Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Перспективы конструирования противоинфекционных препаратов на основе живых генетически модифицированных микроорганизмов для перорального введения 13
1.1 Слизистый иммунитет и препараты цитокинов, вводимых перорально - защита организма от проникновения инфекций 14
1.2 Лечебно-профилактические препараты на основе живых нерекомбинантных микроорганизмов-пробиотиков 19
1.3 Перспективы конструирования препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов 43
1.3.1 Аттенуированные патогены как вектор доставки биологически активных молекул в организм 43
1.4 Клонирование генно-инженерных штаммов Bacillus subtilis 78
1.5 Оценка степени риска интродукции ГММО в окружающую среду: теоретические прогнози и экспериментальный анализ 89
Глава 2 Материалы и методы 110
Глава 3 Результаты и обсуждение 122
3.1 Конструирование генетически модифицированных микроорганизмов для разработки нового поколения иммунобиологических и вакцинных препаратов 122
3.1.1 Конструирование рекомбинантных пробиотических штаммов бацилл, продуцирующих интерферон альфа 2 123
3.1.2 Конструирование микробных консорциумов из рекомбинантных пробиотических штаммов 131
3.1.3 Конструирование рекомбинантных вакцинных штаммов энтеробактерий, продуцирующих гетерологичные антигены 133
3.2 Изучение целевых биологических эффектов интерферона при введении живых генетически модифицированных В.subtilis 2335рВМВ 105 в организм 145
3.2.1 Изучение возможности доставки гетерологичных антигенов в организм при введении рекомбинантных аттенуированных штаммов патогенов 145
3.3 Технологические аспекты производства препаратов - рекомбинантных пробиотиков 158
3.3.1 Разработка технологии поверхностного культивирования 159
3.3.2 Разработка технологии глубинного культивирования 163
3.3.3 Конструирование готовых таблетированных форм 171
3.4 Медико-биологические испытания препарата субалин 177
3.4.1 Влияние субалина на эффекторные клетки неспецифической резистентности... 177
3.4.2 Противоопухолевые свойства 183
3.4.3 Адьювантные свойства 191
3.5 Экспериментальная оценка рисков интродукции в окружающую среду генетически модифицированного B.subtilis 2335рВМВ105 200
3.5.1 Влияние генетической модификации на безвредность B.subtilis 2335 201
3.5.2 Влияние генетической модификации на способность к выживанию и адаптации рекомбинантного штамма B.subtilis 2335 pBMBl05 204
3.5.2.1 Разработка молекулярных методов мониторинга 204
3.5.2.2 Выживание и адаптация B.subtilis 2335рВМВ105 в условиях, имитирующих окружающую среду 212
3.5.3 Характеристика потенциальной принимающей среды и возможные негативные экологические воздействия интродукции 227
3.5.4 Оценка риска спонтанной передачи плазмиды природным реципиентам 233
3.5.5 Оценка риска изменения экологического ареала 234
3.6 Разработка схемы применения и исследование эффективности пробиотика субалина в сельском хозяйстве ; 237
3.6.1 Оптимизация схемы применения и изучение эффективности препарата субалин в профилактике диарей и стресса в промышленном птицеводстве 237
3.6.2 Конструирование композиционных кормов с добавлением пробиотика субалина и испытание их эффективности в звероводстве 240
3.6.3 Исследование эффективности препарата субалин в профилактике и лечении аэромоноза карпов в рыбоводческих хозяйствах 243
Выводы 247
Список литературы 249
Приложения 287
- Слизистый иммунитет и препараты цитокинов, вводимых перорально - защита организма от проникновения инфекций
- Оценка степени риска интродукции ГММО в окружающую среду: теоретические прогнози и экспериментальный анализ
- Разработка технологии глубинного культивирования
- Исследование эффективности препарата субалин в профилактике и лечении аэромоноза карпов в рыбоводческих хозяйствах
Слизистый иммунитет и препараты цитокинов, вводимых перорально - защита организма от проникновения инфекций
Иммунная система слизистых (ИСС), включающая в себя лимфоидную ткань, ассоциированную с желудочно-кишечным трактом, является самым большим отделом иммунной системы организма и практически служит первым барьером на пути громадного потока микробного и аллергенного материала, поступающего из внешней среды. Благодаря уникальной способности иммуноцитов к миграции и рециркуляции, иммунная системы организма функционирует как единое целое, а лимфоидная ткань и лимфоидные органы ЖКТ функционально тесно связаны с другими компонентами этой системы /Беляков И.М., 1997; Хаитов P.M., ПинегинБ.В., 1997; Ярилин А.А., 2001/.
