Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Грибы рода Penicillhim как продуценты биологически активных соединений.
2.1.1. Креативность, грибов рода Penicillium. 8
2.1.2. Экологические аспекты поиска новых биологически активных веществ. 10
2.2. Разнообразие вторичных метаболитов алкалоидной природы у грибов рода Penicillium. 11
2.2.1. Эргоалкалоиды. 12
2.2.1.1. Биосинтез эрго алкалоидов. 15
2.2.1.2. Биологическая активность эргоалкалоидов. 17
2.2.2. Дикетопиперазиновые алкалоиды. Рокефортин. 18
2.2.3. Бензодиазепиновые и хинолиновые алкалоиды. 20
2.3. Физиолого-биохимические аспекты биосинтеза алкалоидов. 21
2.3.1. Регуляция биосинтеза алкалоидов. 21
2.3.1.1. Регуляция предшественником. 21
2.3.1.2. Регуляция конечным продуктом. 23
2.3.2. Взаимосвязь алкалоидообразования с ростом и дифференцировкой. 23
2.3.3. Транспорт алкалоидов. 25
2.3.4. Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов. 26
2.3.4.1. Источник углерода. 26
2.3.4.2. Источник азота. 27
2.3.4.3. Макро- и микроэлементы. 28
2.3.4.4. Аэрация и температура. 30
2.4. Таксон-специфичность биосинтеза вторичных метаболитов у грибов рода Penicillium. 31
3. Экспериментальная часть. 36
3.1. Объекты исследования и условия выращивания. 36
3.2. Оценка роста гриба и конидиобразования. 37
3.3. Выделение и очистка алкалоидных фракций. 37
3.4. Качественный анализ алкалоидных фракций. 38
3.5. Выделение и очистка индивидуальных метаболитов и их идентификация. 38
3.6. Вьтделение и очистка новых метаболитов P. citrinum BKM'FW-800 и установление их структуры. 39
3.7. Количественное определение алкалоидов. 40
3.8. Выявление причины снижения концентрации эргоалкалоидов и хиноци-трининов в культуральной жидкости. 40
3.9. Определение спектра биологической активности хиноцитрининов А и Б. 40
3.10. Определение содержания L-триптофана, L-лейцина, L-изолейцина. 41
4. Результаты и их обсуждение. 42
4.1. Скрининг продуцентов вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Penicillium. 42
4.1.1. Идентификация вторичных метаболитов, продуцируемых штаммами P. aurantiogriseum Diercks 1901. 45
4.1.2. Идентификация вторичных метаболитов, продуцируемых штаммами P. variabile Sopp 1912. 49
4.1.3. Идентификация вторичных метаболитов, продуцируемых штаммом P. citrinum Thorn ВКМ FW-800. 51
4.1.4. Установление структуры и биологическая активность новых метаболитов, продуцируемых штаммом P. citrinum ВКМ FW-800. 54
4.2. Особенности роста P. aurantiogriseum ВКМ FW-766 и биосинтеза роке-фортина 60
4.3. Штаммы P. variabile, как продуценты ругуловазинов. 62
4.3.1. Особенности роста P. variabile ВКМ FW-806 и биосинтеза ругуловазинов. 62
4.3.2. Исследование возможной взаимосвязи процессов роста и развития гриба и биосинтеза ругуловазинов у P. variabile. 66
4.4. P. citrinum ВКМ FW-800, как продуцент эргоалкалоидов и хиноцитрининов. 71
4.4.1. Особенности роста P. citrinum и биосинтеза алкалоидов. 71
4.4.2. Выявление причины снижения концентрации эргоалкалоидов и хиноцитрининов в культуральной жидкости P. citrinum. 16
4.4.3. Влияние аминокислот на рост P. citrinum и биосинтез алкалоидов. 77
4.4.3.1. Влияние L-триптофана, L-лейцина и L-изолейцина, внесенных при посеве. 78
4.4.3.2. Влияние L-триптофана, внесенного в стационарной фазе роста. 82
4.4.3.3. Влияние L-лейцина и L-изолейцина, внесенных в стационарной фазе роста. 85
Заключение 90
Выводы 92
Список литературы 93
- Грибы рода Penicillhim как продуценты биологически активных соединений.
- Объекты исследования и условия выращивания.
- Скрининг продуцентов вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Penicillium.
