследования и экспрессии трансгена;
оценить устойчивость трансгенных растений к киле крестоцветных.
Научная новизна работы. Впервые изучен морфогекетический потенциал шести инбредных линий белокочанной капусты. Установлено положительное влияние гипотермиче-ского стресса на регенерационную способность капусты в условиях in vitro. Выявлен штамм Agrobaclerwm rhizogenes А4, отличающийся высокой вирулентностью для данной культуры. Получены трансгенные растения белокочанной капусты, несущие ген дефензина редьки r.t-ар. Охарактеризованы наследование и экспрессия трансгена, а так же устойчивость трансгенных растений к киле.
Практическая значимость Разработанные эффективные методики регенерации и генетической трансформации инбредных линий белокочанной капусты могут быть использованы при размножении их в культуре in vilro. для переноса в их геном чужеродных генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки и для проведения фундаментальных исследований. Созданные трансгенные пинии, отличающиеся устойчивостью к киле, могут быть использованы в качестве модельных объектов для изучения фунгицидной активности дефензи-нов в отношении облигатных паразитов и для изучения феномена «замолкания» трансгена.
Апробация результатов работы. Результаты работы апробированы на ежегодных научных конференциях Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева (Москва, 8-Ю декабря 1998 г., 9-11 декабря 1999 г. и 10-12 декабря 2000 г.), на Международной научной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 4-9 октября 1999 г.). Международной научной конференции молодых ученых - овощеводов (Москва, 28-29 марта 2000 г.) и II Международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 18-19 октября 2000 г.).
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, выводов, заключения, библиографического списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 34 рисунка. Библиография включает 248 источников, из них 202 на иностранных языках.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