Иммунная система ЖКТ условно делится на индуктивный участок, состоящий из миндалин, групповых лимфоидных фолликул (пейеровы бляшки, РР) и регионарных лимфоузлов и эффекторный участок, состоящий из собственной пластинки (Lamina propria) и межэпителиальных лимфоцитов. Показано, что РР играют исключительно важную роль в иммунной системе ЖКТ. Они, как и любые лимфоидные образования, состоят из Т- и В-зон с наличием зародышевых центров в В-зоне, их клеточный состав существенно не отличается от такового любого периферического лимфоузла /Brandtzaeg Р., 1995; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997/. Характерной особенностью РР является уникальная морфологическая структура - фолликулярно-ассоциированный эпителий (М-клетки), главная роль которых заключается в захвате и транспорте антигена внутрь PP. В настоящее время установлено, что транспорт как растворимых, так и корпускулярных антигенов М-клетками является важнейшим фактором в индукции иммунного ответа лимфоидными клетками ЖКТ /Быкова В.П., 1998/. В В-клеточной (фолликулярной) зоне содержится большое число IgA + В-лимфоцитов. В зародышевом центре фолликулярной зоны происходит пролиферация В-клеток с дифференцировкой их в плазматические, которые продуцируют IgA.
В индуктивных зонах происходит первый контакт антигенов с иммунными клетками. Мигрируя из индуктивных участков, примированные Т- и В-лимфоциты, поступая в мезентериальные лимфоузлы, и затем с током лимфы - в кровеносное русло, обеспечивают накопление эффекторных клеток в местах реализации эффекторных функций. Направление миграции эффекторных клеток определяется зоной воспаления и контролируется адгезивными молекулами, экспрессированными на циркулирующих лейкоцитах и сосудистом эндотелии (венулы), где происходит выход клеток в ткани, а также цитокиновым профилем локального микроокружения /Brandtzaeg Р., 1995/. Т-лимфоциты преимущественно поселяются в эпителиальном слое, В-лимфоциты - в L. propria, где происходит их дифференциация в плазмоциты, синтезирующие секреторный IgA (slgA) /Беляков И.М., 1997/.
Секреторный IgA - основной иммуноглобулин секретов слизистых. Его секреторный компонент выполняет функцию рецептора и способствует проникновению в эпителиальные клетки, защищая иммуноглобулин от действия протеолитических ферментов. Высокая эффективность IgA в условиях постоянной антигенной нагрузки обусловлена его устойчивостью к действию протеаз, поливалентностью и выраженным сродством к поверхности слизистых, которое, как считают, связано с тем, что молекулы SlgA специфически взаимодействуют с цистеином, присутствующим в слизистых, за счет чего и прикрепляются к слизистым покровам /Brandtzaeg P. et al., 1995; Беляков И.М., 1997/. SlgA выполняет две основные функции, связанные с защитой от инфекционных возбудителей и элиминацией пищевых и других чужеродных антигенов, а также с регуляцией иммунного ответа на эти антигены /Олардис Р.А., Бененсток Д., 1984/. Доказано, что SlgA антитела блокируют адгезию микроорганизмов к эпителиальным клеткам слизистых за счет карбо-гидрат-специфических взаимодействий. Этот эффект зависит от других антимикробных субстанций слизистых (лизоцим, лактоферрин) и от состояния нормальной микрофлоры /Metze D. et al., 1981; Mega J. et al., 1995/.
Противовирусная функция обусловлена взаимодействием полимерных SlgA антител с гликопротеинами вирусов (полиовирус, Эпштейна-Барр, ротавирус, вирус гриппа) в местах их прикрепления к слизистой. Внутриклеточное взаимодействие вирусов с антителами приводит к блокированию процессов транскрипции вирусных геномов. В процессе внутриклеточного транспорта SlgA или комплекс SIgA-антиген способен взаимодействовать с Fc-альфа рецепторами Т-лимфоцитов и АПК, что обеспечивает регуляцию иммунного ответа в ИСС /Беляков И.М., 1997/.
В формировании иммунного ответа в слизистой важную роль играют клетки не-лимфоидной природы - дендритные и эпителиоциты. Дендритные клетки способны связывать АГ, и при активации, во время миграции в лимфоузлы или в участки воспаления (под действием ГМ-КСФ или ФНО-альфа), представлять их Т-клеткам. Эпителиальные клетки в условиях воспаления под действием ИФН-гамма экспрессируют молекулы МНС-II типа, корецептор В7 (CD28), секретируют ИЛ-7 и способны представлять AT CD4+ хел-перным клеткам, а также стимулировать пролиферацию CD8+ Т-лимфоцитов /Brand P.V., etaL, 1989/.
Т-клеточное звено представлено 2 субпопуляциями лимфоцитов - CD8+ (цитоток-сические/супрессорные) и CD4+ (хелперы/индукторы). Цитотоксические лимфоциты осуществляют в кишечнике защиту от инфицированных эпителиальных клеток, а также уничтожают поврежденные эпителиальные клетки и регулируют численность локально стимулированных лимфоцитов /Melgar S. et al., 1999/. CD4+ делятся на 2 основных типа -Т-хелперы 1 и 2 типа (ТЫ, Th2). ТЫ преимущественно индуцируют и регулируют иммунный ответ клеточного типа посредством продукции цитокинов 1 типа (ИФН-гамма, ФНО-альфа). Th2 регулируют антителопродукцию и продуцируют цитокины 2 типа - ИЛ 4, 5, 9, 13 /Kapselberg M.L. et al., 1999/. В настоящее время выделяют Т-хелперы 3 типа, которые продуцируют ТФР-бета, подавляющий активность ТЫ и обеспечивающий пере ключение на синтез IgA /Weiner H.L. et al., 1999/. Они выполняют иммуносупрессорные функции, что, по-видимому, имеет важное значение в становлении мукозальной толе рантности. ИЛ-10 обладает выраженными иммуносупрессивными и противовоспалитель ными свойствами, что при хронических инфекционно-воспалительных процессах способ ствует длительной персистенции патогенного возбудителя. В нормальных условиях ИЛ-10 способствует формированию мукозальной толерантности и препятствует развитию аллер гических реакций /Weiner H.L. et al., 1999/.
