Содержание к диссертации
Введение
1. Термофильные прокариоты: общая характеристика, положение в системе микроорганизмов, видовое разнообразие 5
2. Антибиотически активные вторичные метаболиты
2.1. Антибиотики-полипептиды: общий обзор 12
2.2. Бактериальные антибиотики - продукты рибосомного синтеза 16
2.2.1. Бактериоцины класса I 25
2.2.1.1. Субтилин 26
2.2.1.2. Эрицины 29
2.2.1.3. Субланцин 168 30
2.2.1.4.Мерсацидин 31
2.2.2. Бактериоцины класса II
2.2.2.1. Коагулин 32
2.2.3. СубтилозинА 34
2.2.4. Другие бактериоцины, образуемые бациллами 36
2.3. Пептидные и другие антибиотики, образуемые бактериями-термофилами, не относящимися к бациллам ...39
3. Железосвязывающие метаболиты микроорганизмов - сидсрофоры 41
3.1. Образование железосвязывающих метаболитов 46
3.2. Транспорт ферросидерофорных молекул и их утилизация бактериями 50
3.3. Контроль продукции сидерофоров. Бактериальные белки-металлорегуляторы 52
Экспериментальная часть
4. Материалы и методы 57
5. Результаты и обсуждение
5.1. Штаммы бактерий-термофилов и образование ими антибиотических метаболитов 64
5.2. Закономерности образования антибиотиков при разных условиях культивирования штаммов-продуцентов 70
5.3. Бактер политическая активность штаммов В, licheniformis VK2 и VK.21 80
5.4. Анализ свойств антибактериальных метаболитов в смесях и выделение индивидуальных антибиотиков 84
5.5. Структурный анализ соединений VK21-А, VK21-B и VK21-C 90
5.6. Антибиотические свойства метаболитов штамма В. licheniformis VK21 96
5.7. Образование катехольных сидерофоров термофильными штаммами бацилл 103
5.8. Выделение, анализ и установление структуры катехольного сидерофора штамма В. licheniformisVK21 109
Выводы 115
Благодарности 116
Список литературы 118
- Антибиотики-полипептиды: общий обзор
- Другие бактериоцины, образуемые бациллами
- Образование железосвязывающих метаболитов
- Бактер политическая активность штаммов В, licheniformis VK2 и VK.21
Антибиотики-полипептиды: общий обзор
Структурное многообразие природных низкомолекулярных пептидов и, зачастую, необычность свойств многих из них, обусловлены не только комбинаторным варьированием последовательности звеньев в полимерной цепи, как у белков, но также модифицированием аминокислотных остатков либо их изомеризацией в ходе биосинтеза, включением в пептидные олигомеры небелковых амино- и оксикислот, присоединением липидных, углеводных, ароматических и других заместителей, образованием внутри- и межмолекулярных циклов. Всё это, вместе с широкой распространённостью разнородных по строению и функциям пептидных соединений среди огромного числа живых существ делает их уникальным классом биологически активных метаболитов [Nakano, Zuber, 1990]. Практически во всех группах высших эукариот найдены представители, в организмах которых образуются пептидные антибиотики, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и нередко проявляющие также антифунгальные, антивирусные и цитотоксические свойства. У позвоночных животных и членистоногих составной частью систем неспецифического иммунного ответа являются дефензины и протегрины -обогащенные аргининовыми и цистеиновыми остатками р-структурные пептиды, которые синтезируются в клетках крови, а у насекомых секретируются в гемолимфу [Кокряков и др., 1997]. В отличие от них, а-спиральные катионные пептиды животных (амфибий, рыб, насекомых) - цекропины, магаинины и другие, также обладающие широким спектром антибиотической активности, играют преимущественно роль барьера, предохраняющего организмы-продуценты от микробной инвазии, особенно при раздражении либо повреждении их внешних покровов. Токсины насекомых также содержат полипептиды антимикробного и цитотоксического действия, наподобие мелиттина пчелиного яда [Boman, 1995]. В эукариотических пептидных метаболитах чаще всего отсутствуют какие-либо необычные структурные модификации, а их биологическая активность в основном обусловлена свойством определённых аминокислотных последовательностей формировать так называемые амфипатические вторичные структуры. Принадлежащие к разным типам -классические а-спирали, полипролиновые спирали, р-структуры и структуры типа петель, стабилизированные одной или несколькими дисульфидными связями, - все они демонстрируют противоположную ориентацию боковых групп полярных (в том числе основных) и неполярных аминокислот. Полимерные молекулы, уложенные подобным образом, имеют гидрофильные, несущие суммарный заряд от +2 до +7, и гидрофобные поверхности и способны взаимодействовать с широким кругом соответствующих молекулярных мишеней» мембранных и внутриклеточных [Hancock, Chappie, 1999].
