Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1 Общая характеристика и распространение грибов рода Trichoderma 8
1.2 Биологические свойства и механизмы действия грибов рода Trichoderma 16
1.2.1 Микопаразитические свойства и литические ферменты грибов 17
1.2.2 Антибиотические свойства и летучие соединения грибов рода Trichoderma 23
1.3 Влияние грибов на рост и развитие растений 32
1.3.1 Положительное влияние видов рода Trichoderma на растения 33
1.3.2 Фитотоскичные свойства и отрицательное действие на растения 39
1.4 Биологически активные кормовые препараты с дополнительным внесением селена в сельском хозяйстве 40
1.5 Биотехнологические аспекты создания препаратов на основе грибов рода Trichoderma 51
1.5.1 Препараты - триходермины, использующиеся в мировой практике борьбы с болезнями 55
Глава 2 Объекты и методы исследований 63
2.1 Объекты исследований 63
2.2 Методы исследований 72
2.2.1 Определение антагонистической активности штаммов грибов рода Trichoderma 72
2.2.2 Исследование ростстимулирующей и фитотоксической активностей грибов рода Trichoderma 75
2.2.3 Изучение возможности использования штаммов Trichoderma для получения кормовых добавок 77
2.2.4 Твердофазное культивирование штаммов грибов, рода Trichoderma на растительных субстратах 91
2.2.5 Определение показателей продуктивности зерновых культур 99
2.2.6 Оценка влияния грибов рода Trichoderma на микрофлору ризосферы растений в питомнике 100
2.2.7 Статистическая обработка полученных результатов 101
Глава 3 Антагонистическая активность сибирских штаммов грибов рода Trichoderma 103
3.1 Гиперпаразитическая активность грибов рода Trichoderma в отношении грибов родов Alternaria, Bipolaris, Fusarium, 103
3.2 Антибиотическая активность штаммов грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов 108
Глава 4 Ростстимулирующая активность штаммов грибов рода Trichoderma 117
4.1 Влияние метаболитов штаммов рода Trichoderma на прорастание семян и рост каллусов злаковых растений 117
4.2 Влияние метаболитов штаммов рода Trichoderma на прорастание семян и рост каллусов хвойных растений 124
Глава 5 Возможности использования штаммов Trichoderma для получения кормовых добавок 132
5.1 Биохимический состав биомассы и метаболитов штаммов рода Trichoderma 133
5.2 Оценка влияния селена на рост и накопление биомассы штаммами рода Trichoderma 139
5.3 Содержание селена в биомассе штаммов Trichoderma 141
Глава 6 Твердофазная ферментация грибов рода Trichoderma на растительных субстратах 147
Глава 7 Оценка эффективности использования биопрепаратов на основе штаммов грибов рода Trichoderma в полевых условиях 157
7.1 Эффективность использования биопрепарата-триходермина 157
7.2 Оценка влияния биопрепарата-триходермина на биологические процессы почв в полевых условиях 160
Глава 8 Технологическая часть 165
8.1 Область применения 165
8.2 Технические требования 173
8.3 Требования безопасности 175
8.4 Приемка 175
8.5 Методы контроля 176
8.6 Хранение 180
Выводы 180
Список литературы 183
Приложение 212
- Антибиотические свойства и летучие соединения грибов рода Trichoderma
- Антибиотическая активность штаммов грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов
- Содержание селена в биомассе штаммов Trichoderma
- Оценка влияния биопрепарата-триходермина на биологические процессы почв в полевых условиях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Грибы рода Trichoderma широко используются как биологические агенты для контроля возбудителей заболеваний растений (Harman, Bjorkman, 1998; Steward и др., 2006; Vinale и др., 2006). При рекомендации штамма-продуцента для создания биопрепаратов учитывается, как правило, его способность подавлять ряд фитопатогенных грибов и технологичность штамма. В последнее время появились сведения, что разные виды рода Trichoderma способны также вырабатывать фитогормоны (ауксины, этилен, питокинины) и оказывать, помимо защитных свойств, прямое стимулирующее действие на рост растения (Ousley и др., 1993; Berg, 2009; Vinale и др., 2009). Такие воздействия грибов рода Trichoderma на развитие растений очень важны для применения их в сельском и лесном хозяйстве, а также для понимания роли этих грибов в природных и искусственных экосистемах.
