Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Общая характеристика и структурно-функциональная организация хроматина дрожжей Saccharomyces cerevisiae 8
1.2. Регуляция активности хроматина Saccharomyces cerevisiae 23
1.3. Биологическая активность ядерных белков-регуляторов 32
1.4. Получение ядерных негистоновых белков дрожжей 35
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Материалы исследования 38
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Метод получения НПК 43
2.2.2. Метод фракционирования НПК при микрофильтрации 43
2.2.3. Вискозиметрия 47
2.2.4. Метод определения белка по Лоури '. 48
2.2.5. Орциновый метод определения РНК 48
2.2.6. Гель-хроматография 51
2.2.7. Ферментативный гидролиз 53
2.2.8. Бумажная хроматография 53
2.2.9. Метод гель-электрофореза 54
2.2.10. Ионообменная хроматография 55
2.2.11. Приготовление буферных растворов 56
2.2.12. Комплексообразование 56
2.2.13. Реакция торможения миграции лейкоцитов 56
2.2.14. Определение антистрессорной активности НПК 58
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Разработка метода выделения НПК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae 61
3.3.1. Выбор экстрагента и термодинамических условий экстракции...61
3.3.2. Фракционирование экстракта мембранной микрофильтрацией...71
3.3.3. Осаждение НПК 78
3.2. Исследование компонентного состава НПК дрожжей 80
3.2.1. Изучение углеводного состава НПК 80
3.2.2. Исследование белковых компонентов НПК 82
3.2.3. Гель-хроматография НПК 85
3.3. Изучение особенностей организации НПК дрожжей 93
3.3.1. Фракционирование НПК на ионитах 93
3.3.2. Исследование взаимодействия нуклеиновых кислот с
белками по спектральным характеристикам 99
3.4. Исследование биологической активности НПК дрожжей 101
3.4.1. Исследование антистрессорного действия НПК 101
3.4.2. Изучение митогенной ативности НПК 106
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Общая характеристика и структурно-функциональная организация хроматина дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- Материалы исследования
- Разработка метода выделения НПК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Введение к работе
Актуальность проблемы. Традиционно применяемые в медицине биологически активные вещества (белки, ферменты, антибиотики и витамины) очень часто входят в состав лекарственных препаратов только в виде высо-коочищенных индивидуальных веществ. Однако, хорошо известно, что такие БАВ нестабильны и нуждаются в защите как от ферментативного гидролиза в физиологических условиях организма, так и от внешних неблагоприятных воздействий, разрушающих препараты при хранении.
Задача сохранения биологической активности в последнее время становиться особенно актуальной при получении и использовании в качестве лечебных и профилактических препаратов различного рода биорегуляторов белковой природы, таких как ядерные низкомолекулярные белки и пептиды. Биорегуляторной функцией обладают негистоновые белки хроматина (НГБ), унивесальные для всех эукариотических организмов. Эти белки контролируют и поддерживают на необходимом уровне процессы пролифера-;ни и дифференцировки в клетке. К ним относятся кейлоны (Мм 21-46 кДа), цитокины (Мм 10-27 кДа) и низкомолекулярные пептиды цитомедины (Мм 2-10 кДа). К настоящему времени наиболее изученными являются цитомедины и среди них негормональные и гормоноподобные факторы тимуса, обладающие имуномодулирующей активностью, и миелопептиды, выделенные ;із костного мозга. Остальные регуляторные белки изучены мало, а их использование затруднено вследствие высокой нестабильности. Например, использовать келоны, как регуляторы пролиферации на практике оказалось невозможным, так как сразу после введения они почти полностью разрушались s кровяном русле ферментативными системами организма.
В тоже время, хорошо известно, что для доставки в клетки не менее лабильного наследуемого материала в генной инженерии и генотерапии используют комплексы нуклеиновых кислот с полимерами-носителями раз-
личного характера, в том числе с белками. Комплексообразование с носителями обеспечивает стабилизацию их структуры и защищает препараты от действия эндогенных нуклеаз. Следует отметить, что нуклеиновые кислоты сами по себе являются естественными полиэлектролитами-носителями белков хроматина. Поэтому, выделение таких естественных комплексов нуклеиновых кислот с биорегуляторами белковой природы, позволяет не только сократить потери на стадиях выделения и очистки, но и расширяет спектр использования ядерных белков для различных медико-биологических целей, в том числе для тонкой коррекции стрессовых состояний организма или отдельных его функций.
С другой стороны, до последнего времени в качестве сырья для получения препаратов белков-биорегуляторов использовали органы и ткани крупного рогатого скота. Поиск и расширение сырьевых источников для получения новых препаратов является актуальной задачей биотехнологии. Изучение микроорганизмов, в частности дрожжей, в качестве источника для получения регуляторных пептидов и их комплексов с природными носителями представляется перспективным направлением, так как промышленная технология их выращивания хорошо освоена и легко масштабируется.
Цель данной работы состояла в получении комплексов нуклеиновых кислот с ядерными белками (НІЖ) из клеток пекарских дрожжей Saccharo-myces cerevisiae, исследовании их компонентного состава и биологической активности. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: Во-первых, техническая задача разработки и оптимизации метода выделения нуклеопротеиновых комплексов дрожжей. Во-вторых, проблема фракционирования, определения компонентного состава и биологической активности комплексов нуклеиновых кислот с ядерными белками, препарата с высокой вязкостью и фазовой неустойчивостью.
Научная новизна работы. До начала настоящей работы дрожжевую биомассу традиционно использовали как сырье для получения белково-витаминных концентратов и для выделения нуклеиновых кислот и АТФ. В представляемой работе впервые был разработан и оптимизирован метод выделения нуклеопротеиновых комплексов (НПК) дрожжей, включающий стадию фракционирования и концентрирования НПК по молекулярной массе путем микрофильтрации на трек-мембранных модулях.
Впервые методами гель-хроматографии, вискозиметрии, электрофорезом в ПААГ, ионообменой хроматографией полученный препарат НПК дрожжей охарактеризован в отношении компонентного состава и молекулярных масс белка и нуклеиновых кислот. Доказана устойчивость высокомолекулярной фракции НПК (I) по отношению к ферментативному "расщеплению РНК-азой.
Впервые с помощью ионообменной хроматографии при различных соотношениях белок : нуклеиновая кислота изучена прочность связывания этих компонентов в комплексе и рассчитаны константы диссоциации НПК (I); показано, что связывание белка с нуклеиновой кислотой носит кооперативный характер.
Впервые исследована биологическая активность НПК (I) по отношению к культуре дрожжей, подверженных действию УФ-облучения или перекиси водорода; показано, что НПК (I) усиливает размножение клеток, угнетенное действием мутагенных факторов.
Впервые исследована митогенная активность НПК (I) и его компонентов. Показано, что высокоочищенный белок проявляет низкую митогенную активность, тогда как в комплексе с РНК его активность значительно увеличивается.
Практическая ценность работы. Полученные результаты по выделению и характеристике НПК дрожжей увеличивают спектр возможных сырьевых источников для получения биорегуляторов и позволяют сделать технологию их получения более простой и экономичной. Кроме того, НПК могут быть использованы для разработки новых пищевых биологически активных добавок и лечебных препаратов, в том числе пролонгированного действия, перспективных для восстановления жизненно важных функций организма, ослабленных токсическими или радиационными воздействиями.
1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА ДРОЖЖЕЙ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae - одна из самых популярных и хорошо изученных биотехнологических культур. Область использования дрожжей простирается от традиционных технологий пивоварения, хлебопечения и виноделия до генетической инженерии. В настоящее время известно более 300 видов дрожжей.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются типичным представителем сумчатых грибов класса Ascomycetes. Размножаются почкованием, но имеют и половой процесс развития. Мицелия не образуют. Клетки дрожжей обычно сферической или круглой формы с диаметром от 7 до 10 мкм. Имеют оформленное ядро с диаметром около 2 мкм (Блинов Н.П. 1984). Ядро окружено двухслойной ядерной оболочкой, соединенной с одной стороны с сетью эндоплазматического ретикулума, а с другой - с белками ядерного мат-рикса. Ядерноя оболочка защищает и предохраняет ДНК от внешних неблагоприятных воздействий. Связь между ДНК и цитоплазмой клетки осуществляется через ядерные мембраные белки - порины, через которые способны проникать молекулы РНК, регуляторные белки и гормоны стероидной природы. Число молекул ДНК (хромосом), приходящееся на одну клетку является важным токсономическим признаком организма. В интервале между двумя последующими делениями клетки не имеют четко выраженных хромосом. В этот период ДНК расплетена. Ядро заполняет гетерохроматин -комплекс ДНК, РНК и ядерных белков (van Holde К.Е, 1989) (Табл. 1).
Таблица 1
Соотношение компонентов хроматина эукариот, находящихся в Gi фазе клеточного цикла (van Holde К.Е, 1989)
У всех эукариотических организмов выделяют два крупных класса белков хроматина: белки основной природы - гистоны и негистоновые белки хроматина (НГБ). К НГБ хроматина относятся кислые, основные белки и нейтральные пептиды, называемые факторами (van Holde К.Е, 1989). Гистоны являются основными структурообразующими белками хроматина, на которые наматывается нить ДНК (Нуклеиновые кислоты, 1966). В то же время, обширный класс негистоновых белков включает различные белки, как структурные (белки крепления хромосом к ядерной мембране и матриксу), так и регуляторные (белки, активирующие удвоение ДНК и транскрипцию, а также ферменты, участвующие в этих процессах) (Структура и генетическое значение..., 1985). Гистоны и негистоновые белки хроматина регулируют клеточный цикл на всех этапах - от деления до завершения существования клетки и утилизации ее соседними молодыми клетками популяции (Гиней-тис А., 1988; Куций М.П.и др., 1999;: - Fraser A. and Jemes С, 1998; Ink В. et al., 1997; Modeo F. et al., 1999).
