Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы. Иммунобиология вирусов семейства Flaviviridae 6
1. Изучение антигенной структуры флавивирусов
1.1 Исследование с помощью моноклональных антител 9
1.2 Гипотетические модели пространственной структуры гликопротеина Е 12
1.3 Рентгеноструктурный анализ белка Е 17
1.4 Исследование с использованием синтетических пептидов 22
1.5 Антителозависимое усиление инфекции 24
1.6 Исследование с помощью "escape''-мутантов 27
2. Рецепторы и рецепторсвязывающие участки флавивирусов
2.1 Рецепторсвязывающие участки белка Е 32
2.2 Рецепторы флавивирусов 37
3. Проникновение флавивирусов в клетку путем слияния с клеточной мембраной 45
4. Роль неструктурных белков в формировании противовирусного иммунитета 55
ГЛАВА II. Обсуждение результатов 62
1. Изучение антигенной структуры гликопротеина Е
1.1 Выбор пептидов для синтеза 63
1.2 Синтез пептидов 66
1.3 Иммуногенные и антигенные свойства пептидов І-ХІП 85
2. Выявление фрагментов в последовательности белка Е, обладающих Т-хелперной активностью 88
2.1 Выбор фрагментов 89
2.2 Синтез пептидов 90
2.3 Иммуногенные и антигенные свойства пептидов XIV-XX 91
3. Установление последовательности, являющейся участком слияния вируса клещевого энцефалита с клеточной мембраной 95
ГЛАВА III Экспериментальная часть 102
Выводы 126
Список литературы 127
- Гипотетические модели пространственной структуры гликопротеина Е
- Исследование с помощью "escape''-мутантов
- Выявление фрагментов в последовательности белка Е, обладающих Т-хелперной активностью
- Установление последовательности, являющейся участком слияния вируса клещевого энцефалита с клеточной мембраной
Введение к работе
Вирус клещевого энцефалита относится к семейству Flaviviridae и является возбудителем серьезного заболевания человека. Восточные субтипы этого вируса, распространенные на территории России, к одному из которых относится исследуемый штамм Софьин, обладают наибольшей патогенностью и для них часты летальные исходы или длительные поражения нервной системы.
Разработка новых методов иммунопрофилактики данного заболевания, а также эффективных подходов к его диагностике требует знаний молекулярных основ функционирования вируса и механизмов формирования противовирусного иммунитета. Незаменимым инструментом в решении этих научных проблем являются синтетические фрагменты вирусных белков, моделирующие иммуноактивные и другие функционально важные участки вирусов. В литературе описано несколько работ по изучению вирусов семейства Flaviviridae с помощью синтетических пептидов, однако для вируса клещевого энцефалита таких исследований не проводилось.
Настоящая работа посвящена выявлению с помощью синтетических пептидов иммуноактивных участков поверхностного белка Е вируса клещевого энцефалита, необходимых для осуществления вирусом своих функций и для индукции противовирусного иммунитета. Данная работа включает: синтез фрагментов белка Е, входящих в состав В-эпитопов белка и вируса; получение противопептидных антител, способных нейтрализовать вирус; выявление фрагментов, индуцирующих образование антител в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем и содержащих Т-хелперные эпитопы; установление участка белка, с помощью которого вирус проникает в клетку хозяина и антитела к которому обладают вируснейтрализующими свойствами. Причем вывод о локализации данного участка может быть распространен на все семейство флавивирусов.
Выявление в последовательности белка Е вируса клещевого энцефалита участков, ответственных за формирование противовирусного иммунитета и за проникновение вируса в клетку хозяина, позволяет внести вклад в общее понимание механизмов взаимодействия вируса с организмом хозяина и создает основу для разработки синтетических вакцин и диагностикумов нового поколения.
Для решения поставленных задач требовался детальный анализ имеющихся в научной литературе сведений об иммунобиологии флавивирусов, к которым относится вирус клещевого энцефалита. Обзор литературы включает анализ данных об
антигенной структуре флавивирусов и иммуногенных свойствах вирусных белков, о механизме рецепторного узнавания и слияния вирусной и клеточной мембран.