Накоплен огромный фактический материал по использованию грибов рода Trichoderma как продуцентов ферментных препаратов, используемых в сельском хозяйстве для приготовления кормов. Однако недостаточная изученность биохимического состава биомассы видов рода Trichoderma не дает возможности гарантированного и безопасного их использования в кормопроизводстве. Использование грибов рода Trichoderma может быть существенно расширено при решении проблемы переработки сельскохозяйственного сырья и производства кормов животных, содержащих обогащенный селеном мицелий грибов этого рода. Созданные коллекции, на основе новых активных штаммов из различных экосистем, могут быть потенциалом для отбора штаммов грибов рода Trichoderma и использования их в различных сферах биотехнологии, сельского хозяйства и растениеводства.
Цель работы - отобрать перспективные штаммы рода Trichoderma из коллекции Центра биотехнологии и микологии Сибирского государственного технологического университета для создания биопрепаратов защиты и стимулирования роста растений и для получения кормовых добавок.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
исследовать антагонистическую активность штаммов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микроорганизмов родов Alternaria, Bipolaris и Fusarium и провести скрининг с целью выбора штаммов для защиты растений;
изучить активность метаболитов сибирских штаммов рода Trichoderma как стимуляторов роста хвойных и злаковых растений;
определить биохимический состав биомассы и компонентов культуральной жидкости штаммов рода Trichoderma;
исследовать влияние селенсодержащих сред на рост и накопление биомассы штаммов рода Trichoderma;
изучить степень биодеструкции растительных субстратов отобранными штаммами и их выход КОЕ при твердофазном культивировании для обоснования технологии производства;
провести испытания полученных опытных образцов препаратов против болезней хвойных и злаковых растений на естественных инфекционных фонах.
Научная новизна. Методом многоступенчатого скрининга отобраны перспективные штаммы грибов рода Trichoderma для защиты злаковых культур от корневых гнилей, вызываемых фитопатогенами из родов Alternaria, Bipolaris и
Fusarium.
Впервые установлена ростстимулирующая активность грибов рода Trichoderma в отношении каллусов злаковых и хвойных растений и отобраны перспективные штаммы Т. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5» для разработки технологии микроклонального размножения ценных видов хвойных растений.
Определены параметры и субстраты для твердофазного культивирования ростстимулирующих штаммов Т. asperellum «Mg-6», Т. harzianum «М99/5» и Т. koningii «ТСЛ-06».
Определен биохимический состав биомассы и культуральной жидкости штаммов Т. asperellum, Т. harzianum, Т. koningii и Т. viride. Изучено влияние селена на накопление биомассы штаммов рода Trichoderma при поверхностном и глубинном культивировании и показана возможность их использования для получения кормовых добавок.
Практическая значимость работы. Выделены штаммы рода Trichoderma, имеющие потенциальную ценность для производства биопрепаратов защиты растений. Подобран рациональный растительный субстрат для твердофазного культивирования продуцентов. Показана возможность использования штаммов Т. asperellum «Mg-6» и Т. harzianum «М99/5» для переработки отходов предприятий деревообрабатывающей и гидролизной промышленности. Разработана в лабораторных условиях технология получения биопрепарата Триходермин-М.
Наработана опытная партия биопрепаратов, с титром 3.5-10 КОЕ/г, антагонистически активных штаммов. Проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на основе штаммов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 1 и 2 региональной конференции по биологии (Красноярск, 2007, 2008); всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения» (Красноярск, 2007); международной школе-конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2007); II съезде микологов России (Москва, 2008); всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Красноярск, 2008, 2009); международной научной конференции «Современные средства, методы и технологии защиты растений» (Новосибирск, 2008); 12 международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); VII международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008); 5 съезде биотехнологов России (Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Непрерывное экологическое образование» (Красноярск, 2009).
Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: РФФИ-офи -№06-04-08040-офи «Создание высокопродуктивных, устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ «Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса»; РФФИ "Енисей" - №090498008
«Биологический контроль биотехнологии сокультивирования хвойных в культуре in vitro с биопрепаратами рода Trichoderma и Streptomyces»; 10-04-90745 (мобст) на прохождение научной стажировки в Московском государственном университете прикладной биотехнологии.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения исследований.