Многочисленные пептидные антибиотики, образуемые низшими грибами и прокариотами, отличаются от эукариотических не только неповторимыми вариациями в строении их молекул, но также разнообразием биологических свойств, из-за которого не всегда удается однозначно судить о роли таких метаболитов в жизнедеятельности самих продуцентов [Vining, 1990; Vining, von Dohren, 1995]. В большинстве своём антибиотические полипептиды микроорганизмов действуют на довольно широкий круг объектов, но некоторые проявляют весьма ограниченный спектр активности. Наиболее приемлемая их классификация основана на характере строения самой пептидной цепи, присутствии в составе молекулы различных заместителей и небелковых аминокислот. Одни соединения имеют линейную структуру, другие - циклическую или сочетают в молекуле один или несколько циклов с линейными участками последовательности [Шемякин и др., 1961; Егоров и др., 1987]. У бактерий и грибов биосинтез многих низкомолекулярных пептидных метаболитов, в том числе ряда антибиотиков, происходит без участия рибосомного аппарата за счёт наличия специфических мультидоменных ферментов или их комплексов - пептидил синтетаз. Они осуществляют как полимеризацию аминокислот, включая в цепи и необычные для белков мономеры (к примеру, орнитин), так и модифицирование соединений в процессе их образования: изомеризацию или трансформацию аминокислотных остатков, введение разнообразных заместителей, замыкание циклов [Kleinkauf, von D6hren, 1990]. Другие антибиотические пептиды, а кроме них - антибиотически активные белки, объединяемые под названием бактериоцинов, являются продуктами соответствующих структурных генов и во всех случаях синтезируются в форме нормальных пептидов-предшественников, которые уже затем подвергаются ферментативному пост-трансляционному процессингу [Hansen, 1993].
Давняя и устойчивая точка зрения рассматривает все антибиотики низших организмов (не только пептидные) исключительно как фактор, обеспечивающий их продуцентам преимущество в межвидовой конкуренции, что особенно важно для медленно растущих микроорганизмов - таких как грибы и актиномицеты, обитатели преимущественно почвенных микробиоценозов, обильных видами и ограниченных ресурсами [Лукин, 1987]. Именно среди них наиболее многочислены виды и штаммы, образующие большое количество антибиотических соединений. Несомненно то, что секретирующие их организмы получают реальное преимущество в заселении определённых экологических ниш и сохранении в них своего присутствия в течение продолжительного времени. Убедительный пример такого рода - флуоресцирующие бактерии рода Pseudomonas, образующие феназиновые и диоксихинолиновые пигменты, которые эффективно подавляют развитие ряда других бактерий и некоторых грибов и действительно благоприятствуют колонизации ризосферных зон такими псевдомонадами [Tomashow, Weller, 1988]. Однако оценка антибиотиков микроорганизмов исключительно как «оружия против чужаков» не объясняет многие особенности, связанные с их продукцией. Один и тот же штамм нередко способен к биосинтезу целого набора антибиотических вторичных метаболитов, порой одновременно, но чаще всего - при изменении условий в среде обитания, в том числе на разных фазах роста культуры. Придерживаясь лишь теории о защитной функции антибиотиков, невозможно объяснить функциональное назначение тех из них, которые не секретируются продуцентами ни на каких этапах их развития [Schaffer, 1969; Katz, Demain, 1977]. Интенсивное образование микроорганизмами низкомолекулярных соединений зачастую совпадает по времени с другими событиями их жизнедеятельности: начальными этапами днфференцировки (образованием спор у бацилл [Лукин, Пермогоров, 1983; Marahiel et al., 1993], воздушного мицелия у актиномицетов [Chater, 1989]), секрецией в среду литических ферментов [Priest, 1977; Лукин, 1987], запуском механизма контроля строгого ответа [Ochi, Ohsawa, 1984; Bascaran et al., 1991]. Из-за немногочисленности и, порой, неоднозначности экспериментальных данных нет возможности судить о наличии каких-либо определённых связей между этими процессами. Возможно, все они стимулируются одними и теми же сигналами либо же в их регуляции задействованы общие факторы, которые и определяют параллельное течение столь разных событий [Msadek, 1999]. Существуют и гипотезы, в которых отстаивается взгляд на биологически активные вещества как агенты, контролирующие (среди прочих) ход развития образующих их организмов - отдельных клеток либо всей популяции [Лукин, Пермогоров, 1983]. Отмечается, что способность к продукции многочисленных и разнообразных по структуре и свойствам вторичных метаболитов, многие из которых являются антибиотиками, наиболее выражена у прокариот с усложнённым строением и жизненным циклом. Таковы споровые формы - актиномицеты и бациллы, обладающие разветвлёнными системами контроля дифференцировки и смены фаз в ходе их развития [Vining, 1990].
Другие бактериоцины, образуемые бациллами
Низкомолекулярный (около 2 Ша) термостабильный пептид, именуемый бациллоцин 490, был выделен из супернатанта культуры термофильного штамма В. licheniformis, проявляющего антагонистические свойства в отношении некоторых других видов бацилл [Martirani et al., 2002], При росте продуцента на полноценной среде, содержащей триптическии гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, образование антибиотического метаболита происходило в поздней log-фазе и стимулировалось добавлением в исходную среду желатина или молока. Антибиотик обладал бактерицидным действием преимущественно на В. smithii, Geobacillus stearothermophilus и на сибиреязвенную палочку -В. anthracis. Активность против других видов бацилл, стафилококков и листернй была очень слабой либо совсем не проявлялась. В отличие от низина, почти неактивного при рН ниже 5, бациллоцин полностью или частично сохранял свою эффективность и при большей кислотности среды, до рН 3.5-г4, а также при высоком рН 10-г11. Эти свойства, наряду с устойчивостью антибиотика при длительном хранении в растворе и при термообработке (вплоть до 100С), делают его перспективным для широкого применения в индустрии пищевых продуктов в качестве натурального консерванта.
Образование бактериоцинов некоторыми факультативно-анаэробными бактериями стимулируется при их росте в бескислородных условиях, хотя причины такого явления до сих пор остаются невыясненными [Malkhosyan et al., 1991]. Один из штаммов В. licheniformis, выделенный из рубцового отдела желудка крупного рогатого скота, способен к продукции гидрофобного 12-членного антибиотического пептида лихенина, который активен в отношении ряда представителей микрофлоры рубца - грамположительных и, в меньшей степени, грамотрицательных бактерий, облигатных и факультативных анаэробов. Присутствие кислорода полностью подавляет как образование бациллой антибиотика, так и его активность in vitro. Последнее связывают с возможностью окисления присутствующего в пептиде остатка цистеина. Сорбция клеток на твёрдой поверхности приводит к возрастанию уровня антибиотической активности в супернатанте культуры штамма-продуцента [Pattnaik et al., 2001]. В данном случае наиболее интересна возможная связь между биосинтезом антибактериального соединения и биохимическим статусом клетки. Системы общеклеточной регуляции, задействованные в активации и репрессии ключевых генов, обеспечивающих возможность перехода факультативно-анаэробных микроорганизмов с дыхательного метаболизма на бродильный и обратно, с большой вероятностью могут контролировать и определённые этапы в образовании вторичных биосинтетических продуктов [Kalmokoff, Teather, 1997].