Введение к работе
Природные соединения служат основным источником лекарств в течение столетий. Более половины используемых фармацевтических препаратов являются продуктами естественного происхождения (Clark, 1996). Грибы рода Penicillium известны как продуценты 380 вторичных метаболитов, обладающих биологической активностью (Dreyfuss, Chapela, 1994). Особый практический и научный интерес представляют азотсодержащие вторичные метаболиты — алкалоиды. Микробные алкалоиды, а именно, эргоалкалои-ды, нашли широкое применение в медицинской практике (Flieger et al., 1997). Они способны эффективно связываться с рецепторами нейромедиаторов и влиять на зависимые от них физиологические процессы. В настоящее время внимание исследователей смещается от традиционно использующихся в медицине пептидных эргоалкалоидов, продуцируемых грибами рода Claviceps, к клавиновым алкалоидам. Последние обладают более простой структурой, легко подвергающейся химической модификации, благодаря чему создаются препараты с более селективным действием (Bolcskei, 2005). Грибы рода Penicillium являются перспективным источником новых клавиновых эргоалкалоидов с "необычной" структурой (Козловский, 1999). Алкалоиды, относящиеся к другим структурным типам (дикетопиперазиновым, бензодиазепиновым и хинолиновым), также обладают ценными фармакологическими и терапевтическими свойствами. Примером служит хинолиновый алкалоид 3-О-метилвиридикатин - сильный ингибитор фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), вызванной вирусом иммунодефицита (Heguy, 1998). Для некоторых алкалоидов установлено антибиотическое и цитотоксическое действие. Крайне интересный и перспективный аспект исследования процессов алкалоидообразования микроскопическими грибами - это возможность использования спектра некоторых вторичных метаболитов, в том числе алкалоидов, в качестве хемотаксономических маркеров в таксономии (Samson, Frisvad, 2004).
Состояние проблемы. Возрастающий интерес к исследованиям вторичных метаболитов алкалоидной природы обусловлен открытием и разработкой новых лекарственных средств и биохимических реактивов. Поэтому задача выделения и изучения продуцентов новых биологически активных соединений по-прежнему актуальна. Однако методики отбора продуцентов алкалоидов находятся на стадии разработки. В фундаментальных исследованиях особое внимание уделяется выяснению роли вторичных метаболитов в жизненном цикле продуцентов, так как функции их не вполне ясны.
В настоящее время поиск новых продуцентов биологически активных соединений интенсивно ведется среди грибов, местообитания которых мало изучены и часто свя \ заны с экстремальными условиями, так как именно у них весьма вероятен синтез новых вторичных метаболитов и потенциальных биоактивных соединений, которые помогают продуценту адаптироваться и выживать. Исследования грибов-эндофитофов (Shibata et al., 1988), пресноводных и морских грибов (Poch, Gloer, 1989, Schwartz et al., 1989) подтвердили это описанием новых соединений. Логично ожидать, что микроскопические грибы, длительное время находившиеся в условиях естественной криоконсервации в мно-голетнемерзлых древних отложениях, будут отличаться по своим физиолого-биохимическим характеристикам, в том числе и по синтезу вторичных метаболитов, от представителей тех же видов, но выделенных из современных мест обитания и прошедших иной путь эволюции.
Цель и задачи исследования. Цель работы - поиск новых продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов среди грибов рода Penicilliwn, вьщеленных из вечной мерзлоты и выявление особенностей их роста и алкалоидообразования.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- провес ги скрининг продуцентов азотсодержащих вторичных метаболитов среди гри бов-реликтов рода Penicilliiim;
идентифицировать метаболиты, установить структуру и определить спектр биологического действия новых соединений;
выявить особенности роста и биосинтеза вторичных метаболитов у активных штаммов;
- определить влияние различных факторов, а именно, ионов цинка и аминокислот, на биосинтез вторичных метаболитов у штаммов-продуцентов.
Научная новизна работы. Найдены новые продуценты алкалоидов, среди них штамм P. citrinum ВКМ FW-800, синтезирующий неизвестные ранее вторичные метаболиты хинолиновой природы- хиноцитринины А и Б и редко встречающиеся эргоалкалоиды -агроклавин-1 и эпоксиагроклавин-I. Установлено строение и исследована биологическая активность хиноцитрининов. Обнаружена продукция клавиновых эргоалкалоидов у Р. variabile и дикетопиперазиновых алкалоидов у P. aurantiogriseum.
Показано, что у P. citrinum ВКМ FW-800 ионы цинка стимулировали процессы основного и вторичного метаболизма. Процессы биосинтеза и экскреции, а также поглощение алкалоидов клетками продуцента отражают способы регуляции баланса внутриклеточного триптофана. Выявлена корреляция между уровнем свободного внутриклеточного изо-лейцина и интенсивностью биосинтеза хиноцитрининов.