Структура и объем работы. Диссертационная работа стоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации ... страниц (основной текст ... страниц, приложение ... страницы). Диссертация содержит ... рисунков и ... таблиц. Список литературы включает в себя ... источников, из них ... на иностранных языках.
Антибиотические свойства и летучие соединения грибов рода Trichoderma
Грибы рода Trichoderma синтезируют множество вторичных метаболитов с биологической активностью (Vinale и др., 2008). Вторичные метаболиты - гетерогенная группа веществ, которые, как полагают, помогают организму в выживании и основных функциях, таких как соревнование против других микро - и макроорганизмов, симбиоз, транспорт металлов, дифференцирование, и т.д. (Demain и Fang, 2000). Химические и биологические свойства таких веществ широко используются в медицинских, фармацевтических, или сельскохозяйственных целях (Calvo и др., 2002). Включенные в эту группу антибиотики являются естественными продуктами, способными задерживать микробный рост и продуцируются различными микробами во время процессов развития и споруляции (Mapleston и др., 1992). Многие виды рода Trichoderma являются известными продуцентами вторичных метаболитов с антибиотической активностью (Sivasithamparam, Ghisalberti, 1998; Reino и др., 2008).
Антибиотики в системе защиты растений от болезней занимают особое место. Препараты на их основе имеют некоторые преимущества в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами по сравнению со многими фунгицидами. Например, антибиотики применяются в очень низких концентрациях, на единицу обрабатываемой площади попадает их значительно меньше, чем фунгицидов. Они быстро разлагаются почвенными микроорганизмами, что предупреждает накопление их в окружающей среде. На возбудителей болезней антибиотики действуют избирательно, легко проникают в ткани растений через стебли, листовую поверхность, могут попадать в семена. Их действие в меньшей мере зависит от неблагоприятных погодных условий. В рекомендованных дозах антибиотики не влияют отрицательно на рост и развитие растений, обладают антибактериальным действием в тканях.
Впервые антибиотическую активность у грибов рода Trichoderma описали С. Dennis и J. Webster (1971). Они показали, что грибы рода Trichoderma синтезируют стабильные и нестабильные антибиотические компоненты, способные ингибировать мицелиальный рост различных грибов.
Продукция антибиотиков часто объединяется с другими механизмами биологического контроля и таким образом считается одним из необходимых компонентов при селекции штаммов. Существуют данные, подтверждающие синегризм между ферментами, разлагающими клеточную стенку и различными классами антибиотиков у штаммов, проявляющих микопаразитизм (Lorito и др., 1996; Howell, 2003). Применение чистых антибиотиков показало такую же эффективность против патогенна, как и при использовании самих агентов биоконтроля (Chet и др., 1997; Benitez и др., 2004; Harman и др., 2004; Vinale и др., 2008).
E.L. Ghisalberti и К. Sivasithamparam (1991) классифицировали активные вещества на три категории: (1) изменчивые антибиотики, то есть 6-пентил-а-пирон (6РР) и большинство изоцианидных производных, (2) растворимые в воде вещества, то есть гептелидивая кислота или конингивая кислота; (3) пептабиотики, которые являются линейным олигопептидами из 12-22 аминокислот, богатых а-аминоизобутиловой кислотой, N-ацетилированным в N-остатке и содержащими аминоспирты (Pheol или ТгроГ) с С-остатком (Le Doan и др., 1986; Rebuffat и др., 1989; Vinale и др., 2008).
Согласно последней классификации, данной в обзорной статье Reino с соавторами (Reino, 2008) активные компоненты, продуцируемые этим родом подразделяются на:
1) антрахиноны, которые впервые были выделены в 1967 из дикого штамма Т. viride и подразделяются на пахибазин, хризофанол и эмодин затем, подобные вещества были найдены у Т. polysporum и Т. aiireoviride. Помимо фунгицидных свойств эти антибиотики оказывали антибактериальное действие на Bacillus subtilis и Streptococcus aureus.