Гипотетические модели пространственной структуры гликопротеина Е
Известно, что узнавание В-клетками антигенных детерминант на поверхности вирусных белков в большой степени зависит от нативной конформации антигена. Для того, чтобы исследовать конформационную зависимость выявленных эпитопов, изучали их способность реагировать с МКА в различных денатурирующих условиях. Было установлено, что при обработке гликопротеина Е додецилсульфатом натрия (SDS) четыре эпитопа, относящиеся к домену А, теряли антигенные свойства. Вероятно, это конформационно зависимые эпитопы, стабилизированные гидрофобными взаимодействиями между различными частями полипептидной цепи. Восстановление белка с последующим карбоксиметилированием приводило к потере реакционной способности двух устойчивых в SDS эпитопов домена А и домена" В в целом. Это доказывает, что нативная структура этих доменов стабилизирована дисульфидными мостиками. Эпитопы домена С были устойчивы в описанных условиях. Это говорит о том, что они не зависят от конформации молекулы. Однако, изучение влияния углеводной части на антигенные свойства гликопептида показало, что устойчивость к денатурации эпитопов домена С зависит от присутствия боковой углеводной цепи. У дегликозилированного белка не наблюдалось изменений в антигенной реактивности эпитопов доменов А, В или С. Но у ранее устойчивых к действию SDS эпитопов домена С наблюдалась полная поторя реакционной способности в денатурирующих условиях. По-видимому, от изменения конформации домен С защищает углеводная цепь.
Белок Е подвергали ограниченному протеолизу трипсином и химотрипсином. Было показано, что, за исключением четырех МКА, определяющих эпитопы домена А, все остальные МКА, связывающиеся с целой молекулой белка, связывались также и с фрагментом массой 47 кДа. Это согласуется с данными об устойчивости к денатурации в невосстанавливающих условиях части эпитопов домена А, а также эпитопов, относящимся к доменам В и С. Эпитопы домена В были также найдены на фрагменте массой 9 кДа, полученном при обработке трипсином и термолизином [18]. После расщепления молекулы белка Е с помощью бромциана ни одного эпитопа доменов А и В не было обнаружено на фрагментах. Однако, все эпитопы домена С, кроме одного, присутствовали на фрагменте массой 19 кДа. Это подтверждает данные о том, что домен С свободен от S-S-мостиков и содержит последовательные эпитопы, не зависящие от конформационных изменений белка Е.
Сходные результаты были получены при изучении антигенной структуры дальневосточного подтипа вируса клещевого энцефалита штамма Софьин. С помощью набора из 12 МКА удалось локализовать три топологически разделенных домена (А, В и С) [19], среди которых один (А) характеризовался семью МКА, активными в тестах нейтрализации и торможения гемагглютинации. Сопоставляя результаты топологического картирования гликопротеина Е, полученные в данной работе, с результатами аналогичного исследования, описанного выше [15], авторы приходят к выводу, что, несмотря на зависимость результатов картирования от спектра МКА и, возможно, штаммовых вариаций антигена, по ряду функциональных признаков домен А дальневосточного подтипа вируса сходен с доменом А западноевропейского подтипа, описанным в работе [15].
Белки Е штаммов Софьин и Найдорф отличаются друг от друга лишь тремя аминокислотными заменами, из которых существенными представляются замены в положениях 89 (Ser на Gly) и 116 (Thr на Ala), а несущественной - замена в положении 168 (Val на Не). Было показано, что МКА, взаимодействующие с гликопептидным фрагментом (14,5 кДа), связываются с белком Е штамма Найдорф с эффективностью на 1,5-2 порядка ниже, чем с белком Е штамма Софьин [19]. Эти данные позволили авторам предположить, что сайты связывания исследованных антигенов с этими МКА включают точки аминокислотных замен или расположены в непосредственной близости от них, а также определить границы данного фрагмента в пределах остатков 78-176. При обработке белка Е восточного штамма Софьин вируса клещевого энцефалита бромцианом был выделен наиболее крупный фрагмент, являющийся гликопептидом (14,5 кДа), который взаимодействовал с пятью из двенадцати изученных МКА [20]. Вероятно, этот фрагмент аналогичен фрагменту массой 19 кДа, полученному при расщеплении бромцианом белка Е штамма Найдорф, также содержащему углеводную часть и к которому относят эпитопы домена С.