Индукция того или иного типа Т-хелперных клеток определяется рядом факторов, таких как тип дендритных АПК (DC1 или DC2), комбинация костимулирующих молекул, а также цитокиновый сигнал, получаемый Т-хелпером /Weiner H.L. et al., 1999/. ИЛ-12, ИЛ-18 способствуют развитию ТЫ иммунного ответа. Продукция ИЛ-12 запускается во время активации АПК под действием бактериальной или вирусной инфекции, уровень его экспрессии стимулируется ИФН-гамма и, напротив, подавляется ПГЕ2, ИЛ-10, кортико-стероидами. ИЛ-12 усиливает цитотоксичность НК и Т-лимфоцитов, их пролиферацию, дифференцировку Т-клеток в ТЫ, индукцию синтеза цитокинов (ИЛ-18, ИФН-гамма) Т-хелперами 1 типа, угнетение секреции IgE. Эндогенный ИЛ-12, продуцируемый в ИСС, активирует синтез IgA /Boyaka P.N. et al, 1999/, стимулирует реакции ГЗТ, способствует инфильтрации тканей CD4+ клетками /Perry L.L. et al., 1997/, предупреждает развитие аллергических реакций на слизистых /Hogan S. et al., 1998/.
Продукция ИФН-гамма является необходимым условием для обеспечения проти-воинфекционной защиты в ИСС /Culshaw R. et al., 1997; Derry С. et al., 1999/, в том числе противовирусной /Holtzman М. et al., 1998/, а также для эффективной вакцинации /Sasaki 5. et al., 1998/. ИФН-гамма усиливает экспрессию антигенов МНС-1 и МНС-П, в том числе на злокачественных клетках, и стимулирует процессинг антигена в эпителиальных клет ках. ИФН-гамма играет важную роль в индукции и поддержании мукозальной толерант ности /Kweon M.N. et al., 1998/. В норме иммунологическая толерантность в ИСС ассо циируется со снижением продукции ИФН-гамма /Krulova М. et al., 1999; Tobagus Т. et al., 1999; Derry С. et al., 1999/, а искусственно она может быть индуцирована введением его малых доз.
Исследованиями последних лет показана важная роль интерферона-альфа (ИФН-а) в модуляции иммунного ответа на чужеродные и собственные антигены. Высокая продукция ИФН-а осуществляется в слизистой ЖЕСТ моноцитарно-макрофагальными и эпителиальными клетками под действием патогенных возбудителей в процессе представления антигена Т-лимфоцитам /Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Tough D.F et al, 1996; Tompkins W.A., 1999/. ИФН-а индуцирует экспрессию (32-субъединицы рецептора к ИЛ-12 (ИЛ-12Rbl/b2), такой тип рецептора характерен только для Т-хелперов 1-го типа и обеспечивает их отвечаемость на ИЛ-12. В свою очередь, ИЛ-12 повышает экспрессию рецепторов к ИЛ-18 на Т-клетках, а ИЛ-18, синтезируемый АПК при стимуляции ИФН-а, приводит к ИЛ-18 - зависимой продукции Т - клетками ИФН-гамма, необходимого для развития Thl иммунного ответа /Cho S.S. et al., 1996; Rogge L. et al., 1997/, тем самым обеспечивается развитие иммунного ответа по ТЫ типу. ИФН-гамма также активирует макрофаги для цитолиза вирус-инфицированных клеток /Holtzman М. et al., 1998/. Все вышесказанное позволяет рассматривать ИФН 1 типа (альфа и бета) как ключевой цитокин, являющийся связующим звеном между неспецифическим и адаптивным ответом организма на возбудитель, обеспечивающий формирование CD8+ 1 Т клеточного ответа и резистентности к внутриклеточным патогенам, в частности, к вирусам /Beilharz M.W.et al., 1997/.
Ассоциированная с желудочно-кишечным трактом лимфоидная ткань играет важную роль в развитии полноценного иммунного ответа, поскольку основной поток чужеродных антигенов микробной и пищевой природы контактирует с ней, индуцируя наиболее ранние иммунологические события в ИСС. После презентации антигенного материала в индуктивных зонах ИСС примированные Т- и В-лимфоциты расселяются в лимфоидной ткани всех слизистых оболочек и иммунокомпетентных органах /Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997/. Противоинфекционная защита осуществляется в несколько этапов и начинается с реакции неспецифических факторов, которая определяется локализацией патогенов. Против внеклеточно локализованных патогенов, в том числе вирусов, действуют фагоцитирующие клетки, комплемент, белки острой фазы; против внутриклеточных - ИФН 1-го типа (альфа и бета), естественные киллерные клетки. Неспецифическая реакция развивается в первые 3-4 дня, местно, с вовлечением мигрировавших лейкоцитов и способствует ограничению инфекции.