Практическая ценность. Получены новые биоактивные вещества хинолиновой природы - хиноцитринины с антимикробными и противораковыми свойствами. Выде 7 ленный штамм P. citrinum может быть использован для получения хиноцитршшнов и эпоксиагроклавина-I, относящегося к клавиновым эргоалкалоидам, терапевтическое действие которых широко применяется в медицине. Подобраны наиболее благоприятные условия биосинтеза этих соединений. Разработан и апробирован лабораторный регламент получения препаратов хиноцитрининов и тартрата эпоксиагроклавина-1.
Результаты работы могут быть использованы в биотехнологии и при поиске новых биоактивных веществ.
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории вторичных метаболитов в рамках плана научно-исследовательских работ ИБФМ РАН по теме "Теоретические основы получения микробных метаболитов, ферментов и биологически активных соединений" (№ Госрегистрации 01.2.007 08220) и соответствует темам целевых конкурсных грантов РФФИ «Хиноцитринины - новые низкомолекулярные биологически активные вторичные метаболиты гриба Penicillium citrinum, выделенные из вечной мерзлоты: изучение биосинтеза и механизма действия» (№04-04-49308); Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) «Biologically active secondary metabolites of fungi from permafrost regions» 436 RUS 17/64/02(436 RUS 113/677/0-1).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН, на 7-ой конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2003), на международной конференции "Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина" (Пущино, 2004), на XV конгрессе Европейских Микологов (Санкт-Петербург, 2007), на втором съезде микологов России (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 7 статей. 2. Обзор литературы. 2.1. Грибы рода Penicillium как продуценты биологически активных соединений.
Микроскопические грибы рода Penicillium широко распространены в природе и занимают самые разнообразные экологические ниши. Из общей численности грибной микрофлоры около 40% изолятов относятся к этому роду. Интерес к этим грибам возник в начале прошлого столетия в результате открытия способности синтезировать в процессе своей жизнедеятельности биологически активные вещества, которые подавляли рост различных бактерий или ослабляли их развитие. В 1895 году из культуральной жидкости P. sp. было выделено кристаллическое соединение - микофеноловая кислота, которая подавляла рост бактерий сибирской язвы. В 1929 году Александром Флемингом был открыт новый препарат пенициллин, который только лишь в 1940 году удалось выделить в кристаллическом виде. Это новое и весьма эффективное химиотерапевтическое вещество было получено в результате жизнедеятельности гриба P. chrysogenum (Егоров, 1986). Применение пенициллина в борьбе с различными инфекционными заболеваниями и воспалительными процессами явилось мощным стимулом для поиска новых, еще более эффективных антибиотических веществ, образуемых различными группами микроорганизмов.
Грибы рода Penicillhim как продуценты биологически активных соединений
Поиск новых грибных метаболитов обычно начинается с установления креативности организма, то есть способности продуцировать различные вторичные метаболиты. Вначале для определения креативности грибов использовали метаболиты, имеющие промышленное значение. Для грибов рода Penicillium таковыми являются пенициллин, гризе-офульвин, компактнії (Kitano, 1983; Stolk et al., 1990). Однако эти соединения представляют лишь незначительную часть от числа известных вторичных метаболитов, поэтому такая оценка оказалась ненадежной. Некоторые вещества проявляют свою высокую биологическую активность и становятся фармацевтическими препаратами только после проведения химической модификации их структуры. Поэтому для определения креативности таксона необходимо учесть общее число грибных метаболитов, включая антибиотики, ми-котоксины, и соединения с неизвестной биологической активность. По количеству синтезируемых вторичных метаболитов установлены "высоко активные" и "неактивные" области внутри грибного царства (Dreyfuss, Chapela, 1994). Высоко активные области относят к грибным группам потенциально способных продуцировать большое разнообразие вторичных метаболитов, независимо от их коммерческого использования. К ним относятся несовершенные грибы родов Aspergillus, Penicillium, Acremonium и Fusarium.
Объекты исследования и условия выращивания
Объектами исследований служили 55 штаммов 12 видов рода Penicillhim Link, полученных из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН. Штаммы P. aurantiogriseum Diercks FW-738, FW-741, FW-766; P. brevicompactum Diercks FW-725, FW-791; P. chrysogenum Thorn FW-653, FW-659, FW- 679, FW-684, FW-694, FW-720, FW-721, FW-778, FW-799; P. citrinum Thorn FW-800; P. decumbens Thorn FW-686, FW-689, FW-692, 693; P. glabrum Westling FW-652, FW-678; P. minioluteum Diercks FW-661, FW-773, FW-782; P. purpurogenum Stoll FW-772; P. restrictum Gilman FW-723, FW-752; P. nigulosum Thorn FW-665, FW-717, FW-733, FW-769; P. variabile Sopp FW-655, FW-806, FW-811, FW-816, FW-818; FW-1449, FW-1451, FW-1452, FW-899, FW-2884, FW-2886; P. puberulum (=P. aurantiogriseum) Diercks FW- 621; P. verrucosum Diercks FW-875, FW-877, FW-878, FW-907, FW-908 были выделены из многолетнемерзлых древних отложений Арктики и Антарктики, датируемых возрастом 0,01-3,0 млн. лет и идентифицированы по макро- и микроморфологическим признакам в секторе грибов Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН СМ. Озерской, Г.А. Кочкиной, Н.Е. Иванушкиной (Кочкина и др., 2001). Штаммы P. variabile Sopp ВКМ FW-2528, FW-2531, FW-2566, FW-2701, F-2075, FW-2758, FW-2762 были выделены из различных современных местообитаний.