Изучение с помощью МКА антигенной структуры гликопротеина Е, являющегося основным носителем антигенных и иммуногенных свойств вируса, проводилось практически для всех представителей флавивирусов: вируса Западного Нила [21], Денге [22], японского энцефалита [23], энцефалита Сент-Луиса [24] и энцефалита Муррей Валлей [25]. При этом были выявлены эпитопы различной вирусной специфичности и дана характеристика их функциональной значимости. Однако наиболее глубоко антигенная структура гликопротеина Е была изучена для вируса клещевого энцефалита. Недавнее исследование белка Е вируса Денге-2 при помощи картирования моноклональными антителами подтвердило правильность выводов, сделанных для вируса клещевого энцефалита, и показало очень схожие результаты [26]. Так, авторы идентифицировали 16 эпитопов, которые отнесли к трем функциональным доменам, названным, следуя принятой ранее номенклатуре, А, В и С. Пять эпитопов, объединенных в домен А, были найдены в трех пространственно независимых регионах. Эпитопы домена А были чувствительны к восстановлению белка, а МКА, связывающиеся с этими эпитопами, были способны к нейтрализации вируса и торможению гемагглютинации. Эпитопы домена А присутствовали на поверхности целого гликопротеина Е, триптического фрагмента массой 45 кДа, содержащего первые 400 аминокислотных остатков последовательности белка Е, и триптического фрагмента массой 22 кДа, включающего приблизительно остатки 1-120 белка. Четыре эпитопа, отнесенных к домену В, были выявлены благодаря своей локализации на поверхности фрагмента массой 9 кДа, полученного в результате обработки белка трипсином или химотрипсином (аминокислотные остатки 300-400). Этот фрагмент, по-видимому, идентичен аналогичному фрагменту, полученному при протеолизе белка Е вируса клещевого энцефалита [15]. Эпитопы домена В обладали частичной устойчивостью к восстановлению и связывались с МКА, активными в реакциях нейтрализации и торможения гемагглютинации, хотя и в меньшей степени, чем МКА, определяющие домен А. Домены А и В пространственно связаны. Установление границ домена С более проблематично, хотя по-крайней мере четыре эпитопа имели биохимические характеристики, позволяющие отнести их к домену С.
Исследование с помощью "escape''-мутантов
Одним из перспективных подходов для характеристики антигенной структуры вируса и определения участков, необходимых для реализации его жизненного цикла, является направленное получение с помощью многократных пассажей изолятов вируса с измененными свойствами (escape-мутантов), которые не подвергаются нейтрализации МКА, полученными к исходному варианту вируса. Последующее секвенирование генома таких мутантов позволяет определить произошедшую замену и таким образом установить аминокислотные остатки, участвующие в образовании протективных эпитопов. Преимуществом такого подхода является возможность выяснения структуры топографических детерминант и целых районов, которые образуются из остатков, разнесенных в первичной структуре, но сближенных при укладке белка.
С помощью escape-мутантов были локализованы нейтрализующие эпитопы в последовательности белка Е вируса желтой лихорадки (YF). Первый был установлен в результате анализа полученных из вакцинного штамма 17D YF мутантов, устойчивых к нейтрализации двумя МКА (2С9 и 2Е10) [86]. Оба МКА имели также высокие титры нейтрализации против дикого штамма Asibi. Исследование генома девяти мутантов в области белков Е и М выявило в каждом варианте по одной аминокислотной замене либо в положении 71, либо в положении 72 белка Е. Только в одном из девяти вариантов наблюдалась вторая замена в положении 125, которую, по-видимому, можно считать случайной. Позже был установлен эпитоп в другом районе белка Е [87]. Анализ генома вариантов вируса 17D 204, устойчивых к МКА В 39, показал наличие мутаций в положениях 155 или 158 белка Е. Оба эпитопа - и в позиции 71/72, и в позиции 155/158 - находятся в вариабельных областях белка и являются типоспецифическими. Эпитоп 155/158, определяемый МКАВ 39, относится к домену I белка Е (на модели, предложенной на основании рентгеноструктурного анализа белка Е вируса клещевого энцефалита [31]), а эпитоп 71/72 - к домену II.