2) дауканы или каратаны обычно синтезируются растениями семейств Umbelliferae и Compositae, были выделены из Т. virem. Оказывают фунгицидный эффект на различные виды фитопатогенных грибов и дрожжей Candida albicans.
3) пироны - четыре аналога пиронов были изолированы из различных видов Trichoderma. Два штамма Т. harzianum подуцировали летучее вещество 6-пентил-2Н-пиран, активный против Penicillium spp., Aspergillus fumigatus, Candida albicans и Cryptococcus neoformans. Виридепиронон, изолированный из культуральной жидкости Т. viride показал активность в отношении Sclerotium rolfsii 196 мг/мл (Evidente и др., 2003). Были выделены и охарактеризованы пироны, полученные из фильтратов двух коммерческих штаммов Т. harzianum (Т22 и Т39); была исследована их продуктивность во время антагонистического взаимодействия с патогеном R. solani (Vinale и др., 2006).
4) конингинины - группа антибиотических веществ, первоначально выделены из Т. koningii, что обуславливает их название. В зависимости от стереохимической конфигурации делятся на несколько форм А - Е. Конингинин D проявляет активность в отношении почвенных фитопатогенов Rhizoctonia solani, Phytophthora cinnamomi, Pythium middletonii, Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana.
5) триходермамиды - модифицированные дипептиды, выделенные из морского штамма Т. virens, проявляли цитотоксические свойства в отношении НСТ-116 человеческой карциномы в концентрации 0.32 мг/мл, кроме того был обнаружен слабый токсический эффект на три клеточные линии опухоли Р388, А-549, и HL-60 (Garo и др., 2003; Liu и др., 2005а).
6) виридины - стероидные антибиотики, оказывающие фунгицидное действие, посредством блокации клеточных сигнальных процессов. Содержат модифицированное фурановое кольцо и ароматическое кольцо (Hanson, 1995). Синтезируют виды Т. koningii (Beresteskii и др., 1976), Т. viride (Golder, Watson, 1980) и Т. virens (Singh и др., 2005). Эти вещества способны ингибировать прорастание спор Botrytis allii, CoUetotrichum lini и Fusarium caeruleum (0.003-0.006 мг/мл), Penicillium ехрашит, Aspergillus niger и Stachybotrys atra.
7) виридиофунгины — изолированы из Т. viride и содержат в качестве структурного элемента лимонную кислоту. Известны формы А-С, Ai_ , В2 и Ъг, обладают широким спектром антибиотической активности в отношении грибов видов Candida, Cryptococcus и Aspergillus, кроме того, оказывают цитотоксический эффект на опухолевые клетки.
8) гетероциклические антибиотики - производные пиридина и 2,3-диметокси-4-пиридииола, наиболее широко известный - харзианопиридон. Изолированный из Т. harzianum этот антибиотик проявлял активность в отношении Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani (Dickinson и др., 1989) Gaeumannomyces graminis var. tritici и Pythium ultimum (Vinale и др., 2006).
9) триходеноны и циклопептановые производные - изолированы из культуры Т. harzianum, паразитирующей на Halichondria okadai (Amagata и др., 1998). Эти вещества обладают цитотоксическим эффектом на линию опухолевых клеток в концентрации 0.21-1.45 мг/мл.
10) трихотецины - наиболее известные среди этой группы триходермин и триходермол, изолированные из Т. viride. Обладают токсическим эффектом, могут оказывать противомалярийное действие.
11) изоцианидные производные - состоят из пяти колец различной степени окисления, к настоящему времени выделено около 20 изонитрилов, основные из которых дермадин и триховиридин. Впервые дермадин был изолирован в 1971 из Т. viride. (Coats и др., 1971), в 1975 он найден у Т. koningii, его метилированное производное из Т. hamatum. Вещества этой группы ингибируют прорастание ооспор Phytophthora spp., изменяя морфологию изолятов, известно, что они также ингибируют синтез меланина и тирозиназы у млекопитающих.
12) сетин - подобные вещества, в частности трихосетин, были выделены из Т. harzianum сравнительно недавно, в 2003 г. (Vinale и др., 2006). Эти вещества оказывают антимикробное действие в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Bacillus subtili, а также слабое фитотоксическое действие на растения, ингибируя развитие корневой системы. Циссетин показал хорошее бактериостатическое действие в отношении пенициллин-резистентного штамма Streptococcus pneumoniae.