Содержание и характеристика нуклеиновых кислот дрожжей
Saccharomyces cerevisiae
С физико-химической точки зрения нуклеиновые кислоты (НК) представляют собой линейные полиэлектролиты, состоящие из мономеров-мононуклеотидов, которые включают азотистое основание (пуриновое или пиримидиновое), пентозу и остаток фосфорной кислоты. ДНК составляют дезоксирибоза и азотистые основания аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т). в состав РНК входят рибоза и те же основания за исключением тимина, который заменен урацилом (У). Перечисленные азотистые основания относятся к главному ряду. Характерной особенностью дрожжей является отсутствие минорных оснований (6-метиладенина, 1-метилгуанина, 5-метилцитозина, 5-оксиметилцитозина), встречающихся в следовых количествах у высших эукариот в тРНК и рРНК (van Holde К.Е., 1989; Нуклеиновые кислоты..., 1957).
Количество нуклеотидов четырех типов, входящих в состав ДНК, мо
жет охарактеризовать видовую принадлежность организма. Доказано,
что соотношение (А+Т)/(Г+Ц) представляет собой показатель специфично
сти ДНК. и может быть использовано при установлении положения, зани
маемого организмом в общей классификации микроорганизмов. Так для S.
cerevisiae величина (А+Т)/(Г+Ц) соответствует 1,80 - 1,79 (Нуклеиновые ки
слоты, 1962).
При исследовании РНК было показано, что отношение суммарного количества пуриновых оснований к пиримидиновым также обнаруживает значительное постоянство. Эта величина дополнительно характеризует нуклео-тидный состав микроорганизмов. Для дрожжей она в среднем колеблется в интервале 1,00 - 1,07 (Нуклеиновые кислоты, 1962). Первичная, вторичная и третичная структуры РНК и ДНК одинаковы для всех эукариотических организмов (Зенгер В., 1987).
К настоящему моменту геном «S. cerevisiae полностью установлен, имеются генетическая и физическая карты дрожжей (Вгоаск J.R et al., 1991). Основные характеристики дрожжевого генома приведены в таблица 2.
Таблица 2 Основные характеристики генома дрожжей S. cerevisiae (Вгоаск J.R et al., 1991)
Показано, что кроме ядерной и митохондриальной ДНК в .состав клеток дрожжей входят так называемые экстрахромосомальные элементы: двухмикронная ДНК и двойная РНК.
Показано также, что при компактизации хроматина, предшествующей клеточному делению, в ядре S. cerevisiae образуется 16 хромосом различного размера. Характеристика дрожжевых хромосом приведена в таблице 3.
Таблица З Размер хромосом S. cerevisiae (Broack J.R et al., 1991)
Процессы хранения информации и синтеза белка разобщены в пространстве и во времени. Транскрипция протекает в клеточном ядре при построении комплементарной цепи матричной РНК к развернутой цепи ДНК (Нуклеиновые кислоты..., 1957). РНК-предшественник далее отделяется от ДНК и подвергается процессингу, в результате которого вырезаются неинформативные участки РНК, образуется функциональная молекула мРНК, ко-
торая переносится в цитоплазму через поры ядерной мембраны в виде рибонуклеинового комплекса с белками. Трансляция протекает с участием мРНК и тРНК в цитоплазме на рибосомах. Здесь последовательность нуклеотидов переводится в линейную последовательность аминокислот полипептидной цепи белка. В этом случае изменение уровня РНК может использоваться как показатель биосинтетической активности клетки.
Впервые связь между содержанием НК и обменом веществ в дрожжевой популяции была установлена M.Orur et al. Ими было показано, что содержание ДНК зависит только от числа клеток в популяции. Количество ДНК в клетке микроорганизмов постоянно за исключением периода, предшествующего клеточному делению, когда происходит репликация ДНК (Нуклеиновые кислоты, 1962).
Впоследствии J.Fleischmann and D.H.Howard (Fleishmann J. and Howard D.H., 1988) изучая диплоидные клетки дрожжей, определили содержание ДНК приходящееся на единичную клетку в популяции дрожжей. Рассчитанная величина составила 35-40 фтгДНК на клетку. Содержание ДНК в ядре дрожжей на три порядка ниже содержания ДНК у высших эукариот, что связано с низким содержанием повторяющихся последовательностей (у дрожжей их 4). Это повторы генов рибосомальной РНК, составляющие 100 копий в хромосоме XII; повторы дельта-последовательностей - 100 копий в различных хромосомах; повторы may- и сигма-последовательностей - 100 копий; все остальные повторы, в том числе группы сателитной ДНК в концевых (теломерных) участках хромосом (Ларионов В.Л., 1986).
В то же время, количество РНК зависит от физиологического состояния и функций клеток. Причем максимум концентрации РНК наблюдается в тех популяциях, которые находятся в состоянии интенсивного деления и энергично синтезируют белок. Изучение лаг-фазы у неспоровых микроорганизмов или фазы прорастания спор у споровых видов дало возможность изучить динамику накопления РНК, предшествующую клеточному делению.
Характерно, что в период лаг-фазы синтез НК преобладает над синтезом белка, как было отмечено для всех микроорганизмов (Нуклеиновые кислоты, 1962).
Изучение логарифмической фазы вели с использованием синхронных культур. Здесь проявляется прямая корреляция между содержанием РНК, скоростного роста и белкового синтеза. Синтез РНК и белка происходит при этом более или менее параллельно, постепенно замедляясь. При этом происходит уменьшение концентрации РНК в процессе роста культуры в течение логарифмической фазы роста при переходе в стационарную фазу.
В популяциях, находящихся в стационарной фазе, скорость белкового синтеза имеет точное соответствие с количеством РНК, находящимся в избытке по отношению к тому постоянному количеству, которое всегда присутствует в клетке. Установлено, что для S. cerevisiae в стационарной фазе роста соотношение РНК/ДНК составляет 13 (для Е. coli - 2) (Vendlely R., 1946).
Белки хроматина Гистоны
Основными белковыми компонентами хроматина, ответственными за компактизацию ДНК в клеточном ядре, являются гистоны. При изучении компонентного состава хроматина различных представителей эукариот было показано, что в среднем, на одну единицу массы ДНК приходится 0,99 гистонов, тогда как негистоновые хромосомальные белки составляют 0,58 единицы, а РНК - 0,06 (van Holde К.Е., 1989). Гистоны представляют собой основные белки небольшой молекулярной массы (11300 - 21500 Да). Содержание до 30 моль% аргинина и лизина определяет положение изоэлектрической точки в интервале рН 10-11 (Структура и генетическое значение..., 1985). Во всех эукариотических организмах выделяют пять классов гистонов - Н2А, Н2В, НЗ, Н4 и НІ. Однако при более детальном
изучении каждую фракцию можно разделить на несколько субфракций, общее число которых может быть выше 20. Это так называемые минорные фракции или гистоноподобные белки. Любой из вариантов гистона Н2В обеспечивает все стадии жизненного цикла дрожжей, хотя отличается на четыре аминокислотных остатка в N-концевой части молекулы.
У низших эукариот обнаружены белки, соответствующие типичным гистонам (Нуклеиновые кислоты, 1966). Хотя в общем случае внутри каждой таксономической группы (водоросли, грибы, простейшие) можно выделить три типа организмов (или ядер) (Rizzo R.J., 1976):
не имеющие гистонов или содержащие белки, мало напоминающие гистоны;
содержащие фракции, напоминающие отдельные фракции гистонов;
содержащие фракции, соответсвующие типичным фракциям гистонов.
Было показано, что хроматин аскомицетов содержит четыре или пять типичных гистонов (под вопросом остается присутствие гистона HI), незначительно отличающихся от гистонов высших эукариот по величине положительного заряда и молекулярной массе (Нуклеиновые кислоты, 1966). Анализ аминокислотных последовательностей показал, что у гистонов НЗ и Н4 около 7% аминокислотных остатков не соответствует гистонам растений и животных, а у гистонов Н2А и Н2В около 20% (Табл. 4).
Таблица 4 Характеристика гистонов S. cerevisiae (van Holde К.Е., 1989)
Первичные структуры отдельных гистонов S. cerevisiae: 1. Гистон Н4
Гистон Н4 является самым самым мелким (Мм - 11282 Да, 102 аминокислотных остатка). Для него характерно высокое содержание аргинина и глу-тамина. Исследования показали, что основные аминокислоты преимущественно локализованы в N-концевой части молекулы, а гидрофобные - в области С-конца. N-концевая область является местом непосредственного взаимодействия гистона с ДНК, где отрицательно заряженные группы ДНК образуют ионные связи с положительно заряженными группами гистона Н4 (Структура и генетическое значение..., 1985). Центральные и С-концевые участки молекулы способны к формированию собственной вторичной и пространственной структуры и, поэтому, участвуют во взаимодействиях с другими белковыми компонентами хроматина (Восток К., 1981).
2. ГистонНЗ
Гистон НЗ имеет молекулярную массу 15324 Да и содержит 135 аминокислотных остатков. Суммарное распределение основных остатков в гистоне НЗ не отличается от распределения их в гистоне Н4. Они сконцентрированы преимущественно в N-концевой области молекулы, которая взаимодействует с ДНК. С-конец гистона содержит высокий процент неполярных аминокислот, что способствует формированию глобулярной структуры (Восток К. и др., 1981).
З.ГистоныН2АиН2В
Гистоны Н2А и Н2В вариабельнее гистонов Н4 и НЗ. Число аминокислотных остатков в молекуле гистона Н2А может колебаться от 121 до 148, а в гистоне Н2В - от 129 до 155 (Структура и генетическое значение..., 1985). Основные аминокислоты сконцентрированы главным образом в близи N-конца, а гидрофобные аминокислоты на С-конце (Восток К. и др., 198]). Оба варианта гистонов Н2А и Н2В являются устойчивыми и важными в течение всего клеточного цикла дрожжей. Хотя их роль до сих пор остается неопределенной.
