Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Предпосылки создания современного поликомпонентного пробиотического препарата 17
1.1 .Этапы жизненного цикла биотехнологического продукт 17
1.2.Современные представления о микробиоте человека и ее влиянии на макроорганизм 20
1.3.Нарушение нормобиоценоза ЖКТ и способы его коррекции 31
Собственные исследования 58
Глава 2. Материалы и методы исследований 58
2.1 .Производственные штаммы микроорганизмов и среды для их культивирования 58
2.2.Методы исследования 60
2.3.0бъем проведенных исследований 72
Результаты исследования и их обсуждение 75
Глава 3. Биосовместимость, как основной принцип создания безопасных и эффективных поликомпонентных пробиотических препаратов 75
3.1. Видовая идентификация пробиотических штаммов в поликомпонентной ассоциации . 77
3.1.1. Изучение морфологических свойств 79
3.1.2. Идентификация биохимических свойств 85
3.1.3. Идентификация производственных штаммов молекулярно- генетическим методом 91
3.1.4. Изучение чувствительности производственных пробиотических штаммов к антибиотикам 95
3.1.5. Определение антагонистической активности производственно перспективных штаммов бифидо- и лактобактерий 99
3.1.6. Изучение культуральных свойств производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл 101
3.2.Межвидовые взаимодействия пробиотических штаммов в процессе производства поликомпонентных препаратов 103
3.3.Биосовместимость поликомпонентного пробиотического препарата с индигенной микрофлорой человека 107
3.3.1. Исследование характера межштаммовых взаимоотношений при совместном культивировании на плотной питательной среде 108
3.3.2. Исследование характера межштаммовых взаимоотношений при отсроченном подсеве индигенных культур 109
3.3.3 Исследование характера межштаммовых взаимоотношений при совместном культивировании в полужидкой среде
3.4. Сочетание пребиотических компонентов, витаминов, микроэлементов и антиоксидантов с пробиотическими штаммами в составе синбиотического препарата 111
3.4.1 Оценка биосовместимости производственных штаммов с растворимыми пищевыми волокнами ' 112
3.4.2. Взаимодействие витаминов, минералов и антиоксидантов с пробиотическими культурами 118
Глава 4. Концепция создания универсального биотехнологического участка по производству поликомпонентных пробиотических субстанций и готовых форм 122
4.1 .Принципы построения стандартных условий производства 123
4.2.0пределение критериев универсальности технологической цепочки. 134 4.3.Методология увеличения производительности биотехнологического участка 140
Глава 5. Отработка рецептуры и технологии, государственная регистрация и запуск серийного производства жидких иммунобиологических препаратов — Габрифлорин-лакто и Габрифлорин-бифидо 149
5.1. Разработка рецептуры жидких поликомпонентных пробиотических препаратов 149
5.2. Построения универсальной схемы технологического процесса получения жидкого поликомпонентного пробиотического препарата 153
5.3. Оценка микробиологических, санитарно-гигиенических характеристик жидких поликомпонентных пробиотических препаратов, определения гарантийного срока их хранения. Государственная
регистрация и декларирование серии препаратов «Габрифлорин» 155
Глава 6. Отработка рецептуры и технологии, государственная регистрации и запуск серийного производства сухих поликомпонентных пробиотических субстанций - «БАД-субстанция бифидобактерий», «БАД-субстанция лактобацилл» и «БАД-субстанция бифидобактерий и лактобацилл» 160
6.1. Разработка состава поликомпонентных пробиотических субстанций 161
6.2. Создание структуры технологического процесса получения сухих поликомпонентных пробиотических субстанций на основе бифидобактерий и/или лактобацилл 165
6.3. Оценка микробиологических, санитарно-гигиенических характеристик сухих поликомпонентных пробиотических субстанций, определения гарантийного срока их хранения. Государственная регистрация «БАД-субстанции бифидобактерий», «БАД-субстанции лактобацилл» и «БАД-субстанции бифидобактерий и лактобацилл» 168
6.4. Примеры использования разработанной «БАД-субстанции бифидобактерий и/или лактобацилл» в качестве исходного сырья для готовых форм поликомпонентных пробиотических препаратов 172
Глава 7. Современные алгоритмы применения поликомпонентных пробиотических препаратов в инфекционной и неинфекционной патологии 174