13) бизорбициллиноиды - производные сорбициллина или сорбициллинола. Сравнительно новая группа веществ, с широким спектром биологической активности, основными продуцентами которых являются виды рода Trichoderma. Триходимерол, изолированный из Т. longibrachiatum, оказывал ингибирующее действие на липополисахаридный фактор некроза в моноцитах человека и использовался как ингибитор септического шока.
Диметиловые производные дисорбетанона, выделенного из морского штамма Trichoderma sp., оказывали антиоксидантное действие.
14) дикетопиперазины - широкая группа веществ, среди которых наиболее известен глиотоксин, выделенный еще в 1941 г из Т. viride. Глиотоксин имеет широкий спектр действия, включая антимикробное, противовирусное и иммуномодулирующее. Анализ культуралыюй жидкости выделенных из компостов штаммов видов Т. harzianum, Т. hamatum и Т. koningii выявил наличие этого токсина (Haggag, 2005). Кроме того, он был выделен также из штамма вида Т. longibrachiatum, задерживающего рост золотистого стафиллококка. Другой токсин из этой группы, глиовирин, оказывал ингибирующее действие на Rhizoctonia solani и Pythium ultimum.
Антибиотическая активность штаммов грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микромицетов
Способность рода Trichoderma подавлять развитие других микромицетов связана как с микопаразитизмом, так и за счет антибиотиков, которые действуют синергически с ферментами (Алимова с соавт., 2007). Исследования показали, что фитопатогены родов Alternaria, Bipolaris и Fusarium имеют неодинаковую чувствительность к метаболитам штаммов рода Trichoderma.
Максимальной антибиотической активностью в отношении Alternaria и Bipolaris обладали штаммы Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и «ТСГ», Trichoderma asperellum «31» и «119»: диаметр зоны подавления роста патогенов составлял от 17.00±0.72 мм до 45.33±1.13 мм, 8.33±0.16 мм до 29.33±0.96 мм, 20.00±0.82 мм до 34.00±0.27 мм и 21.33±0.96 мм до 30.33±0.96 мм соответственно (таблица 3.3). Штаммы Trichoderma asperellum «Mg-97», «ТН-5», «ТН-7», «ТН-11», Trichoderma citrinoviride «МК», «ТН-4», Trichoderma harzianum «М99/5» не показали активности в отношении фитопатогенов Alternaria и Bipolaris (рисунок 3.3-3.4).
Для видов рода Fusarium характерна высокая устойчивость к действию штаммов рода Trichoderma (таблица 3.4). Наиболее устойчивыми к метаболитам исследуемых штаммов оказались виды: Fusarium heterosporum (штаммы «Я6» И «Я8») и Fusarium solani (штамм «Б-04-к»). Они проявили чувствительность всего к 2-3 метаболитам из 15 исследуемых штаммов. Наиболее чувствительным к метаболитам штаммов рода Trichoderma оказался штамм Fusarium sambucinum «Я4», (проявлял чувствительность к метаболитам 8 штаммов), в то время как штамм «Я1» того же вида наоборот был устойчив. Виды Fusarium sporotrichioides (штаммы «Я2» и «ЯЗ») и Fusarium chlamydosporum (штамм «Я7») так же были менее устойчивыми к метаболитам из всех исследуемых видов рода Fusarium.
Максимальную антибиотическую активность ко всем изучаемым видам Fusarium проявлял штамм Trichoderma asperellum «Mg-6», рекомендованный для защиты сеянцев хвойных от фузариозов (Махова, 2007, Садыкова, 2003). Он был активен к 7 штаммам фитопатогенов из 9, диаметр зоны подавления роста патогенов составлял от 9.33±0.42 мм до 28.33±0.42 мм. Так же активным был штамм Trichoderma koningii «ТСЛ-06», он проявил активность к 5 штаммам, диаметр зоны подавления роста патогенов составлял от 14.67±0.68 мм до 22.33±0.83 мм. Штаммы Trichoderma asperellum «31», «119», «ТН-5», «ТН-7», «ТН-11», Trichoderma harzianum «Универсальный» и Trichoderma citrinoviride «ТН-4» не проявили активности в отношении видов рода Fusarium.