Негистоновые белки хроматина
Как известно, кроме гистонов в клеточном ядре, как в свободном так и в ассоциированном с хроматином состоянии, находится большое количество негистоновых белков хроматина (НГБ). Этот класс белков чрезвычайно ге-терогенен по молекулярной массе, физико-химическим свойствам и прочности связывания с хроматином (Нуклеиновые кислоты, 1966). В целом количество НГБ достигает 500, но основную массу составляют 15-20 белков (Восток К. и др, 1981). Большинство из них присутствует в ядре в относительно малых количествах (приблизительно от 500 до 2000 копий белка на
одну молекулу ДНК в гаплоидном ядре). Этим, по-видимому, и определяется низкий концентрационный порог действия НГ регуляторных белков.
Существует множество классификаций НГБ хроматина. Большая их часть основана на методах выделения НГБ, в некоторых отражено строение белков, в других - функции НГБ. Имеются и смешанные классификации (Босток К. и др, 1981). Самой рациональной из представленных является классификация на основе функций или возможных функций известных НГБ, хотя и она не исключает принадлеяшостъ одного и того же белка разным группам (van Holde К.Е., 1989; Структура и генетическое значение..., 1985). Особенно это касается некоторых регуляторных белков (HMG, убикитин), регуляторные и структурные функции которых тесно связаны.
В соответствии с классификацией выделяют следующие группы НГБ хроматина:
1. Белки-регуляторы экспрессии и репликации ДНК. В настоящее время кроме кофакторов РНК-полимеразы II известно несколько отдельных регуляторных белков и группа близкородственных белков. Среди индивидуальных белков изучен универсальный регулятор - убикитин. Он состоит из 7 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 8500 Да (22а; Lorenz М. et al., 1999; Koch C.S. and Nathmyth K., 1994; Кейлоны..., 1980). В клетке синтезируется чаще всего в виде цепей из нескольких последовательно связанных молекул. Обнаруживается в связи с гистоном Н2А и является частью системы убикитин-зависимого протеолиза. Группы регуляторных белков представлены белками класса HMG (HMG1/2, HMG 14/17)(Lorenz М. et al., 1999), парами циклин-циклин-зависимые киназы, осуществляющими регуляцию клеточного цикла на стадии образования веретена деления и появления дочерней почки (Koch C.S. and Nathmyth К., 1994). Недостаточно изученной, но обнаруженной повсеместно в тканях и органах, является группа регуля-
торных белкой кейлонов. Кейлоны по химической структуре близки к протеогликанам и выполняют функцию регуляции пролиферации (Кейлоны..., 1980).
Белки, взаимодействующие с гормон-рецепторным комплексом.
Ферменты. У всех эукариот в составе хроматина обнаружены ферменты, среди корорых выделяют два класса (van Holde К.Е., 1989):
ферменты, связанные с синтезом и метаболизмом нуклеиновых кислот (полимеразы ДНК, полимеразы РНК, нуклеазы, лигазы нук-леотидов, терминальные нуклеотидилтрансферазы, метилтрансфера-зы);
ферменты метаболизма белков хроматина (протеазы, фос-фотрансферазы (киназы), метилтрансферазы, ацетилтрансферазы, деацетилазы, М-аденилаттрансферазы).
4. Структурные НГБ, участвующие в организации отдельных участков
хроматина. К ним относят белки двухслойной ядерной оболочки
(ламинины), белки поровых комплексов ядерной оболочки (нуклео-
порины). Белки остаточных ядрышек и белки внутриядерной фиб
риллярно-гранулярной сети. Кроме того, из нуклеоплазмы выделе
ны сократительные белки - актин, трополизин, тубулин, ДНК-
релаксирующие ферменты скелетные белки хромосом (белки
Скэффолда) (Karp G., 1979).
Все перечисленные белки имеют различные физико-химические характеристики и различаются по прочности связи с ДНК (Кучеренко Н.Е. и др., 1983; Geneitis А.А. et al., 1984).
Структурно-функциональная организация хроматина Минимальная нуклеосома
Основным белковым компонентом хроматина, ответственным за ком-пактизацию ДНК в клеточном ядре, являются гистоны. При физиологических условиях среды гистоны Н2А, Н2В, НЗ, Н4 склонны агрегировать друг с другом и образуют стабильную глобулу октамера (по две молекулы каждого гистона) - нуклеосому - белковый кор, на который накручивается двойная спираль ДНК (van Holde К.Е., 1989). Белковый кор с накрученной на него двойной спиралью ДНК представляет собой первичный уровень организации хроматина и называется минимальной нуклеосомой. Несколько минимальных нуклеосом, объединенных общей нитью ДНК, образуют олигонук-леосому. В составе олигонуклеосомы участок ДНК, взаимодействующий с гистоновым кором, называется компактной ДНК. Показано, что этот участок не чувствителен к ДНК-азе и не обладает транскрипционной активностью. В то же время участок линкерной (развернутой) ДНК, находящийся между двумя нуклеосомами, не имеет жесткой третичной структуры, чувствителен к ДНК-азе и используется для транскрипции (Гавин И.М., 1992). Усредненная длина нити ДНК, исчисляемая в парах оснований (п.о.) и приходящаяся на один нуклеотид, определяется как нуклеосомный повтор. Для эукариоти-ческих организмов величина нуклеосомного повтора колеблется от 160 до 250 п.о. (Бавыкин С.Г., 1992). Различные ткани одного и того же организма могут обнаруживать различную величину нуклеосомного повтора, которая коррелирует с характером дифференцировки клеток, а не с уровнем их про-лиферативной активности (Иванов Г.С., 1996). В таблице 5 приведены значения величин нуклеосомного повтора и длины линкерной части ДНК для хроматина различных клеток эукариот.
Таблица 5 Характеристика организации минимальной нуклеосомы различных эукариотических клеток (Иванов Г.С., 1996)
Способность к разворачиванию коровой ДНК лежит в основе конфор-мационной лабильности хроматинов и необходима для активного функционирования клетки. Частичное разворачивание коровой ДНК является особенностью транскрипционно активных хроматинов. К наиболее транскрипционно активным принадлежат хроматины мозговой ткани и дрожжевой хроматин, а к наименее активным - «спящий» компактизованный хроматин половых клеток.
В умеренно активных и неактивных хроматинах такого разворачивания коровой ДНК не происходит. Было показано, что часть линкерной ДНК оказывается дополнительно накрученной на белковый кор нуклеосомы и зафиксированной гистонами группы HI, которые отсутствуют в активных хроматинах (в том числе у дрожжей) (Рамм Е.И. и др., 1993). При сравнении хроматинов различных типов было отмечено, что с уменьшением транскрипционной активности клеток увеличивается длина линкерной части ДНК (Табл. 5). Выдвинуто предположение, что длинная линкерная ДНК хрома-
тинов необходима для более высокой степени упаковки нуклеосом в хрома-тиновой фибрилле транскрипционно неактивных хроматинов (Воробьев В.И., 1986).
Для дрожжей величина нуклеосомного повтора составляет 148 п.о. (Lohr D. and van Holde K.E., 1979). Кроме того показано, что в логарифмической фазе роста S. cerevisiae транскрибируется, по крайней мере, 40% генома, и большая часть хроматина доступна для действия ДНК-азы. Откуда следует, что существенная часть хроматина дрожжей представляет собой транскрипционно активную ДНК.
1.2. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ХРОМАТИНА SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Частичное разворачивание компактной ДНК является необходимым условием транскрипции. В этом случае ослабление силы взаимодействия между ДНК и гистонами может быть достигнуто различными способами.
Во-первых, изменение силы взаимодействия ДНК-гистоны наблюдается при перераспределении зарядов в молекуле ДНК. Например, в результате ее взаимодействия с противоионами Na, Mg, мультивалентными катионами, мочевиной или регуляторными белками группы НГБ хроматина. Мочевина и величина ионной силы раствора оказывают существенное влияние на кон-формацию хроматина интерфазной клетки. Исследования хроматина in vitro свидетельствуют, что при изменении ионной силы раствора в хроматине происходят изменения, которые могут быть рассмотрены в качестве модели процессов компактизации-декомпактизации in vitro (Иванов Г.С., 1996). Так при низкой ионной силе растворов NaCl (0-10 мМ) наблюдается частичное разворачивание минимальных нуклеосом без потери гистонов. Среднее значение ионной силы (10-60 мМ) не влияют на стабильность нуклеосомного кора. Лишь при повышении ионной силы до 700-800 мМ NaCl наблюдается диссоциация октамера гистонов. А превышение 800 мМ NaCl приводит к декомпактизации нуклеосомного кора с последующей ступенчатой декомпактизацией гистонового октамера (Хроматин и нуклеосомы..., 1988). Сочетание мочевины и ионной силы растворов NaCl приводит к сходным результатам: 5-6 М мочевина раскручивает нуклеосомный кор, но не влияет на распределение ДНК-гистоновых взаимодействий (Хроматин и нуклеосомы..., 1988). Вторичная структура гистонов начинает разрушаться от 5 М и выше концентрации мочевины (Заец В.Н., 1989).
Кроме действия мочевины и ионной силы раствора NaCl- имеются данные о конденсации ДНК мультивалентными катионами - поли^минами
спермидином , спермином , катионными полипептидами, как полилизин; двухвалентными и трехвалентными ионами металлов - Co(NH3)63+ и Mg2+ (Bloomfield V.A., 1997; Misra V.K. and Draper D.E., 1998; He S.et al., 2000).