7.1. Пробиотические препараты в комплексном лечении язвы желудка и двенадцатиперстной кишки 175
7.2. Оценка эффективности включения пробиотиков в комплекс реабилитационных мероприятий при онкозаболеваниях у детей в период диспансерного наблюдения 182
7.3. Влияние поликомпонентных пробиотиков на липидный обмен у больных с риском развития атеросклероза : 194
7.4. Особенности применения пробиотических препаратов при ротавирусной инфекции у детей 198
Глава 8. Стратегия развития биотехнологической компании в условиях российского фармацевтического рынка 206
8.1. Теоретико-методические основы конкурентного поведения биотехнологической компании 206
8.2. Ассортиментная политика, методы продвижения и конкурентные стратегии отечественных и зарубежных производителей поликомпонентных пробиотических препаратов, работающих на фармацевтическом рынке России 224
8.3. Идентификация типа предпочтительной конкурентной стратегии роста для биотехнологической компании, разработка соответствующей концепции создания и дальнейшего вывода ее новых поликомпонентных пробиотических продуктов на российский фармацевтический рынок 247
Заключение 270
Выводы 294
Практические рекомендации 296
Список литературы 298
Приложения 1-5 340
- .Этапы жизненного цикла биотехнологического продукт
- .Производственные штаммы микроорганизмов и среды для их культивирования
- Видовая идентификация пробиотических штаммов в поликомпонентной ассоциации
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее десятилетие заметно возрос интерес к проблеме поддержания и восстановления микроэкологического статуса человека. Для этих целей все шире используют бактериотерапевтические препараты -пробиотики. Повышенное внимание к пробиотикам вызвано ростом контингента лиц, требующих коррекции аутофлоры, и прогрессом в изучении состава и биологических свойств микрофлоры, заселяющей различные биотопы человеческого организма, ее роли в поддержании здоровья макроорганизма; использованием микроэкологических подходов к раскрытию этиопатогенеза различных заболеваний; выявлением полезных свойств у микроорганизмов, не встречающихся в норме в биоценозах человека [43, 60, 67, 75, 229, 234].
Эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав [40, 219, 233]. Отдельные производители расширили спектр культур, используемых в составе новых пробиотиков, включив в их рецептуру спороносные аэробные бациллы (род Bacillus), энтерококки, пропионовокислые бактерии, аэрококки, сахаромицеты, высшие грибы {Aspergillus, Risopus, Cordiceps) [145, 165, 174, 242]. Другие - пытаются повысить биологическую активность пробиотиков за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных композиций штаммов, сочетания компонентов пре- и пробиотического происхождения, а также добавляя продукты метаболизма микрофлоры [6, 8, 18, 26, 237].
С одной стороны, расширение ассортимента пробиотиков способствует удовлетворению все более возрастающих требований клиники в антидисбиозных препаратах. Но, с другой стороны, настораживает увеличение количества пробиотиков, содержащих в своем составе нетипичные для нормофлоры человека микроорганизмы или потенциально патогенные виды факультативной части биоценоза. В этой связи представляется актуальным использование современных методов оценки биосовместимости экзогенных и индигенных микробных штаммов, а также компонентов бактериального и растительного происхождения в процессе рецептуростроения, технологической отработки и дальнейшего производства новых поликомпонентных пробиотических препаратов.
Современные клинические исследования открывают все новые стороны позитивного воздействия пробиотиков на физическое состояние человека, что позволяет расширить сферу их применения в комплексных лечебно-профилактических мероприятиях при некоторых инфекционных и неинфекционных патологических состояниях, в частности, хеликобактер-ассоциированной язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, гемабластозах и солидных опухолях, дислипидемии и ротавирусной инфекции [200, 151, 239, 288, 301, 343]. Однако развитие новых клинических направлений подразумевает создание инновационных медицинских технологий, позволяющих в полной мере реализовывать биологический потенциал поликомпонентных пробиотических средств.