Оценка общего коэффициента антибиотической активности в отношении исследуемых видов фитопатогенов позволила отобрать штамм Trichoderma koningii «ТСЛ-06», который проявил наибольшую антибиотическую активность в отношении всех видов трех родов фитопатогенов, коэффициент его активности достоверно отличался от всех остальных штаммов и составлял 42.8, что в два раза превышает ближайший по активности результат штамма Trichoderma asperellum «31» (таблица 3.5). Высокий коэффициент активности в отношении видов рода Fusarium проявил штамм Trichoderma asperellum «Mg-6».
Штаммы Trichoderma asperellum «TH-5», «TH-7», «ТН-11», характеризующиеся низкой гиперпаразитической и не проявивших антибиотической активности в отношении всего спектра исследуемых фитопатогенов не рекомендуется использовать для защиты растений.
Для обоснования отбора наиболее активных штаммов из 18, проявивших ту или иную степень активности, штаммов был использован кластерный анализ.
Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Alternaria и Bipolaris показал, что по набору вышеуказанных признаков вес штаммы, вне зависимости от видового происхождения разделяются на два кластера (рисунок 3.5). В первый кластер вошел штамм Trichoderma koningii «ТСЛ-06», который проявил высокую гиперпаразитическую и максимальную антибиотическую активность в отношении всех видов Alternaria и Bipolaris, за исключением штаммов Alternaria sp. «А-4» и Bipolaris zeae «B-3», к которым он проявил среднюю активность. Второй кластер разделился на два подкластера: в первый подкластер вошли три штамма: Trichoderma asperellum «31» и «119» и Trichoderma viride «0-97», характеризующиеся средней гиперпаразитической, но высокой антибиотической активностью в отношении большинства штаммов видов Alternaria и Bipolaris, кроме штаммов Alternaria sp. «А-1», «А-2» и «А-4», к которым штаммы Trichoderma asperellum «119» и Trichoderma viride «0-97» не проявляли никакой активности. Штамм Trichoderma asperellum «31» не проявлял активности к штамму Alternaria sp. «А-4». Во второй подкластер объединены все остальные штаммы рода Trichoderma.
Анализ активности штаммов рода Trichoderma в отношении комплекса видов Fusarium позволил условно разделить антагонистов на три кластера (рисунок 3.6). В первый кластер вошли два штамма Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06», характеризующиеся высокой гиперпаразитической и антибиотической активностью по сравнению с другими штаммами рода Trichoderma. Второй кластер объединил четыре штамма Trichoderma harzianum «М99/5», Trichoderma asperellum «К-12», Trichoderma viride «Lg-2» и «Lg-1», в третий кластер вошли все остальные штаммы, которые проявляли выборочную активность в отношении некоторых видов Fusarium.
На основании полученных комплексных данных для защиты растений в агроценозах нами были отобраны три штамма: Trichoderma asperellum «Mg-6», Trichoderma harzianum «M99/5» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06».
Содержание селена в биомассе штаммов Trichoderma
Процесс выделения элементарного селена на мицелии при визуальной оценке наблюдали по изменению его окраски. Особенно четко изменение окраски мицелия происходило у штаммов вида Trichoderma asperellum «ТН-5» и «ТН-7». По мере культивирования штаммов на среде, содержащей селен, окраска мицелия изменялась от бледно-кремовой до ярко-красной, за счет образования в клетках восстановленного селена. Вероятно, что аккумуляция и повышение концентрации селена в мицелии приводит к восстановлению селенитов до элементарного селена, сопровождающегося появлением данной окраски.
Это согласуется с результатами других исследователей, отмечавших появление розоватой окраски биомассы микроорганизмов и водорослей (Решетникова, 1997; Пронина и др., 2002). В работе СВ. Летуновой, В.В. Ковальского, В.В. Ермакова (1968) показано, что представители различных систематических групп микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, грибы) восстанавливали в клетках до элементного состояния присутствующие в среде водорастворимые соединения селена (культуры приобретали своеобразную розовую окраску). Со временем розовая окраска становилась красноватой, которая сменялась коричневой. Авторы считают, что селен претерпевает ряд аморфных состояний и, в конечном счете, восстанавливается до металлического состояния. Восстанавливают селен до элементного состояния водоросли Anacystis nidulans и Anabaena variabilia. При выращивании водорослей на средах, содержащих высокие концентрации селена, в клетках образуются гранулы восстановленного селена.
