Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 7
1.1 Методы устранения нефтяных разливов 9
1.2 Характеристика и токсикология нефти 12
1.3 Использование УОМ для ликвидации нефтяных загрязнений Н
1.4 Получение биомассы микроорганизмов 18
1.5 Применение биопрепаратов для рекультивации 26
2. Методы исследований 40
2.1 Выделение и отбор нефтеокисляющих штаммов 40
2.2 Идентификация полученных штаммов 43
2.3 Модификация полимерного сорбента 44
2.4 Культивирование штаммов-нефтеокислителей 45
2.5. Оптимизация процесса культивирования 49
2.6 Иммобилизация 49.
2.7 Определение количества нефти после биодеструкции 50
2.8 Определение состава нефти до и после био деструкции 50
2.9 Модельные эксперименты на почве 51
2.10 Производственные испытания 51
2.11 Наработка опытной партии 53
3. Экспериментальная часть 54
3.1 Выделение и идентификация штаммов нефтеокислителей 54
3.2 Периодическое культивирование выделенных микроорганизмов 60
3. 3 Иммобилизация биомассы и получение биопрепарата 78
4. Испытания полученных штаммов в модельных опытах
и производственных условиях 84
4.1 Модельные испытания выделенных штаммов 84
4.2 Испытания комбинированного биопрепарата при ликвидации bаварийных разливов нефти95
5. Технологическая часть 114
б.Выводы 118
Список использованных источников 120
Приложения 134
- Методы устранения нефтяных разливов
- Выделение и отбор нефтеокисляющих штаммов
- Выделение и идентификация штаммов нефтеокислителей
Введение к работе
Техногенные изменения, воздействующие на природу в последнее время и их возросшая интенсивность, резко ухудшают состояние и устойчивость биосферы. Это проявляется в резком сокращении площади не нарушенных естественных экосистем, уменьшении биологического разнообразия, нарушении природных потоков вещества и энергии, вызывая необратимое количественное и качественное обеднение биосферы.
Потребление и изъятие человеком возобновляемых природных ресурсов - пресной воды, почвенного гумуса, биомассы и продукции растений достигло критической скорости или превышает темпы их естественного воспроизводства.
Загрязнение среды отходами производства создает угрозу здоровью людей, вызывает химическую деградацию экосистем. Появились признаки нарушения биосферного равновесия, ослабления регулирования ее функций и стабильности[1,3,8 ].
Все эти изменения происходят на качественно новом уровне и с высокой скоростью, что вызывает ответную реакцию природы в виде непредвиденных изменений, создающих экологическую опасность на планете в целом и ее отдельных регионах. Особенно там, где воздействие происходит без предварительной оценки возможных последствий и учета конкретных природных условий. Загрязнению подвергаются все элементы природы: атмосфера, вода, почва, живые системы вредными веществами в твердом, жидком, газообразном состоянии.
Нарушаются условия, позволяющие биосфере в прошлом успешно справляться с утилизацией отходов с помощью микроорганизмов, воды, воздуха, воздействия солнечного света, изменяются естественные процессы взаимодействия этих элементов. Отсутствие соответствующих технологий и специального оборудования приводит к тому, что полностью обезвреживается только 3,5% промышленных отходов.
Избавиться от них можно несколькими известными способами: закопать, затопить, сжечь, утилизировать. Последний вариант наиболее предпочтителен, но требует дополнительной научной проработки и материальных затрат. В промышленных зонах образуются значительные по размерам территории, выведенные из естественного состояния, угнетенные по всем направлениям количеством и токсичностью техногенных отходов. В частности, загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами в местах их добычи и переработки превышает фоновое в десятки раз.
Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям. При современных объемах добычи, в мире потери нефти достигают 50 млн. тонн в год [1]. В нашей стране потери при добыче, транспортировке, переработки и хранении нефти составляют почти 5 % от общей добычи [2].
Наиболее опасные формы нефтяного загрязнения связаны с многочисленными порывами нефтепроводов: в почве накапливаются стойкие поверхностно-активные вещества, являющиеся концерогенами, нарушается плодородный слой, загрязняются почвенные воды, погибает нативный биоценоз. Тонна разлитой нефти загрязняет 12 км водной поверхности, а 1 литр нефти лишает кислорода 40 тысяч литров воды. Применяемые методы борьбы с этим видом загрязнений малоэффективны, либо требуют огромных энергетических затрат, а такие как механическое засыпание почвой и выжигание просто опасны по своим последствиям.
Поэтому существует необходимость максимально приблизить эти методы к естественным и обеспечить условия, способствующие интенсивному протеканию природных биохимических процессов микробиологического окисления углеводородов нефти. При этом сохраняются ландшафты и не наносится дополнительного вреда экосистемам.
Наиболее перспективным и экологически безопасным является биотехнологический, основанный на интродукции активных углеводородокисляющих микроорганизмов в загрязненную среду [19,20]. В этом случае происходит преобразование углеводородов в экологически безопасные вещества гумусовой природы.