По данным маркетинговых исследований ЗАО «Группа ДСМ», проведенных в 2009 году, около 77% отечественного фармацевтического рынка в стоимостном выражении составляет импортная продукция, в то же время, согласно отчету, представленному Контрольным управлением Президента РФ, замещение импортных лекарственных препаратов отечественными возможно более чем по 6000 наименований. В рамках направления, заданного правительством в принятом документе «Концепция долгосрочного социально-экономического развития Российской Федерации на период до 2020 года», одной из актуальнейших задач российского биотехнологического сектора является создание высокотехнологичных производств по выпуску конкурентоспособных пробиотических препаратов, которые по своим потребительским характеристикам не должны уступать импортным аналогам. Основным направлением прикладных исследований в этой связи является создание стандартных условий производства, соответствующих GMP, оптимизация технологических процессов и внедрение инновационных методик получения пробиотиков.
Конкурентоспособность биофармацевтического предприятия зависит от общей эффективности его деятельности и определяется совершенством используемых технологий, умелой постановкой маркетинговой службы, действенным менеджментом и рядом других экономических и технических параметров работы фирмы [247]. Исследование проблемы повышения конкурентоспособности с точки зрения теории конкуренции помогает направить усилия по совершенствованию деятельности фирмы в русло правильной, подходящей именно для нее стратегии конкурентной войны [83]. Новые коммерческие фирмы, такие как «Биокад», «Амфита», «Партнер» в отличие от большинства приватизированных предприятий лучше приспособлены для бизнеса в условиях рыночной экономики. Однако и для них выбор оптимальной стратегии на различных этапах жизненного цикла является «болезненным». В сверхбыстро меняющейся российской экономике (где сегодня выгодно биржевое дело, завтра - импорт автомобилей) укрепиться для получения высоких прибылей в сфере производства лекарственных средств, тем более, производимых с помощью суперсовременных наукоемких биотехнологических методов - серьезная стратегическая цель.
Цель исследования
Разработать теоретические и практические принципы конструирования, производства поликомпонентных пробиотических препаратов, алгоритмы их эффективного применения при инфекционной и неинфекционной патологии и продвижения на российском фармацевтическом рынке.
Задачи исследования
1. Разработать методы и теоретически обосновать необходимость оценки биосовместимости промышленно перспективных пробиотических штаммов при конструировании поликомпонентных синбиотических препаратов.
2. Создать структуру универсального опытно-производственного биотехнологического участка по выпуску поликомпонентных пробиотических препаратов.
3. Разработать синбиотическую конструкцию жидких пероральных иммунобиологических препаратов («Габрифлорин-бифидо» и «Габрифлорин лакто»). Отработать рецептуру и технологию их производства. Оценить микробиологические, санитарно-гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов препаратов для определения гарантийного срока хранения.
Осуществить их санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.
4. Сконструировать комплексную синбиотическую субстанцию с различными сочетаниями пре- и пробиотичеких компонентов в качестве исходного сырья для широкого спектра готовых форм пробиотических препаратов («БАД субстанция бифидобактерий и/или лактобацилл»). Отработать рецептуру и технологию производства. Оценить микробиологические, санитарно гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов субстанции для определения гарантийного срока хранения. Осуществить их санитарно гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.
5. Расширить спектр клинического использования и разработать новые алгоритмы применения поликомпонентных пробиотических препаратов в инфекционной и неинфекционной патологии.
6. Сформулировать стратегию развития биотехнологической компании в условиях российского фармацевтического рынка.
Научная новизна исследования
На основе использования современных микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов, впервые предложены подходы к оценке биосовместимости пробиотических штаммов между собой в консорциуме поликомпонентного препарата и с индигенной микрофлорой человека.
Впервые разработана структура универсального биотехнологического участка по выпуску поликомпонентных пробиотических препаратов и методология оценки соответствия GMP созданных на нем стандартных условий производства (заявка на изобретение № 2010145025 и №2010141571).
На базе современного биотехнологического комплекса отработана рецептура и технология получения новых поликомпонентных пробиотических субстанций и готовых форм («БАД-субстанция бифидобактерий и/или лактобацилл» ТУ 9197-007-38989935-08, «Габрифлорин» ТУ 9197-006-38989935-08).
Совместно с ведущими научно-практическими учреждениями г. Москвы, г. Казани и г. Астрахани разработаны новые алгоритмы клинического применения поликомпонентных пробиотических препаратов при ротавирусной инфекции, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, онкопатологии, а также для профилактики и снижения риска развития сочетанной дислипидемии.