Анализ мутаций необходим для детального понимания специфических механизмов жизнедеятельности вируса. С использованием такого подхода возможно получать аттенуированные штаммы вируса, перспективные в плане их практического применения как исходного материала для живых вакцин, и попытаться исследовать механизмы аттенуации.
Вакцина против желтой лихорадки является первым успешным примером использования живого аттенуированного вируса для защиты от вирулентного родительского штамма. Вакцинный штамм 17D был получен путем 176 пассажей распространенного в природе штамма Asibi через культуру куриных эмбрионов [74]. Вакцина из него (используются производные штаммов 17D 204 и 17DD) успешно применяется уже около 60 лет и является на сегодня одной из самых безопасных и эффективных вакцин. Практически параллельно со штаммом 17D разрабатывался другой вакцинный штамм (ENV) из природного варианта FW (French viscerotropic virus) [76], который также долгое время использовался в качестве вакцины, но менее успешно, чем 17D, в результате чего ее производство было прекращено. Молекулярная основа аттенуации вируса желтой лихорадки долгое время оставалась абсолютно неясной, несмотря на то, что были секвенированы полные геномы соответствующих природных и вакцинных штаммов. Поскольку проявление основных биологических свойств вируса, таких как иммуногенность и антигенность, тканевый тропизм и проникновение в клетку связывают с белком Е, то в его последовательности ученые пытались найти некий «вакцинный эпитоп», отвечающий за изменение вирулентности. Однако, сравнивая сайты мутаций в аминокислотной последовательности белков Е аттенуированных штаммов вируса желтой лихорадки, можно видеть, что эти белки имеют больше общего со своими родительскими штаммами, чем между собой [75]. 243 пассажа, отделяющие родительский «дикий» тип вируса YF Asibi от аттенуированного YF 17D 204, породили 68 нуклеотидных и 32 аминокислотных замены, различающих два варианта вируса. Для исследования их значения в изменении вирулентности были выполнены эксперименты по аналогичному изменению вируса штамма YF Asibi в клетках HeLa, имевшие результатом потерю вирусом способности вызывать висцеротропное заболевание у обезьян [76-79]. Было выдвинуто предположение, что для аттенуации вируса, возможно, не требуется такое большое число пассажей. И это предположение подтвердилось. Всего несколько пассажей потребовалось для того, чтобы радикально изменить биологические свойства вируса желтой лихорадки. Уже после первого пассажа наблюдалось снижение вирулентности, и 6 пассажей потребовалось для того, чтобы сделать штамм YF Asibi авирулентным для обезьян (LD5o 0,04 инфекционных доз при интрацеребральном введении штамма YF Asibi и более 700000 и.д. после шести пассажей - штамм YF Asibi HeLa рб) [78, 80]. Логично предположить, что если в результате 243 пассажей происходит 68 нуклеотидных (и 32 аминокислотных) изменений, отделяющих «дикий» штамм YF Asibi от аттенуированного YF 17D 204, то 6 пассажей в HeLa-клетках повлекут всего несколько замен. Это делает возможным установление критических для проявления вирулентности остатков.