Помимо бактериоцинов, термофильные штаммы В. licheniformis образуют низкомолекулярные пептидные антибиотики, действующие на различные эукариотические микроорганизмы. Их условное название - амёбоцины (amoebicins) связано с высокой активностью этих метаболитов в отношении простейшего Naegleria fowleri, патогенные разновидности которого вызывают амёбный менингоэнцефалит, опасное заболевание людей преимущественно молодого возраста [Cordovilla et al., 1993]. Исследованные амёбоцидные соединения различаются размерами молекул и антибиотическим свойствам, по строению же они охарактеризованы лишь отчасти [Galvez et al„ 1993; Lebbadi et al., 1994]. Две группы их, с массой в области 3.0-3.2 kDa у одних веществ и около 1,4 kDa у других, имеют общие особенности: гидрофильный характер пептидной цепи, относительно высокое содержание пролина и отсутствие каких-либо необычных аминокислот - лантионовых или же дегидратированных производных серина и треонина, как в лантибиотиках, орнитина, аминокислотных D-энантиомеров, липидных или углеводных остатков. Какие-либо данные о первичной структуре этих амёбоцинов не опубликованы. Интенсивное их образование наблюдалось при выращивании штаммов-продуцентов в сложных средах, содержащих инфильтраты сердца и головного мозга, либо же при кокультивации бактерий с амёбами, чувствительными к антипротозойным метаболитам [Lebbadi et al., 1995]. Отмечалась корреляция между продукцией антибиотиков и формированием эндоспор в клетках В. licheniformis в течение стационарной фазы роста [Galvez et al., 1993]. Кроме литического действия на амёбы рода Naegleria, эти пептиды подавляют также рост некоторых видов грибов, в том числе патогенного Cryptococcus neoformans, Aspergillus niger, дрожжей родов Candida и Saccharomyces; из бактерий к ним оказались чувствительны только Corynebacterium glutamicum и вегетативные клетки В. megaterium. На развитие других грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов и на прорастание бактериальных эндоспор гидрофильные амёбоцины не оказывали влияния. Ещё один антибиотик, фунгицин М4 (fungicin), образуемый штаммом В. licheniformis М-4, представляет собой пептид массой 3.4 Ша, обогащенный остатками пролина, тирозина и глутаминовой кислоты, и обладает довольно узким спектром антифунгального действия [Lebbadi et al., 1994]. Наконец, от вышеописанных антибиотических метаболитов сильно отличаются несколько гидрофобных пептидов, также обнаруженных у В. licheniformis; эти вещества, сходные между собой по строению и активности, имеют массу около 1.87 kDa, содержат 56 мол% лейцина и подавляют развитие не только амёб, но и широкого круга бактерий [Galvez et al., 1994].