Впервые дано системное обоснование применения и эффективности комплекса маркетинга в соответствии с выбранной конкурентной стратегией биотехнологического предприятия, разработаны методические подходы к формированию ассортимента продукции, определению потенциально перспективных пробиотических ниш, выявлены необходимые с точки зрения потребителя характеристики позиционирующихся на них поликомпонентных препаратов.
Теоретическая значимость работы
Теоретически обоснована необходимость и разработаны методы оценки биосовместимости промышленно перспективных пробиотических штаммов при конструировании поликомпонентных синбиотических препаратов.
Создана научная концепция универсального биотехнологического участка по выпуску поликомпонентных пробиотических препаратов и процедура его валидации.
Разработаны теоретико-методологические основы и методические подходы к формированию стратегии развития биотехнологической компании и повышению конкурентоспособности производственно-сбытовых систем в условиях российского фармацевтического рынка. Практическая значимость работы
Конструирование поликомпонентных пробиотиков, основанное на изучении биосовместимости производственных штаммов и подборе их синбиотических ассоциаций, позволяет повысить эффективность и безопасность клинического применения разработанных комбинированных иммунобиологических препаратов.
Созданная структура универсального биотехнологического участка позволяет решать широкий спектр производственных задач по выпуску поликомпонентных пробиотических субстанций и готовых форм препаратов (СЭЗ на пилотный участок по производству БАД Ж77.07.16.000.М.290.03.08 от 11.03.2008, СЭЗ на полномасштабный участок по производству БАД №77.07.16.000.М.005908.06.10 от 08.06.2010).
Проведенные исследования и разработанные на их основе рецептурный состав и нормативная технологическая документация обеспечили прохождение процедуры независимой экспертизы продукции и государственной регистрации Федеральной службой Роспотребнадзора с внесением в Государственный реестр биологически активных добавок к пище: •«Габрифлорин-бифидо» СГРЖ77.99.23.3.У.5705.6.09 от 09.06.2009; •«Габрифлорин-лакто» СГР№77.99.23.3.У.5706.6.09 от 09.06.2009; •«БАД-субстанция бифидобактерий» СГР№77.99.23.3.У.5708.6.09 от 09.06.2009;
•«БАД-субстанция лактобацилл» СГР№77.99.23.3.У.5709.6.09 от 09.06.2009;
•«БАД-субстанция бифидобактерий и лактобацилл» СГР№77.99.23.3.У.5707.6.09 от 09.06.2009.
Новые аспекты применения поликомпонентных пробиотических препаратов позволяют повысить эффективность лечения больных и снизить риск развития побочных эффектов при антибиотико- и химиотерапии инфекционных и неинфекционных заболеваний. Использование разработанной стратегия развития биотехнологической компании позволит повысить конкурентоспособность и эффективность деятельности предприятий отрасли с использованием современных подходов к управлению и комплекса маркетинга.
Внедрение в практику
Зарегистрированные в Федеральном реестре Роспотребнадзора жидкие препараты-синбиотики нового поколения БАД «Габрифлорин-бифидо» и «Габрифлорин-лакто» выпускаются на производственном участке ООО «НПФ Амфита».
Разработанные «БАД-субстанция бифидобактерий», «БАД-субстанция лактобацилл» и «БАД-субстанция бифидобактерий и лактобацилл» используются для промышленного получения следующих готовых препаратов: «Бифидум-Мульти 1», «Бифидум-Мульти 2», «Бифидум-Мульти 3», «Нормоспектрум для детей», «Нормоспектрум для взрослых», «Полибактерин».
Новые алгоритмы применения поликомпонентных пробиотических препаратов «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» внедрены в лечебно-профилактический процесс ряда учреждений здравоохранения: •ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития РФ, г. Москва; •Филиал ГОУ ВПО РГМУ Росздрава «НКЦ геронтологии», г. Москва; •ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Росздрава, г. Казань; •Правобережная больница ФГУ ЮОМЦ Росздрава, г. Астрахань. Анализ результатов данных исследований приведен в клинических отзывах, актах внедрения, протоколах наблюдений.
Универсальная структура производственного биотехнологического участка и валидационные методики оценки стандартных условий производства включены в разрабатываемый коллективом ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора СанПиН «Требования к размещению, устройству, оборудованию, контролю и эксплуатации асептических и контролируемых объектов».