Современные коммерческие биопрепараты, разработанные на основе коллекционных нефтеокислителей, работают в основном на низких концентрациях загрязнителя, не все сохраняют активность и устойчивость в открытых природных системах. Особым преимуществом в этом смысле обладает местный микробиоценоз, компоненты которого наиболее взаимоприспособлены и адаптированы к условиям среды. В почвах, содержащих ранее внесенные углеводороды, всегда есть микроорганизмы, обладающие ферментными системами для деградации и окисления нефтепродуктов.
Этот метод требует выделения, подбора и изучения этих микроорганизмов - нефтедеструкторов, и их сообществ. Возникает необходимость накопления их биомассы и последующего внесения в нефтезагрязненные зоны после предварительного закрепления на специальных носителях, позволяющих обеспечить микроорганизмам благоприятные условия для нефтеокисления.
Известно, что процесс биоокисления нефти требует свободного доступа кислорода к клеткам и возможен только в зоне соприкосновения. Интенсификация этого процесса достижима только при переводе массива нефти в пленку, а также при наличии достаточного количества азота, фосфора, некоторых других микроэлементов и воды. Эти основные требования создаются при иммобилизации выделенных нефтеокисляющих штаммов на карбамидный полимерный сорбент, разработанный на кафедре Химической технологии древесины и биотехнологии[20-21].
7 1. Аналитический обзор
Экологические проблемы нефтезагрязненных территорий
В районах интенсивной добычи, транспортировки и переработки нефти резко возрастают нагрузки на природную среду, усиливается деградация возобновляемых ресурсов, ухудшается санитарно гигиеническая обстановка.
Эти проблемы вызваны загрязнением территорий и акваторий нефтью, неизбежно происходящие из-за технических нарушений, несоблюдения регламентов, бесхозяйственности и применения стандартных приемов освоения территорий, без учета природно-климатической обстановки региона. Подсчитано, что при одном порыве трубопровода в среднем выбрасывается около двух тонн нефти, приводящей в негодность тысячу квадратных метров земли, а сто граммов ее способны загрязнить 8 тысяч литров воды настолько, что она становится непригодной для жизни гидробионтов и хозяйственного потребления
Выделены три основные градации по степени нефтяного загрязнения: слабое (до 10 %), среднее (до 40 %), сильное (более 40 %). Загрязнение отражается на состоянии всех компонентов фитоценоза. Оно имеет последствия, приводящие к угнетению, деградации или полной гибели растительности. Степень повреждения прямо пропорциональна количеству вылитой нефти и зависит от видового разнообразия живых организмов.
Нефтяное загрязнение вызывает резкое падение биомассы мезофауны, уменьшается мощность обитаемого слоя почвы, затрудняется и даже прекращается обогащение воды кислородом. Содержание кислорода в воде невелико и зависит от температуры - летом 7-8 г/л, зимой менее 4 г/л. Скорость окисления нефти прямо определяется наличием этих факторов и присутствия микроорганизмов, Для полного окисления одного литра нефти требуется кислород, содержащийся в 400 тысячах литров воды [1].
Особенный вред гидробионтам приносит так называемый « нефтяной яд »-предельные углеводороды пентан, гексан, гептан, октан, фенолы, летучие и
8нафтеновые кислоты, органические основания. Содержание нефтяных углеводородов в природных водах нормируется и составляют 0,05 мг/л для рыбохозяйственных и 0,3 мг/л - для хозяйственных водоемов.
Специфическое воздействие нефти на живые системы может классифицироваться как: прямая летальная токсичность на уровне клеточных и мембранных процессов; сублетальные нарушения физиологической активности, приводящие к нарушениям функций питания и размножения; прямое обволакивающее воздействие, включение вредных веществ в ткани; концентрирование и передача полициклических ароматических углеводородов по пищевым цепям; изменение среды обитания, приводящее к сужению видового состава биоценоза [1-5].
Экосистемы водоемов и плодородный слой почвы представляют собой сложную саморегулирующуюся систему, органоминеральный комплекс, требующий для поддержания своего существования конкретных условий. Эти условия немедленно нарушаются при попадании компонентов нефти.
Происходит изменение морфологических, физико-химических, биологических свойств. Фильтрация нефтепродуктов в почву приводит к ее разделению на отдельные фракции, причем высокомолекулярные компоненты остаются в верхних слоях, легкие проникают в нижние минеральные горизонты и там, в анаэробных условиях могут сохраняться длительное время, что неизбежно ведет к снижению или полной утрате почвенного плодородия или нативного биоценоза [б].
Нефтяное загрязнение отличается от других антропогенных воздействий тем, что дает залповую нагрузку на среду и вызывает быструю реакцию биоценоза.
Оценивая последствия, трудно предусмотреть, сможет ли система самовосстановиться, но при разработке мер по ликвидации последствий необходимо исходить из главного принципа - не нанести природе еще больший ущерб, чем тот, что уже нанесен. Суть этого принципа - максимальная мобилизация внутренних ресурсов экосистемы с помощью рекультивации и применения комплекса мер естественно биологической направленности [1,7-10].