Ключевую роль в организации и поддержании структуры хроматина на этапе транскрипции и репликации ДНК играют негистоновые белки хроматина группы HMG (Okuhara К. et al., 1999; Sumoy L. et al., 2000). Они непосредственно взаимодействуют с ДНК, меняя ее конформацию, и тем самым разрушают ДНК-гистоновые связи. Среди HMG-белков выделяют группы специфически и неспецифически взаимодействующие с ДНК (Sullier S. et al., 1999). Известно, что специфически взаимодействуют с ДНК белки группы HMG14/17. К ним относят Т160-белок высших эукариот и его дрожжевой гомолог Cdc 68, так называемые расплетающие белки (unwinding factors) (Okuhara К. et al, 1999). К неспецифическим белкам относят HMG1/2, NHP 6А белок S. cerevisiae, также принимающие участие в организации и функционировании хроматина (Allain F.H. et al, 1999; Tang L. et al., 2000).
HMG белки контролируют только пролиферацию, их уровень падает во время клеточной дифференцировки (Okuhara К. et al., 1999).
Следует отметить, что подобным же образом поддерживается активность митохондриальной ДНК с участием специфических митохондриаль-ных белков HMG-Abf2p (Zelenaya-Troitskaya О. et al., 1998).
Во-вторых, уменьшение взаимодействия ДНК с гистонами наблюдается при изменении плотности зарядов на поверхности гистонов, что достигается двумя путями: 1) при их химической модификации (фосфорилирова-нии, метилировании, ацетилировании) и 2) при взаимодействии гистонов с регуляторными НГБ хроматина (убикитиноподобные белки, убикитин) (van Holde К.Е., 1989; Бавыкин СТ., 1992; Иванов Г.С., 1996; Бакаев В.В., 1983).
Экспериментальные исследования показывают, что активно транскрибируемые области хроматина содержат модифицированные гистоны (Гавин И.М., 1992; Бавыкин С.Г., 1992 ; Заец В.Н., 1989). Постсинтетическое ацети-
лирование, фосфорилирование и метилирование гистонов происходят в определенное время клеточного цикла и носят обратимый характер (van Holde К.Е., 1989; Храпулов Н.С. и др., 1987). В культуре клеток тканей высших эу-кариот, как и у дрожжей, гистоны ацетилируются вскоре после стимуляции деления клеток (Восток К. и др., 1981; Wang А.Н. et al., 1999). Наибольший уровень фосфорилирования гистонов HI и НЗ наблюдается во время митоза. Полагают, что фосфорилирование, как и ацетилирование выполняют функцию конденсации гетерохроматина перед митозом (Восток К. и др., 1981). Модифицированное метилирование выявлено для гистонов НЗ и Н4. Хотя биосинтетический смысл метилирования остается не совсем ясным, предполагают, что его возрастание в Ог-фазе свидетельствует о процессе конденсации хромосом (van Holde К.Е., 1989).
Другой характерной особенностью транскрипционно активного хроматина, в том числе дрожжевого, является повышенное содержание белка убикитина, ковалентно связанного с гистоном Н2А (Бавыкин С.Г., 1992; Воробьев В.И., 1986). Такой комплекс получил название белок А24. Убикитин отщепляется от гистонов во время митоза и конъюгирует снова при репликации хроматина. Кроме того, хорошо известно, что убикитин обеспечивает быстрое расщепление связанных с ним белков на протеосомах (убикитин-зависимый протеолиз). Эта протеолитическая система является частью механизма регуляции клеточного цикла посредством активации убикитин-зависимого протеолиза многих факторов активации транскрипции, таких как циклины и транскрипционный фактор Мус. Убикитин, присоединяясь к факторам активации транскрипции стимулирует их расщепление специфической протеазой и таким образом снижает транскрипционную активность хроматина.
Система убикитин-зависимого протеолиза включает в себя четыре крупных мультиферментных комплекса - El, Е2, ЕЗ, убикитин протеазу - и называется протеосомой (Tanaka К., 1998; Hochstrasser М. et al., 1999). В це-
лом протеосома содержит более 40 субъединиц с молекулярной массой от 20 до 110 кДа. Первый компонент комплекса - Е1, состоит из ферментов, активирующих субстрат для присоединения к нему убикитина (Shintani Т. et al., 1999). El тесно связан со вторым компонентом системы Е2 - ферментами конъюгации (ubiquitin-conjugating enzyme), который переносит убикитин на активированную поверхность субстрата (Mathias N. et al., 1998). Изучены два составляющих Е2-мультиферментного комплекса. Ими у S. cerevisiae являются белки Cdc 34р (Mathias N. et al., 1998), UEV (Hofmann R.M. and Pickart СМ., 1999) и Urml (Furukawa K. et al., 2000). Присоединение убикитина к субстрату катализируется убикитин-лигазным коплексом ЕЗ (ubiquitin-protein ligase), называемом также SCF-комплексом. Показано, что в его состав входят, по крайней мере, четыре белковых субъединицы: Skpl, Cu/A, Rocl (Rbxl или Hit) и F-box-белки (Harvey K.F. and Kumar S., 1999; Beaude-non S.L. et al., 1999 ;Craig K.L. and Tyers M., 1999; Yu Z.K. et al., 1998; Patton E.E. et al., 1998; Cenciarelli C. et al., 1999). Детальное изучение молекулярных основ перехода клеток из Gj в S фазупозволило выявить специфическую разновидность убикитин-лигазного комплекса ЕЗ - АРС (anaphax promoting complex). Этот комплекс ферментов осуществляет протеолиз митотических циклинов и инактивацию циклин-зависимого киназ-циклинового комплекса (Zachariae W. et al., 1998; Jaspersen S.L. et al., 1998). АРС состоит из 10 субъединиц, в то время как для дрожжей определены только пять - АРС 10 (33 кДа), Cut4, Cut9, Nuc2 и Непі (Grossberger R. et al., 1999; Yamashita Y.M. et al, 1999). Полагают, что функционирование двух убикитин-лигаз SCF и АРС играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла эукариот (Toda Т. et al., 1999).
У всех эукариот, в том числе у S. cerevisiae, убикитин является долго-живущим белком и постоянно рециркулирует в протеосомах и плазме в качестве протеолитического интермедиатора (Swaminathan S. et al., 1999). Его высвобождение контролируется деубикитинизирующей системой - специ-
фической убикитин-протеазой. Выделено два варианта этого фермента -USP3-белок высших эукариот и его гомолог у дрожжей Doa4 (Swaminathan S. et al., 1999; Sloper Mould K.E. et al., 1999).
Местом расположения протеолитической системы является протоплазма, и неизвестно, существует ли она в ядре клетки. Однако обнаружено, что есть некоторая взаимосвязь между убикитин-зависимым протеолизом и процессами споруляции, мутагенеза и репарации ДНК (Baarends W.M., Ноо-gerbrugge J.M. et al., 1999). В частности, убикитин-конъюгирующий коплекс Е2 принимает участие в пострепликационной репарации ДНК и обеспечивает защиту ДНК от внешних повреждений в различных денатурирующих условиях (Broomfield S. et al., 1998; Thomson T.M. et al., 1998; Yashiroda H. et al., 1998).
Кроме убикитина в клетке имеется группа убикитиноподобных белков (ubiquitin-like proteins) (Кауе F.J. et al., 2000; Suzuki Т. et al., 1999; Iwanejko L. et al., 1999; Haggren W., 1998). Среди них изучен человеческий белок SUMO-1 и его дрожжевой аналог Smt Зр, регулирующие переход клеток из Gi в фазу митоза посредством контроля размера теломеров и процесса сегрегации хромосом (Broomfield S. et al., 1998; Tanaka К. et al., 1999). Показано, что, в отличие от убикитина убикитиноподобные белки являются более важными для посттранскрипционной модификации структурных ядерных белков (таких как септины Cdc3, Cdcll, Sep7) (Johnson E.S. and Biobel G., 1999), хотя также принимают участие в убикитин-зависимом протеолизе (Schwarz S.E. et al., 1998; Мао Y. et al., 2000).
Другим необходимым составляющим общей системы регуляции клеточного цикла являются пары циклинов и циклин-зависимых киназ (cyclin, cyclin-dependent kinase). Молекулярные механизмы контроля клеточного цикла циклинами для дрожжей S. cerevisiae изучены и известны (Chen К.С. et al., 2000; Инге-Вечтомов И.Г., Карпова Т.С, 1993). Выделено два класса дрожжевых циклинов. К первому относятся Gi циклины (CLN-1-3), регули-
рующие переход G!—>S фаз. Второй класс включает S- фазовые циклины (CLB-1-6), контролирующие переход S—>Gz- Оба. класса циклинов экспрес-сируются в поздней Gi, ранней S фазе и поздней S, ранней G2 фазах соответственно (Dynlacht B.D, 1997). Транскрипционный контроль клеточного цикла, осуществляемый парами циклины-циклинзависимые протеинкиназы основан на фосфорилировании некоторых факторов активации транскрипции генов, кодирующих структурные белки (Bitter G.A. et al., 2000). Таким образом, пары циклины-циклинзависимые киназы координируют такие важные события в жизни клетки, как формирование веретена деления, деление ядра, образование почки и ее отделение от материнской клетки (Chen К.С. et al., 2000; Ahn S.H. et al, 1999; Nurse P., 1999; Loeb J.D. et al, 1999).
Известно также, что сами гены циклинов CLN активируются сложным белком SBF, состоящим из двух субъединиц - swi4 и swi6, a CLB5 и 6 активируются MBF - другим гетеродимером, состоящим из swi6 и МВР (Mcintosh Е.М, 1993; Mechanisms, that helps..., 1993; Koch С. et al, 1996).
Включение регуляторных циклин-циклинзависимых протеинкиназных пар в общую систему клеточного гомеостаза определяется контролем их концентрации посредством убикитин-зависимого протеолиза (Bastians Н. et al, 1999).