С использованием панели МКА, специфически нейтрализующих «дикий» штамм вируса YF Asibi, но не вакцинный вирус YF 17D 204, было показано, что по своим антигенным свойствам полученный в результате 6 пассажей аттенуированный штамм YF Asibi HeLa рб близок к родительскому «дикому» типу. Этот штамм, как и YF Asibi, подвергался нейтрализации большинством из МКА данной панели, в то время как штамм YF 17D 204 этими МКА не узнается. Существенным является то, что среди МКА было найдено два антитела, различающих вирулентные и аттенуированные штаммы. Одно из них (МКА 117) специфически реагирует только с белком Е «диких» типов вируса желтой лихорадки [81]. Оно различает штаммы YF Asibi и YF Asibi HeLa рб [80], т.е. является вакцинно специфичным. Использование этих двух антител позволило выдвинуть предположение о конкретных сайтах аттенуации.
Выявление фрагментов в последовательности белка Е, обладающих Т-хелперной активностью
Традиционно для индукции противопептидных антител синтетические пептиды конъюгируют с высокомолекулярными белками-носителями. Такие конструкции действительно способны вызывать образование антител и создавать иммунитет против вирусного антигена. Однако при этом генерируется нежелательный ответ против В-эпитопов чужеродного белка, и Т-клеточная память формируется лишь на Т-хелперные эпитопы белка-носителя. Возможна также супрессия иммунного ответа на антиген при повторной иммунизации такими белково-пептидными конъюгатами. Новый и перспективный подход к индукции противовирусного иммунитета заключается в отказе от конъюгирования с белком и использовании для стимуляции антител собственных Т-эпитопов вирусных белков. Поэтому в настоящей работе мы поставили задачу выявления Т-хелперных эпитопов в последовательности белка Е. Нами проведено теоретическое исследование гликопротеина Е методами, позволяющими предсказать потенциальные Т-эпитопы, синтезированы пептиды, соответствующие данным участкам белка и изучены их иммуногенные свойства на животных.
С помощью программы, разработанной на основе сравнения последовательностей известных из литературы участков, связывающихся с главным комплексом совместимости, была проанализирована последовательность белка Е вируса клещевого энцефалита и рассчитаны фрагменты, содержащие мотивы для связывания с мышиными антигенами главного комплекса гистосовместимости П класса локусов I-Ek, І-Еь, I-Ed [213, 214]. Для синтеза были выбраны фрагменты белка Е, содержащие расчетные эпитопы, а также функционально значимые участки, установленные в ходе предыдущих исследований. Было синтезировано семь 17-28-членных пептидов (рис. 7):
Все приведенные на рис. 2 фрагменты содержат расчетные Т-эпитопы. Кроме того, фрагменты 90-113 (XVI) и 392-409 (XX) включают участки 98-113 (VI) и 394-403 (ХШ), которые стимулировали в виде KLH-конъюгатов выработку вируснейтрализующих антител у крыс.
Одним из теоретических методов предсказания потенциальных Т-хелперных эпитопов является метод расчета в последовательности белков фрагментов, способных к образованию амфипатических а-спиралей [215]. Для белка Е был проведен подобный расчет, и фрагмент 204-224 (XVII) оказался самым протяженным участком, содержащим амфипатическую а-спираль. Данные рентгеноструктурного анализа белка подтвердили наличие а-спирал.ьного участка в этом районе.
Пептиды XV и XVII получали твердофазным методом в ручном варианте на РАМ-полимере. Выбор защитных групп, синтез, деблокирование и очистку пептидов проводили аналогично тому, как это описано для пептидов I-IV, VI, ХІ-ХПІ. При удалении Вос-группы после введения остатка Met в последовательность пептида XV в раствор трифторуксусной кислоты в хлористом метилене добавляли 4% меркаптоэтанола. При синтезе пептидов I и П, описанном в разделе 1.2., эта добавка предотвращала появление модификаций по СНз-S- группе метионина, однако в ходе синтеза пептида XV произошло полное окисление остатка Met, что было установлено для Acm-производного пептида с помощью масс-спектроскопии и ЯМР-исследования. Окисленный пептид восстанавливали дитиотреитолом.