Созданные на основе разработанной концепции универсального производственного участка ТЗ, исходные данные на проектирование и строительство и проект прошли экспертизу Роспотребнадзора СЭЗ №77.07.16.000.Т.000143.02.10 от 01.02.2010 и признаны удовлетворяющими существующим санитарным нормам и правилам.
Разработанная конкурентная стратегия и конкретный комплекс маркетинговых мероприятий использованы компаниями «Биокад», «Партнер» и «НПФ Амфита» при продвижении новых поликомпонентных пробиотических препаратов на российском фармацевтическом рынке в 2003-2009 гг.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработана концепция конструирования пробиотических препаратов, позволяющая усовершенствовать их лечебные свойства, и в связи с этим расширить спектр клинического применения и, в соответствии с предложенным алгоритмом, использовать в схемах лечения инфекционной и неинфекционной патологии.
2. Созданный универсальный биотехнологический участок позволяет наладить выпуск широкого ассортимента конкурентоспособных поликомпонентных пробиотических субстанций и готовых фармакологических форм.
3. Логичным завершением многоэтапного научного исследования, охватывающего целый ряд задач — от составления рецептуры поликомпонентных пробиотических препаратов, их клинических испытаний, выпуска на созданном универсальном опытно-производственном участке — является разработка стратегии продвижения полученных конкурентоспособных препаратов на российский фармацевтический рынок.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №7 от 21.10.2010 г. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: I Московсковском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2003; 8-ом Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2009; 2-ом Международном конгрессе по пробиотикам, Санкт-Петербург, 2009; VI Региональной научно-практической конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском Федеральном округе», Казань, 2009; XI Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 2009; Совместной конференции врачей Республики Татарстан и Российской гастроэнтерологической ассоциации, Казань, 2010; International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics IPC2010, Kosice, Slovakia, 2010; XVI Российской гастроэнтерологической неделе, Москва, 2010; VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2010.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 54 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ - 17, в других изданиях - 17, в патентах на изобретение РФ - 18, в монографиях - 2.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 394 наименований, в том числе, 144 зарубежных и 250 отечественных работ. Диссертация изложена на 297 страницах основного текста, содержит 52 рисунка и 74 таблицы.
.Этапы жизненного цикла биотехнологического продукт
Структуру концепции выведения на фармацевтический рынок нового поликомпонентного пробиотического препарата можно представить в виде многоступенчатого пайп-лайна (т.н. product pipeline), где на входе рассматривается сама возможность создания, а на выходе - готовый продукт, удовлетворяющий конкретную потребность общества в улучшении качества жизни, в данном случае, посредством коррекции нарушенного микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Этапы жизненного цикла биофармацевтического лекарственного средства на примере двух зарубежных компаний - Ambit Biosciences Corporation и Elan Corporation, представлены на рисунке 1. Выставленные в качестве рекламных модулей в интернете эти сетевые графики скрывают большую часть работы, проделанной еще до стадии лабораторных исследований, но и, конечно, из пайп-лайна невозможно понять объем исследований проводимых на каждом этапе жизненного цикла продукта.
Принимая во внимания определенные организационные отличия на пути выведения нового препарата на фармацевтический рынок в России и за рубежом (США и странах ЕЭС) (Табл. 1), а также ряд регистрационных послаблений при оформлении парафармацевтического средства или биологически активной добавки к пище, попытаемся осветить общие проблемы, возникающие при реализации биотехнологического проекта по созданию нового поликомпонентного пробиотического препарата. Для этого воспользуемся собственной унифицированной схемой, иллюстрирующей основные этапы жизненного цикла инновационного продукта (случай копирования рецептуры, т.е. реализации биодженерикового проекта не являлся предметом исследования данной работы) (Рис.2).
Рисунок 1. Пайп-лайн оригинального биотехнологического лекарственного средства на примере компаний Ambit Biosciences Corporation (США) и Elan Corporation (Ирландия) [392, 393].