Все вышеперечисленные механизмы регуляции активности хроматина являются частью сложной многокомпонентной системы ответа клетки на внешние сигналы. Этими сигналами могут быть действие гормонов (у высших эукариот), половые феромоны, углеродное голодание, тепловой шок и другие факторы стресса (у низших эукариот) (Трахт Н.И. и др., 1982; Liao Н.Н. and Thorher J, 1981; Lord P.L. and Wheals A.E, 1981). Для высших эукариот определено два механизма регуляции обмена веществ под действием гормонов и других внеклеточных регуляторов. Один из них общий для всех эукариот- мембранно-внутриклеточный . Кроме того имеется дополнительный цитозольный механизм. Цитозольный механизм характерен только для
гормонов высших эукариот, имеющих липофильную природу. Поэтому стероидные гормоны способны проникать через мембрану в клетку, где вступают в комплекс с цитозольными рецепторами, а затем переносятся в ядро и стимулируют транскрипцию ДНК (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1990).
Мембранно-внутриклеточный механизм регуляции обмена веществ характерен для веществ, не проникающих через клеточную мембрану, и опосредован действием вторичных медиаторов (мессинжеров) - циклических нуклеотидов цАМФ, цГМФ и ионов Са2+ (Кучеренко Н.Е. и др., 1983; Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1990). Известно например, что действие таких тканевых регуляторов деления клетки как кейлоны и интерферон опосредовано действием цАМФ (Кейлоны..., 1980; Романов Ю.А. и др., 1984), в то время
9+
как действие фитогемагглютининов и факторов роста нервов - цГМФ и Са (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1990). В данной регуляторной системе гормоны (или любые другие внеклеточные регуляторы, в качестве которых может выступать углерод-содержащий субстрат) связываются с рецепторами на поверхности клетки и активируют аденилат(гуанилат)-циклазу. Образовавшиеся вторичные мессинжеры осуществляют свое действие через соответствующие протеинкиназы, а протеинкиназы на последующих этапах регулируют уровни фосфорилирования белков хроматина или активируют другие системы модификации этих белков (как было описано выше). Таким образом регулируется матричная активность хроматина.
Мембранно-внутриклеточный механизм регуляции метаболизма веществ высококонсервативен для всех эукариотических организмов,хотя в него включаются как универсальные белки, так и специфические для отдельных организмов.Так цАМФ и цАМФ-зависимые протеинкиназы S. cerevisiae играют центральнцю роль в контроле метаболизма питания, клеточного цикла и транскршщии(Огіггїоеп G. et al., 2000).Показано,что активация цАМФ и цАМФ-зависимых протеинкиназ наблюдается в ответ на голодание, вызванное сменой источника углерода или азота (Pan X. and Heitman J., 1999;
de Groot E. et al., 2000) и при ассимиляции гликогена (Beeser А.К. and Cooper T.G., 2000). цАМФ-зависимые киназы принимают участие в адаптационных процессах при тепловом и осмотическом шоке (Zahringer Н. et al., 2000; Norbeck J. and Blomberg A., 2000).
Для дрожжей обнаружена и цГМФ-зависимая система передачи внешних сигналов, также обеспечивающая транскрипцию ДНК (Eckstein Н. and Flugge В., 1999; Yuasa К. et al., 1999; Yuasa К. et al., 2000).
Кроме циклических нуклеотидов у S. cerevisiae выделены кальций-связывающий белок кальмодулин и Са2+/кальмодулин-зависимые протеинкиназы (Nakamura Т. et al., 1984; Londesborough J. and Nuutinen M, 1987). Показано, что по своему аминокислотному составу и молекулярной структуре кальмодулин дрожжей отличается от других эукариот, но его регуляторная функция консервативна и подобна функциям кальмодулинов высших эукариот (Ohya Y. et al., 1987).
Однако основной из обнаруженных функций Са2+-сигнальной системы дрожжей является ответ на действие внеклеточных половых феромонов (ос-факторов), останавливающих клетки в G\ фазе и стимулирующих удвоение ДНК (Nakajima-Shimada J. et al., 2000). Половой феромон взаимодействует со специфическими рецепторами на поверхности клетки (а и а-фактор рецепторы), представляющие собой белковые молекулы (STE25 (Feng Y. and Davis N.G., 2000; Dube P. et al., 2000) и запускает каскад ферментативных реакций МАРК (mitogen activated protein kinase signaling pathway), контролирующих половой процесс и образование веретена деления (Olson К.A. et al., 2000; Choi Y.J. et al., 2000; Atienza J.M. et al., 2000).
Видовая и тканевая специфичность регуляторных белков хроматина
НГБ хроматина являются, по-видимому, основными регуляторами генетической активности клетки (Klug А., 1995). Ими осуществляется контроль процессов транскрипции, трансляции и дифференцировки. Анализ имеющихся литературных данных показывает, что механизмы, лежащие в основе регуляции, строго консервативны и едины для всех эукариотических организмов (Baarends W.M., Roest Н.Р. et al.,1999; Dimova D. et al., 1999; Василенко A.M., Захарова Л.A., 2000; Петров P.B. и др., 1999). Кроме того известно, что транскрипция, трансляция, процессинг в клетке в значительной степени перекрываются, и что в них на разных стадиях вовлекаются одни и те же белки. Действует единая согласованная регуляция клеточного метаболизма (Ladomery М., 1997; Kodadek Т., 1998).
С одной стороны, к регуляторам относятся низкомолекулярные белки и пептиды, имеющие сходную структуру для всех организмов и тканей - это убикитин, белки группы HMG и циклины (Bitter G.A. et al, 2000) а также некоторые низкомолекулярные факторы активации транскрипции (Laudry J. et al., 2000). С другой стороны, белковые регуляторы с более высокой молекулярной массой, универсальные для всех эукариот, имеют небольшие различия по аминокислотной последовательности в различных тканях, то есть обладают тканевой специфичностью (например, различные протеинкиназы, кейлоны) (Кейлоны..., 1980; Cytrynska М. et al., 1999; Gross A. et al., 1999).
Однако до сих пор остается под сомнением взаимосвязь между весом регуляторных белков и проявляемой ими тканевой специфичностью. Не до конца изучен компонентный состав многих мультиферментных комплексов и особенности их взаимодействия in vivo.
1.3 БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ
В текущей литературе имеются крайне ограниченные сведения о применении ядерных белков-регуляторов для коррекции патологических состояний макроорганизма. Исключение составляют лишь довольно хорошо изученные, иммунорегуляторные пептиды тимуса. Тимус давно привлекает внимание исследователей, являсь одним из центральных органов иммунной системы (Blazsek I. and Gaol D., 1978), регулирующим созревание (развитие) Т-лимфоцитов. За последнее время из тимуса выделено и охарактеризовано несколько групп пептидных факторов (Patt L.W. et al., 1981; Pardenne M. et al., 1987; Goldstein G., 1987). Из них наиболее подробно изучены тимозины аь а4, 04 (осі «3,1 кДа, р4 - 4,96 кДа), тимопоэтин (4,96 кДа), тимулин (857 Да) и тимусный гуморальный фактор у2 (Хавинсон В.Х., Жуков В.В., 1992). Эти пептиды в норме в низких концентрациях всегда присутствуют в кровяном русле, но не являются гормональными веществами. Показано, что тимо-зин Зь тимулин и тимопоэтин имеют общие структурные мотивы (сходные аминокислотные последовательности) с убикитином, а гомеостатический тимусный гормон - с гистонами Н2А и Н2В (Хавинсон В.Х., Жуков В.В., 1992)..
Пептиды тимуса видонеспецифичны и обнаружены у всех высших эу-кариот (Pardenne М. et al., 1987; Хавинсон В.Х., Жуков В.В., 1992; Goodall GJ. Horecker B.L., 1987). Однако, их объединяет строгая тканевая специфичность, выражающаяся в том, что пептиды такого рода действуют прежде всего на дифференцировку и функциональную активность Т- и В-лимфоцитов (Хавинсон В.Х., Морозов В. Г. и др., 1983; Хавинсон В.Х., Морозов В. Г., 1989; Audhya Т. et al., 1984; Zatz J.Oliver, et al., 1984). Это свойство было использовано для создания иммуномодулирующих лекарственных препаратов на основе как природных, так и синтетических тимусных
пептидов (тимоген) (Хавинсон В.Х., Кожемякин А.Л. и др., 1990; Яковлев Г.М. и др., 1991). Молекулярный механизм действия этих препаратов на клеточные структуры (мембраны, ядро) пока не изучен. Предполагают, что существует некоторое подобие активации хроматина регуляторними пептида-миЕормонами или гормоноподобными веществами. Так известно, что регуляция метаболизма пептидами тимуса обусловлена их взаимодействием с селективными мембранными рецепторами клеток (Кузник Б.И. и др., 1995) и опосредована парами цАМФ(цГМФ)-цАМФ(цГМФ)-зависимые киназы (Морозов В.Ф. и др., 1982; Кожемякин А.Л. и др., 1984).
Параллельно были исследованы миелопептиды костного мозга, также обладающие широким спектром иммунорегуляторного действия (Василенко A.M., Захарова Л.А., 2000). Четыре миелопептида, состоящие из пяти аминокислотных остатков и различающиеся только по одной аминокислоте, осуществляют различные процессы: стимулируют пролиферацию стволовых клеток костного мозга, влияют на дифференцировку Т-лимфоцитов, усиливают фагоцитарную активность макрофагов, обладают противовирусной и противоопухолевой активностью (Петров Р.В. и др., 1999).
Подобные регуляторные пептиды были выделены из различных тканей и органов (Трофимова СВ., Хавинсон В.Х., 1999; Хавинсон В.Х., 1992).