Способность к биосинтезу разнообразных бактериоцинов, столь распространённая между штаммами В. subtilis и родственного ей вида В. licheniformis, даёт основания к поиску продуцентов пептидных антибиотиков и среди других бацилл, систематически близких им. Антибиотические метаболиты, синтезируемые с участием рибосом образуют некоторые представители таксономически обособленной «группы В. cereus» (включает также В. thuringiensis, В. mycoides и сибиреязвенную палочку - В. anthracis), Цереин 7 (cerein) -гидрофобный бактериоцин В. cereus с молекулярной массой 3.9 Ша относится к классу II; он подавляет развитие грамположительных бактерий родов Listeria и Clostridium, видов Lactococcus lactis, В. subtilis, но неактивен против золотистого стафилококка и грамотрицательных микроорганизмов, Е. coli и псевдомонад [Oscariz et al., 1999; Oscariz, Pisabarro, 2000]. Сходный с ним пептидный продукт другого штамма того же вида был выделен и частично охарактеризован в работе [Bizani, Brandelli, 2002]. Долгое время было известно, что многие разновидности энтомопатогенной В. thuringiensis проявляют антагонистические свойства в отношении грамположительных бактерий, включая другие штаммы своего вида [Нетыкса и др., 1979], но индивидуальные антибиотики, вырабатываемые этими бациллами, были подробно изучены лишь в последние годы. Турицин 7 (thuricin), имеющий массу около 11.6 kDa, обладает относительно широким спектром антибактериального действия и в частности подавляет рост листерий [Cherif et al„ 2001]. Энтомоцин 9, также крупный пептид (12.4 Ша), сочетает антилистериальные свойства с активностью против некоторых штаммов Pseudomonas aeruginosa и нескольких видов грибов. Несмотря на относительно крупные размеры, этот метаболит необычайно устойчив к высокой температуре и сохраняет свои свойства в широком диапазоне рН, хотя его продуцент, В. thuringiensis ssp, entomocidus, не является термофилом [Cherif et al., 2003]. В отличие от них, 10,5 kDa тохицин (tochicin) эффективен только в отношении бацилл, близко родственных образующему его виду В. thuringiensis ssp, tochigiensis [Paik et at., 1997]. Известен также низкомолекулярный турицин 439 [Ahem et aL, 2003], существующий в двух схожих разновидностях, А (2.92 kDa) и В (2.80 kDa). Они не отличаются по качественным и количественным характеристикам активности; оба подавляют развитие штаммов В. cereus и В. thuringiensis, а кроме них - только Listeria innocula.
Образование железосвязывающих метаболитов
У бактерий и грибов биосинтез пептидных сидерофоров, как и ряда других низкомолекулярных пептидов, осуществляется с участием специфических пептидил-синтетаз [von Dohren et al., 1993]. Генетические системы, кодирующие эти ферментные комплексы, к настоящему времени идентифицированы во многих микроорганизмах, хотя синтетазы сидерофоров детально изучены преимущественно у грамотрицательных прокариот [Quadry, 2000; Crosa, Walsh, 2002]. Общая особенность всех синтетаз пептидов - их модульная организация, обеспечивающая последовательное соединение более или менее специфично узнаваемых молекул мономеров, иногда предварительно модифицируемых. Каждый ферментный модуль содержит по меньшей мере три домена с разными функциями. Аденилирующий домен катализирует реакцию определённой аминокислоты с АТФ, нековалентно связанным в его реакционном центре; образующийся активированный полупродукт - аминоациладенилат далее расщепляется с переносом ацильного фрагмента на SH-rpynny кофактора 4-фосфопантетеина, «пришитого» к консервативному сайту в другом домене, тиолирующем. Наконец, активность конденсирующих доменов обеспечивает формирование амидной связи между компонентами соседних нагруженных модулей. Остаётся невыясненным, чем определяется строгая последовательность этапов в ходе такого синтеза, называемого тиоматричным (thiotemplate) [Kleinkauf, von Dohren, 1990]. Модули пептидил синтетаз могут содержать также домены, отвечающие за эпимеризацию аминокислот - компонентов олигомера; кроме того, особые домены обеспечивают (посредством разных механизмов) отсоединение готового пептида-олигомера от несущего его белка [Raymond et aL, 2003] . Отдельный член синтетазного комплекса может быть одном одульным или содержать несколько модулей в своём составе; масса таких субъединиц нередко превышает 1000 kDa.