Штаммы были получены в лиофилизированном виде. При изучении продукции вторичных метаболитов штаммы выращивали на косяках с сусло-агаром в течение 14 дней при температуре 24 ± 1С. Посев проводили из водной суспензии спор 14-суточных культур на среду Абе (Абе et al., 1967) следующего состава (г/л дистиллированной воды):
Изучение возможной взаимосвязи процессов роста и развития гриба P. variabile ВКМ FW-806 и биосинтеза ругуловазинов проводили при глубинном культивировании штамма на трех средах. В качестве контрольной использовалась среда Абе с ионами цинка. Две другие отличались от контрольной наличием дрожжевого экстракта или пептона ("Difco", США) в концентрации 0,5 г/л. При изучении влияния ругуговазинов на дифференцировку культуры в среду с дрожжевым экстрактом вносили ругуловазины в концентрации 3,3 мг/л при посеве, на 7 сут и на 11 сут роста.
При изучении влияния аминокислот на рост и биосинтез алкалоидов P. citrinum ВКМ FW-800 в среду Абе с цинком вносили L-триптофан, L-лейцин, L-изолейцин ("Reanal", Венгрия) в концентрациях 0,25 и 2 мМ при посеве или в стационарной фазе роста на 10 и 11 сут.
Штаммы культивировали глубинным способом в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со 150 мл среды при 24+1 С на качалке (220 об/мин). При скрининге культур отбор проб (по 3 колбы) проводили на 7 и 14 сут роста грибов. При исследовании динамики роста и синтеза алкалоидов P. citrinum ВКМ FW-800 пробы отбирали через 24 ч в трех повторностях.
Скрининг продуцентов вторичных метаболитов среди грибов-реликтов рода Penicillium
С целью изучения способности грибов рода Penicillium к биосинтезу азотсодержащих вторичных метаболитов проведен скрининг среди 42 штаммов 12 видов, выделенных из многолетнемерзлых древних отложений Арктики и Антарктики, датируемых возрастом 0,01-3,0 млн. лет (Кочкина и др., 2001). Скрининг проводили согласно схеме, представленной на рис. 6.
Известно, что для биосинтеза вторичных метаболитов грибами-продуцентами особое значение имеет состав среды культивирования. В ранних работах по поиску алкалоидов у мицелиальных грибов было предложено использовать сочетание углевода и кислоты ЦТК в качестве двух источников углерода и энергии (Abe, 1967). Данная среда обеспечивала приемлемый в большинстве случаев уровень синтеза алкалоидов у многих изученных штаммов грибов Claviceps, Penicillium (Rechacek, Saidl, 1990; Решетилова, Козловский 1990). Использование некоторыми исследователями комплексных сред зачастую приводило к отрицательным результатам и артефактам. Пробы отбирали в фазе активного роста (7 сут) и в стационарной фазе роста гриба (14 сут). Такой подход вызван полученными ранее данными о зависимости биосинтетической способности грибов от физиолого-биохимических способностей, определяемых возрастом культуры.
У большинства ранее изученных грибов при глубинном культивировании основное количество вторичных метаболитов экскретировалось в среду, поэтому при скрининге анализировались только экстракты культуральной жидкости.
Для анализа способности грибов к алкалоидообразованию использовали метод тонкослойной хроматографии хлороформных экстрактов культуральной жидкости кислой и щелочной природы. Данный метод прост в обращении, отличается быстротой выполнения и не требует особых материальных затрат по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографией, часто используемой при скрининге вторичных метаболитов (Samson, Frisvad, 2004). Хроматограммы просматривали в УФ-свете и опрыскивали реактивом Эрлиха и реактивом Драгендорфа. Эти реагенты являются очень чувствительными и дают реакции с 0,05-2 мкг вещества в зоне. Цвет и интенсивность окрашивания с рек-тивом Эрлиха определяются структурой индолсодержащего соединения (Hofmann, 1964, Framm et al., 1973). Реактив Драгендорфа реагирует на третичные амины, четвертичные аммониевые соединения и алкалоиды (Досон и др., 1991).