Не менее перспективны исследования биологической активности пептидного экстракта эпифиза, выполненные теми же авторами. Применение эпиталамина увеличивало среднюю продолжительность жизни и восстанавливало репродуктивную функцию старых крыс. Важно, что наряду с увеличением продолжительности жизни наблюдается уменьшение частоты развития опухолей (Анисимов В.Н., 2000; Хавинсон В.Х., Прокопенко Н.П. и др., 1989; Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., 1993). Механизмы действия эпитала-яина не известны, но предполагают, что он принимает участие в угнетении процессов свободнорадикального окисления в организме и предупреждает
не только гормонально зависимых новообразований, но также индуцируемых радиацией и химическими канцерогенами (Анисимов В.Н., 2000).
В то же время имеются литературные данные по биологической активности дрожжевой ДНК и РНК с низкой степенью очистки от белковых примесей. Показано, что препараты дрожжевой РНК обладают иммуномодули-рующим действием, стимулируют метаболизм и посредством цАМФ нормализуют многие биохимические реакции, участвуют в процессах детоксика-ции, стимулируют репарацию, рост и размножение клеток (Земсков В.М. и др., 1985). Кроме того, введение препаратов неочищенной РНК пожилым пациентам улучшало мозговые процессы, в том числе память (Cameron Ewen D. et al., 1963). Некоторыми исследователями отмечается терапевтическое действие препаратов дрожжевой ДНК и РНК при лучевой болезни. Установлено, что введение мышам дрожжевого экстракта внутрибрюшинно непосредственно перед облучением и на 1 и 2 сутки после, повышает выживаемость животных на 27-68%. Причем, выживаемость животных находится в прямой зависимости от молекулярной массы вводимых препаратов РНК и ДНК дрожжей (Федорова Т.А. и др., 1974; Detre К. and Finch S., 1958).
Все приведенные выше данные свидетельствуют о том, что нуклеиновые кислоты могут с успехом использоваться как естественные переносчики ядерных белков-регуляторов в клетки, подверженные различным неблагоприятным внешним воздействиям. Кроме того, тканеспецифическое действие препаратов НК с низкой степенью очистки от белков (Витвицкий В.Н. и др., 2000) и тот факт, что ядерные белки-регуляторы действительно находятся в довольно прочном комплексе с НК, облегчают процесс получения таких биологически активных препаратов.
1.4 ПОЛУЧЕНИЕ ЯДЕРНЫХ НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ ДРОЖЖЕЙ
Существует несколько методов выделения КГБ хроматина из клеток грибов и дрожжей, включающих как непосредственное получение нуклео-протеинового компонента из целых клеток, так и более тонкое его получение из выделенных ядер микроорганизмов (Структура и генетическое значение..., 1985; Восток К., Саммор Э., 1981; Кучеренко Н.Е. и др., 1983; Geneitis А.А. et al., 1984; Guthrie С. and Fink G., 1991). Характерной особенностью процесса выделения НК и ядерных белков из дрожжей является проблема разрушения прочных клеточных стенок. Для этого обычно применяются методы механической дезинтеграции (Hopkins T.R. , 1991) и ферментативной обработки (Guthrie С. and Fink G., 1991). Следует отметить, что введение дополнительного количества ферментативных препаратов усложняет процедуру выделения хроматина и затрудняет точную характеристику компонентного состава полученных препаратов (Basha S.Y. and Paladively P., 1995). Использование органических (в том числе фенола и солей гуанидина) соединений в процессе получения НК и нуклеопротеинового комплекса также создает сложности при дальнейшей очистке целевых компонентов от фенола и гуанидина и при определении биологической активности образцов in vivo (Muller F.M. et al., 1998). Хорошие результаты получены при сочетании методов механического разрушения клеток и солевой экстракции (Basha S.Y. and Paladively P., 1995; Muller F.M. et al., 1998; Akada R. et al., 2000). С другой стороны, мягкая солевая экстракция часто сопровождается выделением дополнительного количества свободных и связанных с ДНК внутриядерных белков (van Holde К.Е., 1989). Поэтому, очень важным моментом остается оптимальный выбор условий получения НГБ, в том числе способов отделения их от гистонов. Описано несколько методов выделения НГБ хроматина, основанных на предварительной дегистонизации (Структура и генетическое
значение..., 1985; Кучеренко Н.Е. и др., 1983). Самой доступной является обработка хроматина 0,35 М раствором NaCl в интервале рН 10,5-11,8 (иногда с дополнительным введением детергентов - SOS и мочевины), которая обеспечивает диссоциацию гистонового октамера. Дальнейшее осаждение НСЮ4, ТХУ или любой другой кислотой позволяет получить группу НТВ с высокой (HMG) или низкой (LMG) электрофоретической подвижностью (Кучеренко Н.Е. и др., 1983; Хроматин и нуклеосомы..., 1988). На этом принципе основан быстрый и технологичный производственный способ получения дрожжевой ДНК и РНК (Земсков В.М. и др., 1985). Таким образом, дрожжевые НК получаются в виде нуклеопротеиновых комплексов с негис-тоновыми ядерными белками (Крылов И.А. и др., 1996; Барай В.Н. и др., 1995).
Представленный анализ литературных данных показывает, что большинство работ в области изучения ядерных белков-регуляторов направлено на исследование их функциональных свойств. В тоже время, выделение и характеристика белков осложняется их неустойчивостью по отношению к протеолитическим системам клетки. По той же причине недостаточно изученными остаются механизмы действия таких биорегуляторов, хотя в литературе имеются факты, свидетельствующие об их высокой эффективности.
Проведение исследований интерполимерных комплексов нуклеиновых кислот с белками, в частности их устойчивости к действию ферментов, открывает новые возможности для создания лечебных и профилактических препаратов на основе природных НПК. Первые препараты природных НПК были выделены из тканей и органов млекопитающих и прошли успешные испытания в медицинской практике (Кузник Б.И., 1995). Особое преимущество таких препаратов заключается в том, что они эффективны при перо-ральном применении. В этом случае особенно актуальной становиться задача расширения сырьевых иточников для получения НПК и их стандартизации, так как природные НПК не достаточно изучены. Поэтому, в данной
работе была поставлена задача получить и исследовать компонентный состав и биологическую активность НІЖ из клеток дрожжей Saccaromyces сег-evisiae. Промышленная технология культивирования дрожжей является традиционной для биотехнологии, хорошо освоена и легко масштабируется. Исследованные препараты НІЖ, выделенные из тканей и органов животных были недостаточно очищены от гистонов и их нельзя использовать для исследования иммуномодулирующей активности.
Кроме того, проблема получения биорегуляторов и их комплексов с полимерными носителями-НК недостаточно изучена в области биотехнологии, так как препараты высокомолекулярных ШС отличаются высокой вязкостью и фазовой неустойчивостью, что не позволяет применить к ним ряд часто используемых физико-химических методов анализа и фракционирования.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Нуклеопротеиновые комплексы (НПК) получали из клеток пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae промышленного производства. Компонентный состав и структуру полученных НПК исследовали физико-химическими методами. При определении биологической активности натив-ных НПК и НПК, расфракционированных на ионообменных смолах, дополнительно использовали модельные системы препаратов РНК и ядерного белка убикитина, а также комплекс РНК-убикитин, полученный на их основе.
2.1. Материалы Дрожжи S. cerevisiae
НПК получали из клеток пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae производства ОАО "Комбинат пищевых продуктов" (ГОСТ 171-81. Перед выделением НПК дрожжи суспендировали в дистиллированной воде и отмывали от низкомолекулярных примесей, остатков питательной среды и бактериальных клеток микрофильтрацией в режиме рециклинга. Объемное соотношение дрожжевой суспензии и дистиллированной воды для промывки варьировало от 1:10 до 1:20 в зависимости от исходного микробного обсеменения культуры. Чистоту подготовленной дрожжевой суспензии контролировали по остаточным белкам промывной воды (значение оптической плотности не превышает 0,1-0,2 при длине волны 280 нм) и содержанию бактериальных клеток - не более 1-2 клеток в поле зрения при микроскопии суспензии (Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И., 1990).
Для определения биологической активности НПК использовали культуру дрожжей S. cerevisiae (штамм ВКМ У-379), имеющий порядковый номер 239 в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии.
Рибонуклеиновая кислота
В работе использовали дрожжевую РНК (Koch-Light), представляющую собой смешанную фракцию рибосомальных, матричных и транспортных РНК, полученных из клеток дрожжей методом щелочной экстракции с последующей депротеинизацией. Растворы РНК готовили в ОД М фосфатном буфере рН 8,2. Концентрацию РНК в растворе определяли по поглощению в УФ-области при длине волны 260 нм (Фердман Д.Л. , 1966) и орцино-вым методом.
Убикитин
Убикитин - универсальный ядерный регуляторный белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков с молекулярной массой 8500 Да. В клетке находится как в виде мономера, так и образует полимерные цепочки по Lis48 (Oxford dictionary of..., 1997). В работе использовали лиофилизированный препарат убикитина, полученного из эритроцитов быка (Sigma). Чистота -репарата - 90% по данным электрофореза в додецилсульфате натрия.
Растворы убикитина заданной концентрации готовили в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,2. Концентрацию убикитина определяли по методу Лоури.
Рибонуклеаза
Для энзиматического гидролиза РНК в работе использовали рибонуклеазу кристаллическую (РНК-азу), представляющую собой гидролазу альбуминового типа (Мосолов В.В. , 1971) из поджелудочной железы крупного рогатого скота, коммерческий препарат производства завода медицинских препаратов АО "Самсон" (Россия).
Митогены (лектины)
В реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в качестве веществ сравнения использовали препараты конконовалина А (КонА) и фито-гемагглютинина пшеницы (ФГА), производства Sigma. Белки КонА и ФГА относятся к классу лекгинов. Они агтлютинируют клетку, взаимодействуя с остатками Сахаров клеточных мембран (Sharon N. and Lis Н., 1972). КонА и ФГА являются митогенными лектинами, то есть индуцируют репликацию КК и размножение лимфоцитов (Concanavalin А..., 1976). Единицы мито-генной активности КонА и ФГА, использованных в работе составляли 500 мг/мл и 20 мг/мл соответственно.