Закономерности продукции катехольных сидерофоров были изучены на модели энтеробактина - циклического трилактона 2,3-DHB-Ser, первоначально описанного у Е, coli и сальмонелл, а затем у стрептомицетов, таксономически весьма далёких от энтеробактерий (см. табл. 3). Гены, ответственные за образование этого хелатора, его секрецию и за утилизацию его комплексов с Fe кластеризованы на хромосоме Е. coli в составе нескольких транскрипционных единиц; следует отметить, что продукция сидерофоров у всех организмов непременно контролируется количеством доступного клеткам железа. Относительно высокая его концентрация в цитоплазме приводит к подавлению биосинтеза хелаторов [Crosa, 1989); ключевыми компонентами в этой регуляции служат белки-репрессоры семейства Fur, активные в комплексе с ионами Fe2+ (см. раздел 3.3 настоящего обзора). Известны бактерии, у которых осуществляется конститутивный синтез 2,3-DHB и её секреция в среду, приводящая к солюбилизации малорастворимых железистых минералов, но такой метаболит не считается сидерофором [Walsh, Warren, 1971; Drechsel, Jung, 1998].
В ходе биосинтеза энтеробактина продукты генов entC, entB и entA последовательно конвертируют хоризмат в 2,3-DHB; гены entE и entF кодируют субъединицы синтетазы. Активацию ароматической кислоты осуществляет аминоацил-СоА-лигаза EntE, переносящая затем её остаток на фофсфопантетеинилированный С-концевой домен EntB -бифункционального белка, N-концевая часть которого функционирует как изохоризмат лиаза в пути синтеза 2,3-DHB (рис. 5), образуя её непосредственный предшественник [Gehring et al., 1997]. EntF активирует сериновую молекулу, обеспечивает её конденсацию со связанным на EntB арильным фрагментом, а также (за счёт активности своего С-концевого тиоэстеразного домена) - тримеризацию дигидроксибензоил-сериновых блоков с замыканием лактонного кольца. Ещё один ген, entD, кодирует трансферазу кофактора фосфопантетина (РРТ), присоединяющую его от донора, кофермента А, к арил- и ацил-переносящим доменам белков EntB и EntF [Grossman et al., 1993; Raymond et al., 2003].
О продукции сидерофоров и особенностях их метаболизма у грамположительных баїсгерий в целом известно немного. Разные штаммы Bacillus subtilis при росте на среде с дефицитом растворимого железа секретируют как 2,3-DHB, так и итоевую кислоту, 2,3-DHB-Gly [Peters, Warren, 1968], которую долгое время считали единственным катехольным сидерофором у данного вида. Изучение хромосомных регионов, определяющих способность В. subtilis к активному транспорту Fe3+, выявило значительное сходство между этой бактерии и Е. colt в организации генов биосинтеза катехола и синтетазных субъединиц. Бациллярный сидерофор бациллибактин, несколько ранее описанный у Corynebacterium glutamicum под названием коринебактина [Budzikiewicz et al., 1997; May et al., 2001], представляет собой схожий с энтеробактином циклический трилактон 2,3-DHB-Glyhr (рис. 4, Б). Открытые рамки считывания dhbA, dhbB, dhbE и dhbF структурно и функционально гомологичны соответствующим еШ-ген&м [Rowland et al., 1996]. Ген изохоризмат синтазы dhbC у В. subtilis имеет внутренний гомолог menF, продукт которого участвует в образовании менахинона, компонента бактериальной дыхательной цепи. Синтаза DhbC может функционально замещать MenF у мутантов В. subtilis по его гену; в то же время сам MenF не способен обеспечивать синтез катехола - штамм dhbC нормально образует менахинон, но не сидерофор [Rowland, Taber, 1996]. Функцию специфичного фермента EntD у бациллы выполняет продукт гена sfp - РРТ-трансфераза с широким спектром действия, присоединяющая этот кофактор к ацил-, арил- и пептидил-переносящим доменам многих белков - компонентов систем внерибосомного пептидного синтеза. У разных штаммов самой В. subtilis активность sfp и его близких гомологов (Ipa8, lpaJ4) определяет продукцию бактериями липопептидных сурфактантов с мембранолитической активностью - сурфактина, итурина и плипастатина [Nakano et al., 1992; Tsuge et al., 1996]. Сходные трансферази, psf/ и gsp, вовлечены также в образование сурфактина штаммами В. pumilus и грамицидина S у некоторых вариантов Brevibacillus brevis [Tsuge et al., 1996]. Показано [Grossman et al., 1993], что локусы entD и sjp функционально комплементируют друг друга при клонировании в мутанты Е. coli и В. subtilis по соответствующим генам.