Оценка степени риска интродукции ГММО в окружающую среду: теоретические прогнози и экспериментальный анализ
Возможные негативные последствия интродукции ГММО Отсутствие фактической информации о том, что именно могут представлять такие отрицательные последствия, вынуждает делать теоретические предположения, которых сделано немало /Дебабов В.Г., 1992; Бельков ВВ., 1994; Smit Е., 1992/.
На основе этих теоретических предположений типы негативных последствий могут быть сведены к следующим (таблица 4):
Рациональные оценки риска базируются на поиске ответа на ряд вопросов, из которых первым по значимости может быть: способны ли ГММО неограниченно и интенсивно размножаться в окружающей среде?
Для размножения необходимы доступные субстраты, но в окружающей среде за редким исключением наблюдается их глубокое лимитирование. Доступного субстрата настолько мало, что, например, почвенные микроорганизмы за год совершают в среднем от менее одной, до 36 генераций. В водных средах доступных углеродных субстратов значительно меньше и они ассоциированы с гумусом /Morita R.Y. et al., 1980/.
Основное состояние природных микроорганизмов - глубокое голодание, при котором метаболическая активность снижается практически до нуля /Morita R.Y. et al. 1980/: резко падает редокс потенциал, энергетический статус, значение рН цитоплазмы, изменяется состав мембранных белков /Matin А., 1991/. Однако при этом индуцируется синтез специфических белков, функция которых заключается в обеспечении выживания в неблагоприятных условиях. Эти специфические белки (структура которых у прокариот и эука-риот эволюционно консервативна, что говорит о их кардиальной роли для выживания) являются анфолдазами и шаперонами, обеспечивающими правильное свертывание белковых молекул и макромолекулярных ансамблей, что способствует большей их компактизации и консервации /Matin А., 1991; Бельков В.В., 2002/.
Глубокое субстратное лимитирование повышает уровень мутационного процесса в клетке. Появился новый термин «адаптационный» (SOS) мутагенез. Частота мутационных событий при таком мутагенезе в несколько раз выше, чем при спонтанном "эволюционном" процессе /Rosenderg S.M., 2001; Бельков В.В., 2002/.
В состоянии глубокого субстратного лимитирования микроорганизмы становятся практически невосприимчивыми к внешним факторам и переходят в некультивируемое состояние. Они не обнаруживаются методами, основанными на детекции метаболической активности, хотя другими методами (микроскопией, иммунофлуоресцентным анализом, гибридизацией ДНК, ПНР их можно обнаружить /Atlas R.M. et al., 1992/. Плазмиды в не-культивируемых клетках могут сохраняться /Recorbet G. et al., 1992; Прозоров А.А., 1999/. На стандартных средах при длительной инкубации чаще всего не удается восстановить способность к росту, нужны специальные среды и приемы /Гинцбург А.Л. и др., 1999/. В естественных природных условиях в некультивируемом состоянии может находиться до 90- 99% от общего количества микроорганизмов /Recorbet G. et al., 1992/. Это свидетельствует о том, что все пригодные для жизнеобеспечения ниши и субстраты заняты природными микроорганизмами. Какие ниши и субстраты могут достаться ГММО, ин-тродуцируемым в окружающую среду?
Большой многолетний опыт свидетельствует, что даже немодифицированные, природные микроорганизмы, внесенные в свою родную экологическую нишу плохо приживаются и размножаются в почве и воде /Recorbet G. et al., 1992; Smit E. et al., 1992/.
Помимо глубокой нехватки субстрата, дополнительное негативное влияние на выживаемость интродуцируемых ГММО могут оказывать факторы окружающей среды: биотические (антагонистическое влияние естественной микрофлоры, хищничество, паразитизм) и абиотические - температура, влажность, рН, доступность кислорода и т.п.).
В настоящее время существует общий взгляд на микробные экосистемы как системы, имеющие тенденцию к гомеостазу и толерантность к возмущениям. Предполагается, что только в условиях нарушения гомеостаза у ГММО появляется возможность для предпочтительного размножения. Т.е. именно гомеостаз почвенных микробных популяций определяет судьбу ГММО.
Обобщение результатов большого количества экспериментов по интродукции позволило классифицировать ГММО по динамике численности на три типа /Бельков В.В., 1994/. 1-ый тип - быстрое (3 дня) исчезновение до недетектируемого уровня, переход в некультивируемое состояние (в основном штаммы Е. coli), 2-ой - экспоненциальное уменьшение численности (за 7 дней остается до 100 клеток на 1 г почвы, штаммы В. subtilis) и.З-ий - сравнительно быстрое экспоненциальное уменьшение (на 1-4 логарифма в первые 1-14 дней) с последующим медленным сокращением до выхода на плато. Отмечается, что динамика численности ГММО зависит от природы штамма и типа почвы /Trevors J.T. et al., 1988; Smit E. et al., 1992; Бельков B.B., 1994/.