Растворы КонА и ФГА для РТМЛ готовили, растворяя расчетные навески препаратов в изотоническом растворе NaCl (см. раздел 2.1.4.) до получения концентрации 10 мкг/мл.
Сефадекс
Для гель-хроматографии в работе использовали сефадекс марки G-100 superfine производства фирмы "Pharmacia" (Швеция). Номер в маркировке соответствует количеству воды (в мл), поглощаемому 10 г сухого геля.
Перед проведением экспериментов гель помещали в насыщенный раствор NaCl для набухания. После этого гель промывали рабочим раствором фосфатного буфера и заполняли им колонку (1,6 х 40 см), для установления равновесия колонку промывали 0,1 М фосфатным буфером рН 8,2.
Для проведения гель-хроматографии НІЖ в уксусной кислоте (буфер 15% уксусная кислота в физиологическом растворе NaCl) колонку (1,6 х 42 см) готовили сходным образом, предварительно промывая гель и уравновешивая колонку соответствующим буфером.
Карбоксильный катионит КМТ
Фракционирование НІЖ вели ионнообменной хроматографией на макропористом карбоксильном катионите КМТ. КМТ имеет высокопористую структуру, сочетающую макросетчатую и дисперсную пористость, обеспечивающую высокую степень набухания (Кузнецова Н.Н. и др., 1971). Предназначен для выделения больших органических ионов в технологии лекарственных препаратов, в том числе белковых молекул. КМТ является сополимером метакриловой кислоты и гексагидро-1, 3, 5-триакрилоилтриазина (Шатаева Л.К. и др., 1979):
?
СП,— CH,— С — N
/ \
сн,
Н-
— сн2—сн2—с—N ^— с,— сн2—сн2
сн2 а
сн2—с — соон
Размеры частиц КМТ находятся в широком диапазоне . Поэтому перед пользованием КМТ измельчали и проводили гидродинамическую отмывку „:> получения фракции со средним диаметром частиц 0,5....2,0 мм. Полученным сорбентом заполняли колонку (1,8 х 10 см) и уравновешивали ее пропусканием раствора ОД М НС1 и дистиллированной воды до рН 7,0. Регенерацию КМТ осуществляли в динамическом режиме путем последовательного пропускания через хроматографическую колонку 0,1 М раствора NaOH, -нстиллированной воды и 0,1 М раствора НС1. В процессе промывки контролировали значение рН и оптической плотности отобранных фракций в УФ-области спектра при длине волны 260 нм и 280 нм.
Анионит ВП-1Ап
Для отделения белковой фракции от НК использовали сильноосновной анионит ВП-1Ап. Анионит имеет широкий спектр микропор, но кроме этого значительный объем занимают макропоры и переходные поры. Четвертичный амин, входящий в структуру молекулы анионита, позволяет сорбировать органические ионы, имеющие в своем составе отрицательно заряженные группировки, в том числе кислые белки. ВП-1Ап имеет максимальную объемную емкость при рН 1,5-4,0 по сильноосновным группировкам 3,7 мг экв./г. Удельный объем набухания 3,5 мл/г (Ионообменные материалы..., 1983). Структурная формула:
-сн„—сн
' V
сн- — сн
Оъ СН
-сн,—сн
\
сн.
сн.
сн,
сн—сн,-
сн,— сн3
Сорбентом заполняли колонку (1,8 х 10 см) и промывали 0,1 N NaOH до достижения равновесия, а затем отмывали дистиллированной водой до рН 8,0-8,2.
Регенерацию сорбента ВП-1Ап вели аналогично регенерации КМТ (0,1 N растворами NaOH и НС1) в следующей последовательности: 0,1 N НС1, дистиллированная вода, 0,1 N NaOH, дистиллированная вода.
2.2. Методы исследования 2.2.1. Метод получения НПК
Разработку метода выделения НПК вели по аналогии с промышленным способом получения НК дрожжей, исключая стадию депротеинизации (Земсков В.М. и др., 1985). Кроме того, для сохранения биологической активности концентрированную соляную кислоту и щелочь заменяли уксусной кислотой и карбонатом натрия соответственно. ш
НПК выделяли из клеток пекарских дрожжей S. cerevisiae. Клетки дрожжей разрушали трехкратным замораживанием при температуре -18С с последующим быстрым оттаиванием до комнатной температуры. Экстракцию целевых компонентов проводили 1% раствором карбоната натрия при интенсивном перемешивании и прогревании до (80±1)С в течение 20 минут и дальнейшей суточной выдержкой на холоду. Соотношение суспензия : содовый раствор равнялось 1 : 14 по объему. Экстракт отделяли центрифугированием и проводили концентрирование высокомолекулярных фракций микрофильтрацией на модулях ПФМ-800 на основе трековых мембран. Микрофильтрацию вели в режиме рециклинга до десятикратного концентрирования по объему. Скорость прокачивания экстракта через модуль составляла 3,0 л/час. Полученный концентрат подкисляли 30%уксусной кислотой до рН 4,5 и выдерживали на холоду в течение 24 часов. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием и замораживали.
2.2.2. Метод фракционирования НПК при микрофильтрации
Особенности поведения растворов жесткоцепных биополимеров (полисахаридов, нуклеиновых кислот) в потоке и возможность их гидродинамической ориентации под действием сдвиговых усилий позволяют применять метод тангенциальной микрофильтрации для фракционирования растворов, содержащих смеси макромолекул различной молекулярной массы и формы (Шатаева Л.К., Ряднова И.Ю. Потехина Т.С. и др., І999). В работе использо-
вали метод микрофильтрации для очистки и концентрирования НПК на стадии получения содового экстракта, а также для снижения бактериального загрязнения дрожжевой суспензии при подготовке сырья к экстракции.
Фракционирование вели на микрофильтрационных модулях плоского типа марки ПФМ, производства ЗАО "Плазмофильтр" (Россия). Модули предназначены для отделения форменных элементов крови и получения плазмы как при донорском, так и лечебном плазмаферезе (Воинов В.А., 1999). Модули ПФМ изготовлены с использованием лавсановых трековых мембран в качестве фильтрующего материала. Суммарная площадь фильтрующей поверхности - 480 см2. Номинальный размер пор 0,3 мкм.. Конструкция и геометрические параметры модуля представлены на рисунке 1. Эффективная высота щели для прокачивания фильтруемого раствора составляет 100 мкм, а их суммарный объем в модуле не превышает 5 см . Схема установки для микрофильтрации приведена на рисунке 2.
~ Процесс фракционирования вели в режиме рециклинга, то есть с многократным прокачиванием фильтруемой жидкости (1) через модуль (2). При этом происходит ориентация высокомолекулярных жесткоцепных НК в потоке в камере концентрата и отделение низкомолекулярных примесей, которые с растворителем уходят в фильтрат (4). Высокомолекулярные НК их комплексы снова возвращаются в исходную емкость (1) и таким образом концентрируются. Объем фильтрата, поступившего в емкость (4) и степень концентрирования зависят от скорости прокачивания раствора через модуль и продолжительности рециркуляции. По окончании концентрирования отбирали пробы фильтрата и концентрата для определения вязкости.
Рисунок 1. Внешний вид и габаритные размеры модуля ПФМ. 1,2,3 - штуцера для подачи исходного раствора, выхода концентрата и выхода фильтрата (соответственно), 4 - камера концентрата; 5 - камера фильтрата, 6 -трековые мембраны, 7 - проклеивающий материал.
''' і'унок 2. Схема установки для микрофильтрации. 1 - исходная емкость, 2 -микрофильтрационный модуль ПФМ-800, 3,4 - мерные цилиндры, 5 - насос.
2.2.3. Вискозиметрия
Определение характеристической вязкости проводили для вычисления молекулярной массы НПК в содовом экстракте, а также фильтрате и концентрате, полученныхпослемикрофильтрации. Для расчета значений молекулярной массы компонентов использовали частную формулу уравнения Марка-Куна-Хаувинка для нуклеиновых кислот (Бреслер С.Е., 1966):
[г,]=1,05- 10'7М'-32 (1),
где М - молекулярная масса компонента, Да; [г|] - характеристическая вязкость, дл-г*1.
Определение относительной вязкости проводили методом последовательных разведений растворов, используя вискозиметр Оствальда с капилляром 0,73 мм при 20С. Измеряли время истечения термостатированных в течение 20 минут исследуемых растворов. При расчетах определяли удельную вязкость по формуле:
%д = Лотн - 1 (2),
где г|отн - относительная вязкость раствора. Приведенную вязкость вычисляли по формуле:
Чпривед С Wyj
где С - концентрация растворенного вещества мг/мл Экстрополяцией графика зависимости приведенной вязкости от концентрации вещества определяли характеристическую вязкость [г\]:
2.2.4. Метод определения белка по Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951) Раствор реактива Фолина разводили в 2 раза дистиллированной водой. В пробирку помещали 1 мл раствора белка (в контрольную пробирку - 1 мл фосфатного буфера), добавляли 0,5 N NaOH и 0,6 мл разведенного реактива Фолина. После перемешивания выдерживали 20 минут при комнатной температуре и измеряли поглощение при длине волны 670 нм относительно контроля.
Концентрацию белка в исследуемых растворах определяли по калибровочной кривой, построенной для стандартного а-химотрипсина (Рис.3).