Бактер политическая активность штаммов В, licheniformis VK2 и VK.21
Однако те же клетки Е. coli и Ps. putida, убитые прогреванием, эффективно лизировались супернатантами культур обоих продуцентов, особенно VK2 (рис. 11, В). Денатурация клеточных макромолекул при термообработке может делать их подходящими субстратами для ферментативного расщепления; в данном случае результаты свидетельствовали о выработке штаммами В. Ucheniformis VK2 и VK21 экзоферментов, способных деградировать компоненты бактерий грамотрицательного типа после их повреждения, На интактные клетки эти метаболиты не влияли либо оказывали незначительное литическое действие, как на В. megaterium; антагонистические же свойства исследуемых термофилов несомненно определялись секрецией ими антибиотиков. Этот вывод был проверен в ходе работы по предварительному фракционированию образцов культуральной жидкости, из которых осаждали высокомолекулярные соединения добавлением двойного объёма ацетона и затем проверяли литическую (на прогретых клетках Ps. putida) и антибиотическую (в отношении В. megaterium) активность высушенных фракций осадков и надосадочной жидкости.
Вещества, оставшиеся в водно-ацетоновых растворах, не обладали бактериолитическими свойствами, но подавляли рост экспоненциальной культуры грамположительного тест-штамма (рис. 12, А, Б). С другой стороны, водные растворы смесей, осаждённых ацетоном (и предположительно содержавших белки и полисахариды), лизировали прогретые клетки псевдомонады с той же эффективностью, что и исходные супернатанты культур при соответствии их концентраций (рис. 12, В). При проверке антибиотических свойств «ацетоновых» осадков была отмечена задержка роста В. megaterium в пробах с ними на первых часах культивирования, но в ходе дальнейшей инкубации бактерии в тех же пробах росли даже лучше, чем в контрольных -по-видимому, добавленные метаболиты использовались ими в качестве ростовых субстратов (данные не приведены).
Пептидные антибиотики, известные к настоящему времени у ряда штаммов В. Ucheniformis, являют собой весьма разнородный по структуре набор соединений; соответственно этому, разнятся и методы их очистки. Так, в многочисленную группу лихенизинов объединены липопептиды со свойствами поверхностно-активных веществ (сурфактантов), молекулы которых имеют общий план строения: семичленныЙ пептид в них N-ацилирован остатком алифатической 3-гидроксикислоты, -ОН группа которой взаимодействует с карбоксилом С-концевого аминокислотного остатка, замыкая лактонный цикл. Пептидная часть таких метаболитов обогащена гидрофобными аминокислотами, её последовательность довольно консервативна, а различия между индивидуальными соединениями определяются вариациями в углеводородных цепях остатков жирных кислот, из-за чего смеси лихенизинов очень сложно разделять [Jenni et al., 1991; Yakimov et al., 1995; Grangemard et al., 1999]. Липофильные свойства этих веществ определяют эффективность их выделения с использованием неполярных адсорбентов; другой способ - осаждение на холоду при подкислении культуральной жидкости [Lin et al., 1994].
Следует, однако, отметить, что действие пептидных биосурфактантов по преимуществу обусловлено лизисом ими клеток, причём обычно они активны как против грамположительных микроорганизмов, так и в отношении грамотрицательных. В ходе излагаемой работы подобного не наблюдалось. Преимущественной активностью против грамположительных бактерий, которую показали исследуемые термофильные бациллы, обладают другие линейно-циклические пептиды В. licheniformis бацитрацины, блокирующие один из этапов биосинтеза пептидогликана [Katz, Demain, 1977; Kleinkauf, von Dohren, 1988]. Их продукция некоторыми штаммами, которые при этом могут образовывать и липопептиды, определяется активностью бацитрацин-синтетазного ферментного комплекса и стимулируется несколькими факторами, в частности - высоким отношением углерода к азоту в используемой среде [Шемякин и др., 1961].