Сходная закономерность наблюдается при интродукции ГММО в водные экосистемы. Грамотрицательные микроорганизмы сохранялись в дренажных сельскохозяйственных водах, речной и морской воде от нескольких месяцев до года, находясь преимуще 92 ственно в некультивируемом состоянии. Утрата плазмид происходит в первые дни интродукции /Barcina I. et al., 1992; Прозоров А.А., 1999/.
Для рациональной оценки риска важным является вопрос влияния генетической модификации (ГМ) на выживание и конкурентноспособность ГММО в среде по сравнению с немодифицированным родительским штаммом.
Преобладают сведения, что ГМ не влияет на конкурентноспособность ГММО, в целом чаще всего даже понижают (опыты с Е. coli, P. putida, Е. carotowora /Smit Е. et al., 1992/. Исключением будут случаи, если ГМ обеспечивает штамму утилизацию того субстрата (например, ксенобиотика), которые природные микроорганизмы утилизировать не могут. В этом случае ГММО будут размножаться, пока не утилизируют весь субстрат /Smit Е. et al, 1992; Бельков В.В., 1994/.
В этом отношении также была изучена возможность обеспечения выживания ГММО в среде за счет клонирования в них генов устойчивости к антибиотикам, которые, во-первых, синтезируются почвенными микроорганизмами, а во-вторых, могут быть привнесены. Несмотря на то, что многие почвенные микроорганизмы, в частности грибы, некоторые природные штаммы Pseudomonas spp., способны синтезировать канамицин и другие антибиотики, однако, однозначно положительных результатов не получено. В случае искусственного внесения антибиотика в почву с целью увеличения выживаемости ГММО, несущего ген устойчивости, опыты показали слабо положительный результат. Выживаемость ГММО практически не увеличилась, как полагают авторы по причине резкого уменьшения конценрации антибиотика из-за адсорбции на почвенных частицах. Но высказывается альтернативное мнение, что в почве присутствует природная популяция, устойчивая к данному антибиотику, и внесение его способно активировать размножение данной популяции, а не интродуцируемого ГММО /цит. по Бельков В.В., 1994/.
Подводя итоги возможности безудержного размножения ГММО и, как следствие, вытеснения природных популяций, в обзорах /Smit Е. et al., 1992; Дебабов В.Г., 1992; Бельков В.В., 1994/ авторами делаются следующие выводы:
-риск безудержного размножения ГММО в окружающей среде практически отсутствует; -риск того, что ГММО смогут эффективно конкурировать с природными почвенными микроорганизмами крайне незначителен;
-ГММО могут сохраняться в окружающей среде длительное время в виде жизнеспособных, но некультивируемых клеток, способных сохранять плазмиду, что не позволяет теоретически исключить возможность при благоприятных условиях их реактивации и способности к размножению.
Особенностью макроорганизма как потенциальной принимающей среды является то, что микробное звено биотопов макроорганизма находится в состоянии гомеостаза, более устойчивого и не подверженного сезонным изменения /Воробьев А.А. и др., 1999; Бондаренко В.М., 1997/. Наблюдаются индивидуальные, расовые и зависящие от диеты структурные сдвиги в микробном звене, но все они укладываются в понятие нормы, обусловленное эволюционно сложившимися взаимоотношениями макроорганизма-хозяина и симбионтной нормальной микрофлоры /Воробьев А.А., 2000/.
Разработка технологии глубинного культивирования
Глубинное культивирование более технологично, легко масштабируется благодаря возможности использования различных типов ферментеров, работающих в автоматическом режиме управления. Его разработка была продиктована также необходимостью замены лиофильного высушивания как наиболее дорогостоящего, на обезвоживание с использованием распылительной сушки, как более рентабельного способа стабилизации культуры. Распылительная сушка не требует предварительного концентрирования на сепараторе или путем фильтрования, что позволяет сохранить в составе препарата все продуцируемые в культуральную среду БАВ, включая интерферон и пептидные антибиотики.
В лабораторном эксперименте мы провели подбор состава питательной среды и определение параметров процесса при периодическом культивировании бактерий субалина на качалках. Для оценки адекватности условий выращивания проводили наблюдение за растущей культурой с помощью нефелометрического метода /Перт С. Дж., 1982/. Информативным показателем при росте и спорообразовании B.subtilis является изменение рН развивающейся глубинной культуры. Накопление биомассы оценивали по оптической плотности культуральной жидкости (КЖ). Концентрацию жизнеспособных клеток и спор измеряли как при поверхностном культивировании. Физиологическое состояние культуры оценивали с помощью микроскопирования клеток, окрашенных по Граму. При выборе среды учитывали несколько основных параметров: выход биомассы, время культивирования (достижение максимального титра жизнеспособных клеток и споруляции не менее 50%), сохранность плазмидных клеток (не ниже 50%), а также доступность составляющих ингредиентов среды.