И.А. Решетникова (1997) при росте штамма дрожжей С. tropicalis - 303 с концентрацией селена в среде свыше 200 мкг/100 мл наблюдала ярко 142 красную окраску через 120 часов культивирования, а также образование селеноэфиров и диалкилселенидов, установленное по резкому запаху, напоминающему запах гнилого чеснока и редьки, который характерен для вышеназванных соединений. Наблюдение W. Nickerson и др. показали, что красное вещество внутри клеток дрожжей Candida albicans, культивируемых на среде с селеном, присутствует в цитоплазме в виде гранул (Nickerson и др., 1956, 1963). Анализы красного вещества подтвердили предположение, что гранулы в клетках микроорганизмов не что иное, как аморфный селен (Falcone, Nickerson, 1963). Была высказана гипотеза, что микроорганизмы, восстанавливая селен в клетках до элементного состояния, переводят его в форму, неактивную внутри клеток, и, возможно, таким образом происходит удаление избытка селена из среды. М. Zolokar отмечал отложение красных «капель» селена внутри мицелия Neurospora crassa (Zolokar, 1953).
В результате проведенных исследований установлено, что при содержании селена в среде в концентрации 20 мг/л приводит к подавлению или задержке роста исследуемых штаммов в условиях стационарного культивирования без перемешивания, кроме штамма Trichoderma asperellum «ТН-5», для которого отмечено увеличение выхода биомассы в 2.3 раза по сравнению с контрольным вариантом (таблица 5.6).
При глубинном культивировании токсическое действие селена проявлялось слабее и снижение урожая биомассы не было отмечено для всех исследуемых штаммов. Для штамма Trichoderma asperellum «ТН-5» установлено, что добавление концентрации селена 20 мг/л среды приводило к увеличению выхода биомассы по сравнению с контролем на 1.2% (таблица 5.7)
Проведенные исследования показали, что при содержании селена 20 мг/л в среде в условиях стационарного культивирования без перемешивания штаммы накапливают от 10.76 до 27.43 мкг/г сухой биомассы. В условиях глубинного культивирования наибольшее количество селена накапливалось в мицелии штамма Trichoderma asperellum «ТН-5» и составляло 937.5 мкг/г (таблицы 5.8 - 5.9). Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что у всех трех штаммов накопление селена в глубинных условиях в 14-87 раз выше, чем при культивировании без перемешивания.
Таким образом, по результатам исследований можно заключить, что для производства кормовых добавок, обогащенных микроэлементами можно рекомендовать штамм Trichoderma asperellum «ТН-5».
Оценка степени перевариваемости биомассы штамма Trichoderma asperellum «ТН-5»
Для оценки степени перевариваемости мицелия гриба с добавлением и без селена с помощью установки искусственный желудок был отобран штамм Trichoderma asperellum «ТН-5». Для проведения эксперимента использовали 0.5 г сухого мицелия гриба, который культивировали на среде с 20 мг/г селена, а также контроль - сухой мицелий гриба без селена. Степень переваривания исследовали в течение трех часов, отбор проб проводили каждые 30 минут для измерения оптической плотности. Для определения степени токсичности необходимо сравнение полученных результатов с эталоном, а именно перевариванием яичного альбумина или мясного белка.
Кинетические показатели перевариваемости белка штамма Trichoderma asperellum «ТН-5» и яичного белка представлены в таблицах 5.10 - 5.11 и рисунке 5.2.
По результатам таблиц 5.11 и 5.10 среднее значение активности пепсина на эталонном белке равно 0.28 ТЕ. Средняя активность пепсина при переваривании белка гриба равна 0.204 ТЕ в пробе, не содержащей селен и 0.213 — в пробе с селеном, что в 1.4 и 1.3 раза соответственно меньше средней активности при переваривании яичного белка.