Пептиды XIV, XVI, XVIII-XX получены твердофазным методом на п-алкоксибензильном полимере, пептид XIX - при помощи синтезатора Applied Biosystems 430А, остальные - в ручном варианте. Защитные группы боковых функций аминокислотных остатков выбраны с расчетом на конечное деблокирование трифторуксусной кислотой. Для защиты боковых функций Thr, Туг, Ser использовали Bu -группу, для Asp, Glu - ОВи -группу, для Lys - Вое, для Arg - Pbf, для His - Trt, для Cysrt-группы. В качестве временной Т -защиты служила Fmoc-rpynna.
Для наращивания полипептидной цепи на полимере применяли TBTU-метод. Реакцию конденсации проводили дважды. После второй конденсации осуществляли контроль непрореагировавших аминогрупп и при неудовлетворительном результате конденсацию повторяли до полноты протекания реакции более 99%. Каждый цикл синтеза заканчивали ацилированием оставшихся непрореагировавших аминогрупп с помощью уксусного ангидрида. Отщепление пептидов от полимера с одновременным деблокированием осуществляли смесью трифторуксусной кислоты с добавками, предотвращающими протекание побочных реакций.
После деблокирования все пептиды обессоливали и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход пептидов составил 35-80% в расчете на первую аминокислоту. Индивидуальность полученных соединений подтверждена данными аминокислотного анализа (табл. 4), масс-спектроскопии (табл. 5) и обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3).
Способность синтезированных пептидов стимулировать образование антител была изучена в экспериментах на мышах трех линий, различающихся по гаплотипу: BALB/c (d-гаплотип), C57/BI (b-гаплотип) и СВАЯ (к-гаплотип). Мышей дважды иммунизировали свободными пептидами без конъюгации с белком-носителем. Полученные сыворотки исследовали методом ИФА на связывание с пептидами (табл 8).
Установление последовательности, являющейся участком слияния вируса клещевого энцефалита с клеточной мембраной
Полученные данные дают основание полагать, что эти пептиды входят в состав В-эпитопов вируса клещевого энцефалита. Пептид 275-302 (XVIII) выделяется самыми высокими титрами связывания с антителами к вирусу. По-видимому, этой активностью объясняется тенденция к увеличению продолжительности жизни мышей, иммунизированных пептидом 275-302 (XVIII) и зараженных вирусом (табл. 4). Однако пептид 275-302 (XVIII) на мышах Balb/c индуцирует низкий уровень антител (титр 2,8, табл. 8), которых недостаточно для проявления более мощного протективного эффекта. Мы полагаем, что перспективы применения этого пептида для индукции противовирусной защиты связаны с созданием на его основе пептидных конструкций, индуцирующих более высокий уровень антител.
Итак, в результате направленного поиска выявлены фрагменты белка Е, способные в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем стимулировать образование антител при иммунизации животных, то есть проявляющие Т-хелперную активность. Наиболее иммуногенны пептиды 377-403 (XIX), 204-224 (XVII) и 48-74 (XIV). Эти пептиды перспективны в качестве носителей при создании конструкций, формирующих полноценный иммунитет к вирусу клещевого энцефалита. Параллельно с этим установлено, что пептиды 275-302 (XVIII), 204-224 (XVII) и 377-403 (XIX) входят в состав В-эпитопов вируса клещевого энцефалита, причем фрагмент 275-302 (XVIII) выделяется исключительно высокой способностью связываться с противовирусными антителами. Последние три пептида ранее не были описаны в литературе в качестве В-эпитопов. Фрагмент 204-224 (XVII) относится к димеризующему домену II, фрагмент 275-302 (XVIII) - к домену I и фрагмент 377-403 (XIX) - к домену III. Фрагмент 204-224 соответствует так называемому "эпитопу слияния", определенному для белка Е вируса Муррей Валлей внутри последовательности 201-221 [162]. Возможно, именно этим обстоятельством обусловлена способность противовирусных антител узнавать пептид 204-224 (XVII). Фрагменты 275-302 (XVIII) и 377-403 (XIX), как и описанный в разделе 1.3 фрагмент 394-403 (XIII), приблизительно соответствуют фрагментам последовательности 284 310 и 386-411, локализованным для белка Е вируса Денге-2 в качестве потенциальных участков связывания с рецептором [115]. Высокая активность пептида 275-302 (ХУЛІ) в связывании с противовирусными антителами доказывает его экспонированное положение в структуре вириона и косвенно подтверждает возможность его участия в процессе рецепторного узнавания. Фрагмент 275-302 (XVIII) обладает невысокой иммуногенной активностью, поэтому для его использования в разработке вакцинного препарата нужны дополнительные структуры, обеспечивающие эффективную стимуляцию Т-хелперных клеток. Высокая способность участка 275-302 (XVIII) распознавать антитела к вирусу клещевого энцефалита в сыворотке человека делает возможным применение данного пептида в качестве основы для высокочувствительного пептидного диагноста кума. 3. Установление последовательности, являющейся участком слияния вируса клещевого энцефалита с клеточной мембраной.