Были изучены среды различного состава: среда Спецайзена, обогащенная пептоном и дрожжевым экстрактом (среда 1), эта же среда, обогащенная гидролизатом казеина и дрожжевым экстрактом (среда 2) и минимальная среда Спецайзена (среда 3). Во все среды перед культивированием вносили глюкозу до конечной концентрации 0,02 г/л. Среда Спецайзена была использована как наиболее сбалансированная для культивирования генетически модифицированных бацилл /Клонирование ДНК. Методы, 1988/.
Вопрос об обеспечении жизнедеятельности бактерий данного вида в глубинных условиях достаточным количеством кислорода, необходимым для нормального роста и развития, недостаточно изучен. Для каждого микроорганизма существует свой оптимум аэрации, при котором создаются наиболее благоприятные условия для его развития /Работнова И.Л. и др., 1979; Перт С.Дж., 1978/.
В. subtilis 2335 - строгий аэроб, поэтому недостаток кислорода является наиболее лимитирующим фактором при культивировании. Для бактерий Bacillus влияние данного параметра на эффективность глубинного культивирования является сложным, противоречивым и во многом неизученным /Филин В.А. и др., 1998/.
При конструировании рекомбинантного штамма В. subtilis 2335рВМВ105 нами была отмечена повышенная чувствительность клеток к недостатку кислорода, что приводило к усилению автолиза плазмидных клеток, преобладанию процессов автолиза над процессами спорообразования и, в конечном итоге, к накоплению бесплазмидных спор.
Учитывая негативное влияние недостатка кислорода, при разработке лабораторных условий культивирования мы создавали максимально возможный уровень аэрации. Он достигался при использовании рабочего объема среды в соотношении не менее, чем 1:10 к объему качалочной колбы: при выращивании на качалке с оборотами 200 об/мин это обеспечивало максимальный коэффициент массопередачи по кислороду (К1) 242 час"1 /Зурабова Э.Р. и др., 1987/. Селективное давление, без которого при глубинном культивировании происходит быстрая элиминация плазмид, создавали путем однократного внесения в среду культивирования канамицина до конечной концентрации 50 мкг/мл.
Основные параметры роста и физиологического состояния состояния рекомбинантного штамма представлены в таблице 24.
Как видно из таблицы 24, максимальный выход биомассы наблюдали на среде N1 (на других средах также были достаточные выходы биомассы). Титр клеток к концу культивирования составил (1,5-0,7)х109. Полученные показатели являются довольно высокими, и в несколько раз превышают показатели роста другого рекомбинантного штамма B.subtilis BG 2036 рТМ 261- продуцента нейтральной протеазы. Низкие показатели роста и отсутствие спорообразования авторы данного штамма объясняют токсичностью сверхсинтеза нейтральной протеазы.
Достигнув максимума к 8 ч. роста, ОПбоо в течение последующих часов практически не изменялась. При выращивании свыше 8-ми часов отсутствовала корреляция между оптической плотностью и титром клеток. Происходили изменения в физиологическом состоянии клеток, наблюдаемые в микроскоп при окрашивании мазков. Одиночные клетки, преобладающие в начальной и экспоненциальной фазах роста, при переходе к стационарной фазе образовывали цепочки с постепенным переходом в споры. Процесс споруляции начинался не ранее 28 - 30 ч. роста. На среде N3 отметили значительный лизис клеток. Несмотря на добавление в среду канамицина, наблюдали процессы элиминации плазмид и появление в популяции бесплазмидных клеток. Вероятно, в процессе длительного культивирования происходит уменьшение плазмидосодержащих клеток за счет деградации и утилизации канамицина, что приводит к ослаблению селективного давления. Ввиду определенных особенностей, условия глубинного культивирования более способствуют элиминации плазмидных клеток из популяции. Поэтому особенно важно при проведении глубинного культивирования создавать условия, препятствующие такой элиминации. Необходимо в процессе выращивания культуры вносить дробно канамицин. Выращивание на качалках показало принципиальную возможность получения культуры с необходимыми показателями качества методом глубинного культивирования. На следующем этапе мы изучили возможность масштабирования процесса.
Разработку условий масштабного глубинного культивирования проводили на опытно-экспериментальной базе (цех 36) Бердского химического завода биопрепаратов. Был использован 50 литровый ферментер с автоматическим поддержанием основных параметров культивирования: массообмена кислорода, нейтрального рН. Отбор проб до 10 часов роста проводили ежечасно, затем каждые 2 часа. Показатели роста культуры В. sublilis 2335рВМВ105 в 50-ти л. ферментере представлены в таблице 25 и на рисунке 13. При глубинном выращивании рекомбинантных бактерий В. subtilis 2335рВМВ105 на среде N1 в 50-ти л ферментере определяли следующие показатели, характеризующие рост и физиологическое состояние клеток: ОП, КОЕ и КОЕт, репликационную стабильность плазмиды, начиная с 14 ч, когда культура выходит из экспоненциальной фазы роста. В динамике, начиная с этого же часа, изучали морфологию клеток с использованием световой микроскопии мазков КЖ, окрашенных по Цилю-Нильсену. Как видно из таблицы 25, в течение первых 10-12 ч роста культура морфологически гомогенна. Преобладают тонкие одиночные или двойные палочки. К 12-14 ч появляются укороченные палочки с просветлением, что свидетельствует о подготовке культуры к спорообразованию. Таких клеток становится все больше и к 18-22 ч их количество составляет почти половину. Кроме того, в этот период времени появляются незрелые споры, количество которых быстро увеличивается и достигает почти 50% к 30 ч. С 26-30 ч появляются первые зрелые споры, которых к 34 часам становится более половины. Обращает на себя внимание усиление автолиза, что видно по появлению обломков лизированных клеток, а также по падению ОП и КОЕ.