Таким образом, можно сделать заключение, что биомасса мицелия штамма Trichoderma asperellum «ТН-5» с селеном и без селена не является токсичной и может быть использована в качестве кормовой селенсодержащей добавки.
Оценка влияния биопрепарата-триходермина на биологические процессы почв в полевых условиях
В агроэкосистемах биологически активные культуры влияют не только на фитопатогенные микроорганизмы, но и могут привести к нарушению микробиоты, снизить видовое разнообразие микроорганизмов, что может отразится на плодородии почв. Микромицеты рода Trichoderma, искусственно внесенные в почву, вступают в сложные взаимоотношения с естественной микрофлорой. В связи с этим необходима оценка их влияния как на само растение, так и на структуру микробоценоза, так же как для химических средств защиты.
Исследование состава микрофлоры почвы при посеве злаковых показало, что при использования биопрепарата происходят изменения количественного состава микроорганизмов. При посеве пшеницы по сравнению с исходной почвой как у контроля, так и в случае применения биопрепарата наблюдается значительное увеличение количества аммонификаторов в почве, при этом их количество в присутствии триходермина на 25% выше, чем в контроле. Численность азотфиксаторов наоборот, значительно уменьшается, в случае использования биопрепарата уменьшение на 10% больше по сравнению с контролем. Количество актиномицетов, микромицетов и нитрификаторов при посеве пшеницы увеличивается по сравнению с исходной почвой.
При посеве ячменя количество аммонификаторов по сравнению с исходной почвой в контрольном варианте выше, после применения препарата их количество осталось на том же уровне - 17%. При этом количество актиномицетов в опытном варианте существенно увеличивается и составляет 61%. Численность азотфиксаторов, так же как и при посеве пшеницы значительно уменьшается (рисунок 7.3).
Сравнение комплексов микромицетов, заселяющих почвы, до и после обработки триходермином, позволило установить, что они различаются как по богатству видов, так и по частоте встречаемости. Наибольшее видовое разнообразие характерно для комплеска микромицетов прикорневой зоны пшеницы и ячменя, выращенной в контроле. Доминирующее положение среди сапротрофов занимали грибы, относящиеся к родам Penicillium и Aspergillus (рисунок 7.4).
Микромицеты, принадлежащие к другим родам были представлены единичными видами. Наиболее существенные изменения в структуре комплекса микромицетов прикорневой зоны пшеницы и ячменя были обнаружены при обработке триходермином. Отмечено уменьшение видового разнообразия грибов, что свидетельствует о глубине сдвигов в микоценозе. Резко снизилась популяционная плотность возбудителей корневых гнилей.
Исследование состава микрофлоры почвы на посевах Pinus sibirica L. показало, что как в контрольном варианте, так и в присутствии триходермина по сравнению с исходной почвой происходит уменьшение аммонификаторов на 17 и 39% соответственно. При использовании препарата численность азотфиксаторов тоже уменьшается, а актиномицетов увеличивается на 42% (рисунок 7.5).
Сравнение комплексов микромицетов, заселяющих почву питомника обработанных и необработанных триходермином посевов сосны обыкновенной позволило также установить, что они различаются по частоте встречаемости. Положение типично-частых среди фитопатогенов в контроле занимали представители рода Fusarium, Alternaria. Среди сапротрофов наиболее многочисленными были грибы, относящиеся к родам Penicillium и Aspergillus.
После обработки триходермином отмечено уменьшение популяционной плотности возбудителей заболеваний растений родов Bipolaris, Alternaria; снизилась не только частота встречаемости в структуре сообщества, но и их жизнеспособность. Среди сапротрофных видов наблюдалось увеличение количества пеницилов, некоторые виды вошли в состав доминирующих, что может вызвать в дальнейшем возрастание почвоутомления за счет токсинобразующих видов. С другой стороны увеличение жизнеспособности пеницилов, как представителей сапротрофного блока указывает на возрастание супрессивности почвы.
Таким образом, интродуцированные штаммы изменяют структуру микобиоты, подавляя фитопатогены и увеличивая долю сапротрофных групп организмов. Численность микроорганизмов, использующих минеральные формы азота, в опытных вариантах была всегда выше, чем микроорганизмов, использующее органические формы азота, что свидетельствует об интенсивности деструкционных процессов в почве.