Что касается пептидных бактериоцинов, также известных у В. licheniformis и упомянутых в разделе 2.2.4, то для большинства из них широкий спектр антибактериального действия не характерен. При подборе методов очистки активных продуктов бактерий-термофилов следовало учитывать и способность ряда штаммов бацилл к биосинтезу целых комплексов антибиотических веществ, причём не только пептидов, но также фосфолипидных и пол неновых антибиотиков [Tamehiro et al., 2002; Егоров, 1986; Nesemann et al., 1972].
Все эти данные были использованы для оценки подходов к выделению метаболитов В. licheniformis VK2 и VK21. Исходным этапом стало фракционирование супернатантов их ранне-стационарных культур в среде С2 и С2Мп. Добавление ацетона осаждало из них компоненты, не подавляющие рост бактерий, а после однократной экстракции образцов культуральной жидкости «-бутанолом антибактериальные соединения полностью переходили в органическую фазу. Супернатанты культур продуцентов, концентрированные в 5-10 раз, подкисляли НС1 до 0.1 М и выдерживали на холоду в течение суток; ни выпадения осадка, ни снижения уровня антибиотической активности в этих растворах, тестированных после их нейтрализации, не наблюдали. Контролями во всех подобных экспериментах служили образцы исходной ростовой среды, обработанные аналогичным образом. Эффективность экстракции антибиотиков бутанолом при низком значении рН была такой же, как и без подкисления. При экстрагировании образцов культуральной жидкости (кислой и нейтральной) этилацетатом антибактериальные метаболиты не обнаруживались ни в водной, ни в органической фазах, но на их границе формировался слой нерастворимого белого осадка, суспензия которого при тестировании подавляла рост В. megaterium. То же самое наблюдалось и при экстракции хлороформом. Полученные результаты указывали, с одной стороны, на амфифильность выделяемых антибиотических соединений, с другой - на возможность сравнительно крупных размеров и, отсюда, относительной лабильности их молекул.
Супернатанты культур В. licheniformis VK2 и VK21 и водные растворы веществ, экстрагированных из них бутанолом, показали достаточно высокую термоустойчивость: после кипячения образцов в течение 15 мин. уровень их активности существенно не снижался (табл. 10). Такая стабильность, как правило, не характерна для крупноразмерных антибиотиков-белков. Кратковременное (3 ч.) выдерживание продуктов бутанольнои экстракции в растворе 1 мМ КОН приводило к потере их антибактериальных свойств. Экстрагированные метаболиты штаммов-продуцентов проверяли также на чувствительность к протеолитическими ферментами - трипсину, а-химотрипсину и проназе. Первые два не оказывали какого-либо влияния на активность образцов даже при высоком соотношении количества ферментов и обрабатываемых смесей, но при инкубации с проназой антибиотические продукты инактивировались.
Известно, что к энзиматической деградации наиболее устойчивы малоразмерные пептиды - продукты синтетаз, содержащие циклы или D-энантиомеры либо модифицированные остатки аминокислот; некоторые ферменты, однако, способны расщеплять и такие соединения. К примеру, грамицидин S гидролизуется проназой и нейтральной протеазой В. subtilis [Егоров, 1986], Структурные особенности многих бактериоцинов также затрудняют их гидролиз, несмотря на большое количество потенциальных сайтов действия протеиназ в их молекулах [ Jack et al., 1995], Таким образом, полученные результаты в совокупности подтверждали, что исследуемые антибиотики термофильных бацилл могут оказаться относительно низкомолекулярными пептидами.