Организации нового биотехнологического производства предшествует работа маркетологов, заключающаяся в проведении первичных и вторичных маркетинговых исследованиях. В России, также как за рубежом, существуют специализированные агентства - IMS Health, RMBC, DSM, Фармэксперт и др., аккумулирующие данные, необходимые для оценки перспективности выведения нового препарата на тот или иной сегмент фармацевтического рынка и, соответственно, создания под него производственного участка (ни в коем случае не наоборот). Сбор первичной маркетинговой информации осуществляется путем анкетирования репрезентативной выборки конечных потребителей, врачей и провизоров, чаще всего — в местах продаж лекарственных и/или парафармацевтических средств, либо — в амбулаторных медицинских учреждениях [247]. Вторичные маркетинговые исследования: а) клинического характера - выявление часто встречающихся патологических состояний, методы лечения которых требуют усовершенствования и б) экономического - существующий объем в денежном и количественном выражении препаратов, продаваемых на планируемом сегменте рынка, проводятся на основании открытых печатных или интернет источников [248]. Таблица 1. Сравнение этапов внедрения оригинальных препаратов в России и США [391].
.Производственные штаммы микроорганизмов и среды для их культивирования
В данной работе были использованы промышленно-перспективные штаммы бифидобактерий и лактобацилл из Государственного музея нормальной микрофлоры человека ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского (ГКНМ), Коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика, ВНИМИ ЦЛМ, и ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Табл. 11).
В работе использовались следующие питательные среды для
культивирования и идентификации производственных штаммов и определения качественных показателей готовых препаратов и субстанций:
Гидролизатно-молочная - ГМ-среда, с содержанием аминного азота 200±50 мг/%, хлоридов - 0,5-0,6% и рН 7,2-7,4 (по ФСП 42-0504-7224-05 Бифидумбактерин сухой ФГУП НПО «Микроген»);
Среда для культивирования и выделения бифидобактерий - БС (производства ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область); Кукурузно-лактозная среда (по ТУ 10-02-02-789-192-95);
Среда Блаурокка — печеночно-цистеиновая, с содержанием аминного азота - 100+20 мг/%, хлоридов - 0,5-0,6% и рН 7,2-7,4 (по ФСП 42-0504-7224-05 Бифидумбактерин сухой ФГУП НПО «Микроген»);
МРС-2 и МРС-4 (по ФСП 42-0504-6669-05 Ацилакт сухой ФГУП НПО «Микроген»);
Коммерческие среды МПА, Сабуро, Эндо и стафилококковый агар -для контроля образцов на наличие посторонней микрофлоры (производства ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область);
Агаризованная БС, готовившаяся из концентрата коммерческой среды для культивирования и выделения бифидобактерий с добавлением 1,5 г агар-агара в расчете на 1 л конечного объема.
Режим стерилизации для питательных сред составлял 122+1 С, 1,2 атм, 30 минут.
Методы исследования
Метод биохимической идентификации производственных штаммов.
Три биохимические тест-системы - API-20A («bioMerieux», Франция), API-50CHL («bioMerieux», Франция), АНАЭРОтест 23 («PLIVA-Lachema Diagnostica s.r.o.», Чехия) использовали параллельно для определения биохимических свойств и идентификации промышленно-перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл (Рис. 4а).
Проверив чистоту бактериальных культур с помощью микроскопии, с поверхности агаровой пластинки снимали выросшие колонии и ресуспендировали в суспензионной среде тест-систем, добиваясь определенной степени мутности по шкале Мс Farland Standart. Тщательно гомогенезированные в суспензионной среде культуры бактерий вносили в лунки тест-систем, содержащих активные ингредиенты и покрывали минеральным маслом. Для контроля жизнеспособности бактерий во взвеси ее вносили на питательную среду и инкубировали параллельно с тест-системой.
Предварительный учет результатов осуществлялся после инкубирования посевов в анаэростатах с использованием газпаков фирмы «bioMerieux» (обеспечивающих атмосферу, содержащую 10% С02) при 37С в течение 24 часов, окончательный - через 48 часов (Рис. 46). Полученные данные учитывали по изменению окраски среды в лунках: положительный результат — желтое окрашивание, отрицательный — фиолетовое (Рис. 4в). Для определения микроорганизмов экспериментальные биохимические профили сравнивали с идентификационной картой, входящей в комплект АНАЭРОтест 23 или компьютерной базой данных «bioMerieux» (при постановке теста на API-20A и API-50CHL) (Рис. 4г).
Молекулярно - генетическое типирование производственных штаммов
В качестве исходного материала для генетического анализа служили микробные суспензии бифидобактерий в фосфатном буфере, рН 7,2-7,4, имеющие концентрацию микробных клеток 2,4x10"4 моль/л, что соответствует Standart 5 по Мс Farland Standart фирмы «bioMerieux» (оптическая плотность 1,25 при длине волны 550 нм.)
