Введение к работе
Актуальность проблемы. Целлюлоза - самый распространенный биополимер на Земле. Целлюлозосодержащая биомасса (ЦСБ) - возобновимый и доступный источник сырья и энергии. В больших количествах целлюлозосодержащие отходы накапливаются в процессе переработки леса, а также в целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях. Российская Федерация обладает обширнейшими запасами леса в мире и развитым сельским хозяйством, поэтому для неё актуальна проблема эффективного использования ЦСБ, переработки отходов лесной и сельскохозяйственной промышленности.
Биоконверсия является одним из самых перспективных и экологически рациональных методов переработки ЦСБ с целью получения сбраживаемых Сахаров, которые в дальнейшем могут быть направлены на биотехнологическую переработку. Ключевым моментом в данном процессе является гидролиз целлюлозы, катализируемый ферментными препаратами (ФП). Целлюлазные ФП чаще всего представляют собой комплекс белков, секретируемых грибными продуцентами, например, грибами родов Trichoderma или Myceliophtora. В данной работе в качестве продуцентов использовали различные штаммы гриба Penicillium verruculosum, ФП на основе этого гриба обладают высокой гидролитической способностью и являются конкурентоспособной альтернативой современным промышленным ФП.
Ферментные комплексы, осуществляющие эффективную конверсию ЦСБ, содержат целлюлазы - эндоглюканазы (ЭГ), целлобиогидролазы (ЦБГ), Р-глюкозидазы (БГЛ), гемицеллюлазы и различные вспомогательные ферменты. Эффективность гидролиза ЦСБ зависит от ряда факторов, в том числе от сбалансированности состава ФП и от биохимических характеристик индивидуальных компонентов, входящих в состав ферментного комплекса. В мировой практике для создания биотехнологически важных ФП используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генетической инженерии и микробиологии для получения рекомбинантных штаммов-продуцентов, секретирующих комплекс белков с необходимыми свойствами. Поиск новых высокоактивных компонентов ФП и исследование влияния соотношения компонентов в комплексе на процесс гидролиза целлюлозы в перспективе приведет к получению новых ФП, позволяющих снизить стоимость переработки ЦСБ.
Таким образом, создание новых ФП с измененным компонентным составом и увеличенной гидролитической способностью по отношению к ЦСБ является актуальной задачей.
Цели и задачи исследования. Целью исследования являлось получение и изучение свойств ФП на основе новых рекомбинантных штаммов гриба P.verruculosum с модифицированным компонентным составом, обладающих увеличенной эффективностью гидролиза ЦСБ.
В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
Продемонстрировать целесообразность трансформации штамма-реципиента P.verruculosum В221-151 генно-инженерной фьюжн-конструкцией, несущей гены одновременно нескольких высокоактивных целлюлолитических ферментов;
Исследовать свойства препарата на основе штамма P.verruculosum, несущего ген гетерологичной полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - эндоглюканазы IV Т. reesei (ЭГТУ), выделить данный фермент в гомогенном виде и исследовать его свойства;
Осуществить трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующегося конститутивной экспрессией Р-глюкозидазы Aspergillus niger, плазмидами, несущими гены различных целлюлолитических ферментов;
Изучить свойства ФП на основе новых штаммов и исследовать их гидролитическую активность по отношению к ЦСБ, проанализировать компонентный состав новых ФП.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые с помощью метода трансформации грибного штамма-реципиента P.verruculosum В221-151 фьюжн-конструкцией, несущей гены нескольких белков, созданы новые штаммы-продуценты высокоактивных целлюлолитических ферментов. Впервые использован фермент нового типа (ПМО) для повышения эффективности гидролиза целлюлозы ферментными препаратами на основе гриба P.verruculosum. Впервые получены высокоэффективные целлюлазные ФП путём клонирования генов ряда целлюлолитических ферментов (ЭГП, ЦБГІ) в штамм-реципиент P.verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующийся конститутивной экспрессией BTRA.niger.
Показано, что стратегия клонирования генов одновременно нескольких ферментов в составе единой фьюжн-конструкции позволяет получать ферментные комплексы заданного состава. ФП, полученные на основе новых трансформантов целесообразно использовать в качестве усиливающей добавки к целлюлазным ФП. Продемонстрирована целесообразность введения в целлюлазный комплекс нового компонента - ПМО. Присутствие в реакционной смеси данного компонента способно повысить эффективность гидролиза целлюлозы ферментным препаратом более чем на 50%. При использовании в качестве штамма-реципиента для клонирования генов це ллю лаз рекомбинантного штамма P.verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующимся конститутивной экспрессией Р-глюкозидазы A. niger, были получены новые штаммы, секретирующие комплекс ферментов измененного состава. ФП, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum, обладали повышенной (на 20-50%) гидролитической активностью по отношению к ЦСБ, чем ФП, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва 2010), втором международном Конгрессе-
партнеринге и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio» (Москва 2010), международном конгрессе «Биомасса: топливо и энергия» (Москва 2012), VI и VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2011, 2013), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск 2012), Международной конференции «Biocatalysis-2013: fundamentals & applications» (Москва 2012), V Международной конференции «Физико-химия растительных полимеров» (Архангельск 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также 9 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы; главы, посвященной материалам и методам исследования; трех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение; выводов и списка цитируемой литературы, включающего 124 источника. Работа изложена на 104 страницах и включает 49 рисунков и 10 таблиц.