Методы устранения нефтяных разливов
На практике при аварийных розливах применяется механическое задержание - обваловка, дамбы, многорядные боновые заграждения и сбор нефти пенососами, вихревыми устройствами, адгезионными дисками и прочим, зачастую дополнительно наносится ущерб ландшафту тяжелой техникой.
Выжигание нефти, или полное покрытие места розлива грунтом при экологической экспертизе показало, что эти приемы недопустимы. Восстановление биоценозов происходит крайне медленно. «Техногенная пустыня » даже через 9 лет имеет зарастаемость не более 9 % .Контроль токсичности почв по содержанию 3,4 бензапирена показывает, что его количество превышает фон (13 мг/кг ) до 500 раз. Почти повсеместно сейчас сжигание официально запрещено.
Засыпка розлива также не решает задачу, т. к. утилизация нефти в условиях дефицита кислорода резко замедляется, она выдавливается почвенными водами, выносится с ними за пределы основного розлива и образует очаги повторного загрязнения.
Сбор и переработка нефтесодержащих почв на специальных площадках или в биореакторах очень энергоемкий, длительный и дорогостоящий вариант, при котором травмируются естественные ландшафты и практически не восстанавливается нативный биоценоз [1,11-13].
Повысить эффективность мероприятий по борьбе с загрязнениями нефтью позволит использование экологически чистых сорбентов, обеспечивающих не только сорбцию углеводородов, но и частичную мелиорацию грунтов.
Выделение и отбор нефтеокисляющих штаммов
Известно, что в процессе ликвидации нефтяных загрязнений более эффективной является естественная микрофлора, адаптированная к почвенным условиям, но ее количество из-за общего ухудшения условий местообитания резко снижается, поэтому в целях ускорения процесса биодеградации нефти возможно обогатить почву аборигенной углеводородокисляющей микрофлорой после выращивания на искусственных минеральных средах, содержащих нефть, и создать для нее благоприятные условия после внесения. Существующую задачу можно решить путем закрепления микроорганизмов в почве иммобилизацией на полимерном пористом сорбенте, что снижает дефицит кислорода и биогенных элементов, улучшает контакт микроорганизмов и углеводородов нефти, позволяя интенсифицировать процессы биоокисления.
Целью данной работы была разработка технологии комбинированного биопрепарата для ликвидации нефтяных загрязнений на основе иммобилизованной на полимерный сорбент аборигенной микрофлоры и оценка его эффективности. Схема проведенных исследований приведена на рисунке 2.1. 2.1 Выделение и отбор нефтеокисляющих штаммов.
Процесс выделения штаммов, способных к деструкции нефти, велся в двух направлениях:
- методом накопительной культуры на основе почв, загрязненных нефтью разных месторождений и минеральных сред для нефтеокисляющих микроорганизмов в условиях аэрирования среды в ферментере объемом 0,2 л. Вели ежесуточные пересевы части микробной суспензии на свежую среду с использованием 1% нефти в качестве единственного источника углерода. Далее после разведений и высева на минеральные среды с нефтью отсевали микроорганизмы из изолированных колоний.
Выделение и идентификация штаммов нефтеокислителей
Используемые в работе штаммы микроорганизмов были выделены из почвы Сургутского нефтедобывающего региона и Кемчугской нефтеперекачивающей станции Красноярского края которые были загрязнены и не подвергалась очистке. Сообщества микроорганизмов, полученных методом накопительной культуры утилизацию углеводородов на минеральной среде при концентрации нефти в среде 10-20 г/л осуществляли со скоростью, вдвое большей, чем отдельные штаммы. Однако, но при более высоких концентрациях нефти - 100-150 г/л активность культур резко снижалась. Было получено 60 изолятов. Методы выделения и исследования нефтеокисляющих способностей штаммов описаны в методической части. Аборигенное происхождение штаммов не вызывает опасений о чужеродности их влияния на природные экосистемы при интродукции в случае ликвидации возможных аварийных выбросов нефти.
Отбор штаммов, имеющих высокую нефтеокисляющую способность, проводили на жидких средах при начальной концентрации нефти 100 г/л и наличии в среде полимерного сорбента. Устойчивые результаты по биодеструкции внесенной нефти показали 10 выделенных штаммов. Они были проверены на патогенность краевой ветеринарной лабораторией ( приложение).
При адаптации на средах с полимерным сорбентом нефтеокисляющую способность сохранили 10 выделенных штаммов, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus Rodococcus, Arthrobacter, Nocardia, Enterobacter. Методами, принятыми в микробиологии, и секвенсорного анализа определили, что исследуемые штаммы 2 сп Bacillus subtilis, 4 сп Rhodococcus sp, 11 аб Pseudomonas sp., 2 аб Enterobacter sp., относятся к родам Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Enterobacter.
Определения культуральных признаков и идентификацию выделенных штаммов проводили по методикам, приведенным в разделе 2. Родовую принадлежность устанавливали по наличию у них определенных морфологических и физиологических признаков исходя из описаний определителя Берджи [86] Двух-пяти суточные культуры тестировали на подвижность. Результаты приведены в приложении таблице А1.