Подготовку проб проводили следующим образом. Ампулу с культурой вскрывали асептически и высевали методом десятикратных разведений на ряд пробирок с питательной полужидкой БС-средой для бифидобактерий и МРС для лактобацилл. Посевы инкубировали при 37С в течение 18-24 часов. После морфологического и микроскопического контроля также методом десятикратных разведений проводили повторный пересев культуры (2-ая генерация), а затем третий пересев культуры (3-я генерация). Культура 3-ей генерации в экспоненциальной фазе роста после морфологического и микроскопического контроля служила материалом для проведения генетического анализа. Для удаления питательной среды микробные культуры центрифугировали при 3000 об/минуту и отмывали забуференным физиологическим раствором. Эту процедуру проводили трижды, после чего с помощью оптического стандарта мутности доводили до нужной концентрации, разливали в стерильные пробирки и замораживали для хранения и транспортировки при температуре — 20 С.
Выделение ДНК, постановку ПЦР, клонирование ПЦР-продуктов и секвенирование проводилось сотрудниками ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН и Института биохимии им. А.Н.Баха РАН согласно Договора о научном сотрудничестве.
Видовая идентификация пробиотических штаммов в поликомпонентной ассоциации
Конструирование производственно-перспективных рецептур пробиотических средств подразумевает наличие определенных свойств у
Критерии оценки биосовместимости Видовая подлинность Межвидовой синергизм Сохранность отобранных штаммов по пробиотических пробиотических морфологическим, штаммов внутри штаммов в биохимическим, молекулярно- поликомпонентной комбинации с генетическим признакам, ассоциации в процессе пребиотиками антибиотикорезистентносги, кулыпвирования и микроэлементами, антагонистическим и храпения витаминами и культуральным свойствам антиоксидантами
Эффективность и безопас ;ность при взаимодействии пробиотических штаммов с индигенной микрофлорой человека Рисунок 5. Принцип биосовместимости как основа рецептуростроения поликомпонентных пробиотиков. отобранных для промышленного использования штаммов бифидобактерий и лактобацилл. К этим свойствам относятся: антагонистическая активность к широкому спектру патогенных микроорганизмов, антибиотикорезистентность, адгезивность, устойчивость к желудочному соку, желчи и др., а также высокая скорость роста и активность накопления биомассы и органических кислот. Следующей задачей после отбора штаммов, по технологическим и пробиотическим свойствам отвечающих необходимым требованиям, является определение возможности их использования в виде поликомпонентных ассоциаций, симбиоза пробиотических штаммов, создающий их синергидный эффект и тем самым при приеме человеком обеспечивающих эффективное и быстрое устранение микроэкологических и клинических нарушений, возникших вследствие дисбиоза.
В целях производственного использования из ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского были отобраны 11 штаммов бифидобактерий и 6 штаммов лактобацилл (Глава 2, Табл. 11), по которым имелись данные свидетельствующие об их высокой технологичности в процессе лабораторного и промышленного культивирования и отдаленные результаты по безопасному и эффективному клиническому применению. Для дальнейшей всесторонней оценки биосовместимости консорциумов бифидо и лактобактерий, а также с целью отработки методов контроля подлинности используемых в серийном производстве пробиотических штаммов изучали морфологические, физиолого-биохимические, культуральные и антагонистические свойства отобранных микроорганизмов. Кроме того, определяли спектр чувствительности данных штаммов к 32 антибиотикам, относящимся к 16 группам антибактериальных препаратов, а также оценивали их безвредность по общепринятой методике на лабораторных животных (Глава 2).
Исследование антибиотикорезистентности позволило не только дополнить картину свойств, стандартизирующих типированные производственные культуры, но и послужило предпосылкой к проведению дополнительных клинических испытаний и последующему возможному расширению спектра лечебного применения поликомпонентных пробиотических препаратов (Глава 7 раздел 1 настоящей работы). В качестве дополнительного метода видовой идентификации использовали молекулярно-генетический. Видовое определение проводили посредством секвенирования двух локусов генома: 16S рДНК и гена трансальдолазы — по ранее разработанному методу [11].