Исследование эффективности препарата субалин в профилактике и лечении аэромоноза карпов в рыбоводческих хозяйствах
Исследования возможности применения пробиотиков для лечения заболеваний рыб начаты сравнительно недавно. Изучены потенциальные пробиотические свойства б видов молочнокислых бактерий Lactobacillus rhamnosus АТСС 53103, L. rhamnosus LC 705, L. casei Shirota, L, bulgaricus, Lactobacillus johnsonii Lai и Bifidobacterium lactis ВЫ2, используемых для человека и один - для животных - Enterococcus faecium Tehobak, которые были выбраны для исследования возможности защиты рыб от патогенов /Nikoskelainen S, 2001/. Подобный подход открывает новые перспективы в рыбоводстве.
Аэромонады - возбудители бактериальной гемораггической септимцемии у рыб, могут вызывать геморагги и у теплокровных, в том числе у человека /Morgan J.A. et al. 1993/. Иногда при вспышке аэромоноза выделяются вирулентные штаммы, вызывающие 100%-ную гибель рыбы в течение первых суток. Известно также, что заболеваемости способствует снижение иммунитета, вызванное стрессовыми экологическими факторами.
Курс лечения антибиотиками составляет не менее 10 дней и часто приводит к им-мунодепрессивным состояниям у рыб, ухудшению эпизоотической ситуации, снижению потребительских качеств промысловой рыбы из-за наличия антибиотиков /Навашин СМ., 1988/. Альтернативой применению антибиотиков является использование пробиотиче-ских препаратов из живых бактерий, обладающих антагонистическим действием в отношении возбудителей заболевания /Смирнов В.В. и др., 1993/. Основанием использования субалина в рыбоводстве послужили следующие данные:
- бактерии В. subtilis 2335 рВМВ 105 могут осуществлять свою жизнедеятельность при низких температурах (12-18)С в организме пойкилотермных животных, к которым относят и рыб;
- интерфероны являются видоспецифическими белками, однако частичная гомология позволяет им проявлять, хотя и пониженную, специфическую активность у эволюционно далеко стоящих видов животных.
Предварительно мы изучили влияние субалина на угнетение роста бактерий - возбудителей аэромонозов рыб при совместном культивировании in vitro.
Поскольку антагонистические свойства сенной палочки (Bacillus subtilis) проявляются на необогащенной питательной среде, испытания проводили на пептонной воде. В пробирки с пептонной водой вносили субалин по 0,04 дозы до конечной концентрации спор 0,008 дозы. Полученные результаты отражены в таблице 57.
После суточного культивирования отмечали помутнение пептонной воды. Во все 8 пробирок внесли взвесь культур аэромонад, патогенных для рыб штаммов, выращенных в течение суток на мясопептонном агаре и смытых физиологическим раствором, в разведении до конечной концентрации 1 млн.кл./мл (всего около 100 тыс.кл.). Для контроля культуры аэромонад высевали в пептонную воду без добавления субалина. Культивирование проводили при 20С, при этом ежесуточно производили высевы на чашки со средой Эндо для подсчета жизнеспособных аэромонад. Результаты показали, что при совместном культивировании 5. subtilis и A. hydrophila в пептонном бульоне подавление роста аэромонад у исследованных нами штаммов происходило уже на 4-ые сутки.
