Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время остро стоит проблема истощения запасов ископаемого углеводородного сырья. В связи с этим все больший интерес вызывает использование альтернативных источников сырья и энергии. Лигноцеллюлозная биомасса представляет собой наиболее распространенное, легкодоступное и возобновляемое сырье на нашей планете для получения разнообразных полезных продуктов. Целлюлозосодержащие отходы накапливаются в больших количествах в лесоперерабатывающей, целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях. Превращение полисахаридов в сахара протекает под действием комплекса ферментов карбогидраз и является одной из наиболее важных стадий в технологической цепочке биоконверсии растительного сырья.
Получаемые сахара могут быть превращены с помощью микроорганизмов в спирты (моторное топливо), амино- и органические кислоты, которые в дальнейшем могут быть трансформированы в разнообразные полезные продукты, включая полимерные материалы, продукты для фармацевтической промышленности, пищевые и кормовые добавки.
В настоящее время деградация растительной биомассы осуществляется под действием целлюлазных и гемицеллюлазных ферментных комплексов. Целлюлазы включают в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и (3-глюкозидазы; гемицеллюлазы представлены в основном ксиланазами, (3-ксилозидазами, арабинофуранозидазами и некоторыми другими ферментами. Эффективность деструкции растительной биомассы зависит от сбалансированности состава целлюлазных и гемицеллюлазных комплексов. Ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями. Наибольшее распространение на мировом рынке получили секретируемые ферментные комплексы грибов рода Trichoderma. Однако, недостаток (3-глюкозидазы в этом комплексе приводит к ингибированию целлобиогидролаз продуктом реакциии - целлобиозой и, как следствие, ведет к снижению выходов продуктов реакции. Грибы рода Penicillium продуцируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава. Компоненты целлюлолитического комплекса, продуцируемого Penicillium, превосходят по своим свойствам компоненты комплекса Trichoderma и эффективнее расщепляют целлюлозосодержащую биомассу. В связи с этим, важным, на наш взгляд, является дальнейшее увеличение осахаривающей способности ферментного комплекса Рenicillium.
Цели и задачи исследования. В диссертационной работе были поставлены следующие цели и задачи:
- Получить целлюлазные комплексы с увеличенной осахаривающей
способностью на основе рекомбинантных штаммов P.verruculosum с
использованием гистоновой системы экспрессии.
- Создать экспрессионную систему на основе гистонового промотора Н4.1
P.verruculosum.
Провести трансформацию штамма-реципиента Р.verruculosum AniaD и выявить рекомбинантные штаммы (трансформанты), продуцирующие ферментные комплексы с увеличенной осахаривающей способностью.
Получить ферментные препараты на основе выбранных рекомбинантных штаммов и исследовать их биохимические свойства.
Исследовать осахаривающую способность новых ферментных препаратов по отношению к различным видам предобработанных растительных субстратов.
Научная новизна работы. Впервые была клонирована полинуклеотидная последовательность, соответствующая промоторной области гена гистона Н4.1 низшего гриба Р.verruculosum 221-151. На основе вектора pUC-LIC были впервые созданы плазмидные конструкции, включающие в себя состыкованные полинуклеотидные последовательности гистонового промотора и генов целевых белков - (3-глюкозидазы Aspergillus niger (bgll), эндо-1,4-|3-ксиланазы А (ксиланаза A) P.canescens (xylA) и эндо-1,4-|3-глюканазы II (ЭГП) P.verruculosum (eglll). Используя методы плазмидной трансформации на базе штамма-реципиента P.verruculosum 537, были получены новые штаммы-продуценты, секретирующие мультиферментные комплексы, обладающие активностью гетерологичных Р-глюкозидазы A.niger и ксиланазы A P.canescens, а также с увеличенной активностью гомологичной ЭГП P.verruculosum. На основе лучших продуцентов были получены и проанализированы ферментные препараты. Показано, что уровень привнесенного целевого белка составил от 5 до 13 % от общего содержания белка в препарате, при этом состав собственного комплекс целлюлолитических ферментов штамма-реципиента P.verruculosum 221-151 остался практически на базовом уровне.
Таким образом, впервые была создана экспрессионная система на основе конститутивного гистонового промотора Н4.1 P.verruculosum, позволяющая получать ферментные препараты с заданным содержанием целевого белка.
Практическая значимость работы. Получены и исследованы новые ферментные препараты (Гист4-Р-ГЛ-3, Гист4-КсилА-3 и Гист4-ЭГП-1) с увеличенной осахаривающей способностью по отношению к биотехнологически важным растительным субстратам, что позволяет использовать их в дальнейшем в технологической цепочке биоконверсии растительного сырья на стадии гидролиза полисахаридов клеточной стенки, избегая традиционную трудоемкую стадию смешивания индивидуальных ферментных препаратов. На примере гидролиза различных видов непищевого растительного сырья, таких как измельченная осиновая древесина, измельченная и обессмоленная сосновая древесина и измельченная багасса, показано, что выход продуктов под действием новых ферментных препаратов существенно увеличивался по сравнению с исходным ферментным препаратом Р.verruculosum 221-151 (на 14-30%).
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); на международной конференции «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2006); на VI Международной конференции по возобновляемым ресурсам и биоперерабатывающим заводам
(Германия, 2010); на V и VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010 и 2011), а также, на международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация построена по традиционной схеме и состоит из введения, обзора литературы (4 главы), отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 154 ссылки. Работа изложена на 155 страницах, содержит 49 рисунков и 23 таблицы.