По современным представлениям вирусы семейства Flaviviridae проникают в клетку с помощью рецепторопосредуемого эндоцитоза, когда происходит слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной при пониженных значениях рН внутри эндосомы [173]. При этом ингибирование слияния антивирусными иммуноглобулинами приводит к потере инфекционности [144, 145]. Предполагается, что белок Е участвует в процессе слияния вирусной оболочки с клеточными мембранами, причем для слияния необходимо изменение конформации белка [31, 164]. В литературном обзоре нами подробно рассматривалась проблема слияния для флавивирусов.
Для того, чтобы определить участок белка, ответственный за слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной, мы проанализировали результаты проведенной нами работы по изучению свойств синтетических фрагментов и сопоставили их с фактами и предположениями, известными из литературы.
Сравнение первичной структуры белков Е различных флавивирусов позволяет внутри вариабельного района (1-121), в котором .локализованы основные типоспецифичные эпитопы, выявить достаточно протяженный участок 98-113 с исключительно высокой степенью гомологии (рис. 8). Очевидно, что этот фрагмент белка должен быть функционально значим для всего семейства флавивирусов. Относительная гидрофобность последовательности и обилие в ней остатков глицина, делают структуру данного фрагмента схожей со структурой известных участков слияния других вирусных белков. В литературе также было выдвинуто предположение об участии данного фрагмента в процессе слияния [37]. Однако до сих пор не было экспериментальных данных, подтверждающих эту гипотезу.
В разделе 1.2 было показано, что пептид 98-113 (VI) способен индуцировать образование вируснейтрализующих антител, не являясь при этом В-эпитопом. Учитывая гипотезу о роли данного фрагмента в процессе слияния, можно предположить, что нейтрализация в данном случае происходит за счет блокирования антителами участка, необходимого для проникновения вируса в клетку.
Была проведена серия опытов по изучению воздействия пептидов 35-51 (II), 98-113 (VI) и 394-403 (ХШ), проявивших либо антигенную активность при взаимодействии с поликлональной сывороткой к белку Е, либо способность индуцировать антитела, реагирующие с белком Е и нейтрализующие вирус, а также пептида 118-129 (VIII) на инфекцию макрофагов in vitro вирусом клещевого энцефалита. Макрофаги инкубировали с пептидом, а затем в клеточную систему добавляли вирус в различных дозах. После этого макрофаги, отмытые от вируса, наносили на клетки почки эмбриона свиньи и на четвертые сутки проводили учет негативных колоний. Пептиды 35-51 (II), 118-129 (VIII) и 394-403 (ХШ) не оказывали влияния на инфекцию макрофагов (данные не приведены). Данные для пептида 98-113 (VI) приведены в табл. 11. После обработки макрофагов пептидом 98-113 (VI) количество инфекционных центров для всех трех значений дозы вируса было намного ниже, чем в отсутствие пептида или после обработки контрольным пептидом, не относящимся к последовательности белка Е вируса клещевого энцефалита. Таким образом, было показано, что пептид 98-113 (VI) активно конкурирует с вирусом в процессе взаимодействия с макрофагами, вследствие чего инфицированность последних значительно снижается по сравнению с контролем.