Профилактика и лечение заболеваемости карпов, в частности аэромоноза, заключалась в использовании лечебных кормов с добавлением субалина в количестве не менее 100 доз (700 млрд. живых бактерий Bacillus subtilis в споровой форме) на 1 тонну корма из расчета 5% лечебного корма к массе рыб. Корм давали ежедневно в течение не менее, чем 5 дней. Лечебно-профилактическое действие субалина было изучено при экспериментальном заражении сеголеток карпа карпа средней штучной массой 22 г, в аквариальной лабораторной установке "Шатурское". Рыб содержали в непроточных аквариумах (при работающих аэраторах) с температурой воды 19-20С; кормили в соответствии со стандартным рационом. После адаптации (в течение 14 дней) рыб поделили на 4 группы: три опытных и одну контрольную, по 20 особей в каждой. В опытных группах испытывали действие субалина в различных дозах. Рыбы контрольной группы препарат не получали. Спустя сутки после двукратного скармливания субалина в смеси с кормом, сеголетков карпа подвергали внутрибрюшинному заражению двухсуточной бульонной культурой А. hidrophila в дозе 0,2 мл на 1 рыбу, что соответствует 0,2 млрд. микробных клеток. За под опытными рыбами наблюдали в течение 12 дней. Учитывали поведенческие реакции рыб, клинические признаки болезни. По окончании опыта проводили анатомическое вскрытие рыб. В контрольной группе первый случай гибели карпов констатировали на третьи сутки после заражения. В двух опытных группах первые случаи гибели рыб отмечены на 4-5 день после заражения аэромонадами. У больных рыб (контрольная группа) отмечали эк-зофтальмию, общее и локальное ерошение чешуи, выпячивание ануса, асцит, точечные кровоизлияния на поверхности тела и у основания грудных плавников. В опытных группах признаки болезни были выражены менее отчетливо. В третьей опытной группе, где рыбы получали самую высокую дозу субалина, гибель карпов отметили только на 9-10 день после заражения.
Из экспериментальных данных можно сделать вывод, что двухкратное применение корма с добавкой субалина обеспечивает защиту рыб от патогенного действия аэромонад при внутрибрюшинном заражении. С увеличением дозы субалина устойчивость к заражению возрастает.
Изучение лечебного эффекта субалина при аэромонозе рыб проводили в нагульных прудах Бисеровского рыбокомбината во время вспышки заболевания. Перед производственными испытаниями был проведен клинический осмотр и ихтиопатологическое исследование 100 экземпляров карпа из нагульного пруда. У всех осмотренных рыб отмечена сухость кожного покрова (у зеркальных и чешуйчатых карпов), анемия жабр, гиперемия брюшка, точечные и пятнистые кровоизлияния, единичные язвы на поверхности тела (более чем у 60% осмотренных рыб), воспаление ануса (20% рыб). При анатомическом вскрытии отмечены анемия печени, увеличение объема и дряблость почек, на слизистой кишечника у всех подвергнутых вскрытию рыб очаги точечных и пятнистых кровоизлияний (передний и средний отделы), признаки воспаления плавательного пузыря (у 41% рыб), гиперемия магистральных сосудов внутренних органов (печени, почек, наружных капилляров кишечника). На основании клинического осмотра и анализа результатов анатомического вскрытия был поставлен диагноз: аэромоноз карпов.
При лечении субалином препарат добавляли в корм, который готовили перед кормлением. Для разового кормления субалин в количестве 200 доз (700 млрд. спор) добавляли к 1 тонне корма, предварительно растворив препарат в воде. Кормление лечебным кормом проводили в течение 5 дней из расчета 5% лечебного корма к массе рыб. Температура воды колебалась от 20С до 12,5С, содержание кислорода составляло от 2,5 до 3,0 мг/мл. На 12-е сутки после окончания лечебного курса проведен контрольный отлов рыбы. Путем наружного осмотра рыбы после курса лечения субалином было установлено, что у всех особей поверхность тела равномерно покрыта блестящей, прозрачной елизью; жабры темно-вишневого цвета, что соответствует физиологической норме; количество рыб с внешними поражениями (язвы, покрытые эпителиальной тканью, гиперемия брюшка, выраженный сосудистый рисунок плавников) не превышало 1%. После применения субалина было достигнуто заживление язв, ослизнение кожного покрова, улучшение состояния жаберного аппарата; стабилизация функций кишечника и улучшение его ферментативной активности; восстановление естественного баланса между нормальной и потенциально патогенной микрофлорой кишечника.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:
- профилактика и лечение заболевания карпов аэромонозом с использованием про-биотического препарата субалин показали высокую эффективность препарата;
- показана принципиальная возможность использования субалина в смеси с кормом в целях повышения иммунорезистентности карпов к заболеванию аэромонозом;
- отработана технологическая схема приготовления корма с добавлением пробиоти-ка субалина, подобраны оптимальные дозы препарата для лечения и профилактики аэромоноза карпов в рыбоводческих хозяйствах;
- субалин обладает антагонистической активностью в отношении патогенных для рыб исследованных штаммов аэромонад и вызывает угнетение их роста на 4-ые сутки.
В заключение отметим, что пробиотический препарат субалин, сконструированный на основе рекомбинантного штамма Bacillus subtilis показал высокую эффективность при его применении в качестве лечебно-профилактического средства в различных отраслях сельского хозяйства: птицеводстве, звероводстве и рыбоводстве. Помимо антагонистических свойств родительского штамма, рекомбинантный аналог приобрел дополнительно антивирусную и иммуномодулирующую активности. Продукция интерферона, детерми-нирумая рекомбинантной плазмидой обеспечивает пробиотику субалину пролонгированное действие, повышая тем самым его эффективность.
Показано многогранное и разностороннее положительное действие пробиотика субалина на организм животного-хозяина через регулирование и нормализацию кишечного микробного баланса: ингибирование роста патогенных представителей кишечной микрофлоры, изменение микробного метаболизма, стимуляцию иммунной системы.