2.2.5. Орциновый метод определения РНК
(Справочник биохимика..., 1991) Для определения РНК орциновым методом использовали 1% раствор орцина в воде (раствор А), концентрированную соляную кислоту (раствор Б) и 10% раствор РеСІз-бНгО в воде (раствор В). Непосредственно перед определением смешивали 10,0 мл раствора А, 40,0 мл раствора Би 1,0 мл раствора В. Добавляли 3,0 мл полученного раствора к 0,5 мл РНК-содержащего раствора и нагревали в кипящей водяной бане в течение 25 минут. Для предотвращения упаривания пробирку закрывали фольгой. Раствор охлаждали и определяли поглощение при длине волны 660 нм относительно контроля, содержащего 3,0 мл чистого реагента и 0,5 мл буферного раствора. Калибровочную кривую для определения концентрации РНК в исследуемых пробах строили по стандартному препарату дрожжевой РНК (Koch-Light) (Рис.4).
J670 нм
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Концентрация белка, мг/мл
1.0
нсунок 3. Калибровочная кривая для определения белка по методу Лбури. 570 - оптическая плотность раствора при длине волны Х-вЮ нм.
0.5
660 нм
0.4
0.3-:
0.2
0.1 -
/
/"
0.0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
Концентрация РНК, мг/мл
"1 0.5
Рисунок 4. Калибровочная кривая для определения РНК орциновым методом. Еббо- оптическая плотность раствора при длине волны 1=660 нм.
2.2.6. Гель-хроматография
Для гель-хроматографического анализа НГЖ использовали колонки с гелевым сорбентом, уравновешенные рабочим (фосфатным) буфером (Де-терман Г., 1970). Сбор фракций после нанесения проб на колонку осуществляли организовывали с помощью коллектора фракций LKB BROMHA 8300, UNIKORD II.
Концентрацию НК и белков в пробах контролировали аналитическими методами - измерение белка по Лоури и по оптической плотности при 280 нм, РНК - орциновым методом, суммарных НК - по оптической плотности при 260 нм.
Графики выходных кривых представляли относительно суммарного объема отобранных фракций - объема элюции:
\^=Уфр, мл
Молекулярные массы веществ оценивали по калибровочным прямым, построенным для каждой колонки. Для калибровки колонок использовали следующие препараты:
- человеческий гемоглобин, полученный из эритроцитов человека (Институт
переливания крови, Санкт-Петербург), С=10 мг/мл, молекулярная масса
65 кДа;
- декстран голубой, производства "Reanal" (Венгрия), С=5,0 мг/мл, молекулярная масса > 150 кДа;
- ос-химотрипсин, производства "Реахим" (Россия), С=10 мг/мл, молекуляр-
ная масса 24 кДа;
- инсулин, производства АО "Самсон" (Россия), С=10 мг/мл, молекулярная
масса 12 кДа;
- дезоксиуридин, производство "Serva" (Австрия), С=1,0 мг/мл, моле
кулярная масса 228,2 кДа
На рисунке 5 приведена калибровочная прямая для гель-хроматографической колонки с Сефадексом G-100.
Ve/Vo
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0 -I
1.5
2.0
3.0 4.0
Lg M
5.0
Рисунок 5. Калибровочная кривая для гель-хроматографической колонки. Сефадекс G-100. Lg М - десятичный логарифм молекулярной массы разделяемых компонентов, Ve/V0 - приведенный объем колонки.
2.2.7. Ферментативный гидролиз
Ферментативный гидролиз НІЖ проводили РНК-азой при соотношении фермент : субстрат 1 : 10 по сухому весу. Гидролиз вели при 37С в течение 4 часов в буферном растворе при рН 8,2. Для оценки глубины гидролиза смесь после гидролиза фракционировали на той же колонке с Сефадек-сом G-100, что и исходный препарат НІЖ. В НІЖ и его фракциях определяли содержание белка методом Лоури и РНК - орциновым методом.
2.2.8. Бумажная хроматография
Определение Сахаров, входящих в состав НІЖ вели методом бумажной хроматографии (Хроматография на бумаге..., 1962). Для высвобождения моносахаров из сложных органических молекул, в том числе полисахаридов, проводили предварительный кислотный гидролиз пробы НІЖ. Для этого к навеске исследуемого образца массой 20,0 мг добавляли 1 мл 2 N раствора серной кислоты. Смесь помещали в ампулу, ампулу запаивали и проводили гидролиз на кипящей водяной бане в течение 4 часов. Затем ампулу охлаждали, вскрывали и добавляли в нее 1 мл воды. Кислоту нейтрализовали добавлением непосредственно в ампулу порошка ВаСОз до рН 7,0 (по лакмусовой бумаге). После чего ампулы центрифугировали при 3000 об/мин 10 минут. Для исследования использовали надосадочную жидкость.
В качестве свидетелей использовали препараты ксилозы, маннана, глюкозы, рибозы и дезоксирибозы (производство фирмы "Sigma", Великобритания). Растворы свидетелей готовили, растворяя в воде расчетные навески препаратов до достижения концентрации 10 мг/мл.
Система растворителей для разгонки Сахаров содержала бутанол, воду, этанол, аммиак в соотношении 40 : 49 : 10 : 1. Систему смешивали в делительной воронке и отстаивали 24 часа. Отбирали верхний органический слой - водонасыщенный аммонийный бутанол. Растворитель помещали в емкость
для проведения хроматографии и выдерживали в течение суток до установления равновесия между жидкой и паровой фазами.
На бумагу марки Filtrak (FN-11) с помощью капилляра наносили смесь свидетелей и две дублирующие друг друга пробы исследуемого образца. Бумагу с нанесенными свидетелями и исследуемым препаратом высушивали и помещали в емкость для проведения хроматографии. После трехкратного пропускания системы растворителей бумагу высушивали на воздухе, опускали в проявитель и снова высушивали. После этого хроматограмму помещали на 2-3 минуты в сушильный шкаф при температуре 80-100С. Качественный состав анализируемого образца определяли, сравнивая величину пробега его пятна (пятен) с величинами пробега свидителей, проводя измерения от линии старта и имея ввиду, что в используемой системе растворителей величины пробега свидетелей по возрастающей распределены следующим образом: глюкоза, маннан, ксилоза, рибоза, дезоксирибоза.
2.2.9. Метод гель-электрофореза
Электрофорез НПК проводили в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ) (Gel electrophoresis of proteins..., 1981). Навеску препарата НПК в 3 мг растворяли в 3 мл 0,0125 М трис буфере при рН 6,8 в денатурирующих условиях: 4 М мочевина, 1% додецилсульфата натрия и 1% (3-меркаптоэтанола. Пробу наносили на гель (старт) в количестве 10-15 мкл. ПААГ готовили непосредственно перед проведением электрофореза при рН 8,8.
Фракционирование белков проводили в щелочном буфере при рН 8,3 и силе тока 20-30 мА в течение 5 часов. Окраску зон проводили раствором Кумасси Р-250 стандартным методом. В качестве свидетелей использовали набор белков фирмы "Serva" (Австрия) с разными молекулярными массами: каталазу (120 кДа), альбумин (67 кДа), миоглобин (17,8 кДа), цитохром с (12,3 кДа).
2.2.10. Ионообменная хроматография
Фракционирование НПК вели с использованием карбоксильного катионита КМТ и сильноосновного анионита ВП-1Ап (Остерман Л.А. , 1985). Сорбцию НПК проводили на Н-форме карбоксильного катионита КМТ. Колонку с сорбентом переводили в водородную форму слабым раствором соляной кислоты, затем отмывали водой до нейтральных значений рН.
Перед нанесением на колонку осадок НПК, полученный на стадии выделения, отмывали от низкомолекулярных примесей центрифугированием в 0,1 М ацетате натрия рН 7,0-7,2 при 3000 об/мин до оптической плотности промывного раствора 0,1-0,2 при 280 нм. Полученный таким образом осадок НПК растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды с добавлением 0,1 N NaOH (рН 11,0), а затем доводили до конечного объема физиологическим раствором (рН 8,5). В качестве элюента использовали 0,1 М фосфатный буфер рН 8.
Сильноосновной анионит ВП-1Ап использовали в ОН~~форме. Для этого колонку с сорбентом промывали слабым раствором NaOH и отмывали водой до нейтрального значения рН. Десорбцию проводили 5% уксусной кислотой. Отбор фракций организовывали с помощью коллектора фракций "Pharmacia" (FKAC-100). В пробах определяли: белки по методу Лоури, РНК - орциновым методом, сумму НК при длине волны 260 нм. Графики выходных кривых представляли в приведенных объемах элюции Vnp:
*пр— у \P)i
где Е^/фр - суммарный объем отобранных фракций, мл;
VKOn ~ объем КОЛОНКИ, МЛ.
2.2.11. Приготовление растворов буферов
Используемый в работе ОД М фосфатный буфер (рН 8,2; ионная сила 0,1) готовили следующим образом: расчетные навески солей для получения растворов с концентрациями Ы^НРО^ЯгО - 0,1 Ми NaH2P04-2H20 - ОДМ растворяли в дистиллированной воде. рН доводили до 8,2 добавлением 0,1 н NaOH или НС1, контролируя значение рН с помощью рН-метра. На протяжении работы, за исключением определения биологической активности исследуемых препаратов, в буфер добавляли Na3N до получения 0,02% раствора в качестве консерванта.
2.2.12. Комплексообразование
Комплексообразование РНК с убикитином проводили путем смешения растворов РНК и убикитина в фосфатном буфере рН 8,2, перемешивания и инкубации на холоду при температуре 4С в течение 18-20 часов.
2.2.13. Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ)
Митогенную активность НПК определяли в РТМЛ (Лабораторные методы..., 1987). Для этого венозную донорскую кровь (объемом 100 мкл) вносили в лунки планшета для иммунологических исследований и добавляли в каждую лунку по 20 мкл раствора конконовалина А в концентрации 10 мкг/мл или исследуемых препаратов в изотоническом растворе хлорида натрия. В контрольную лунку добавляли 20 мкл изотонического раствора хлорида натрия или буферного раствора при рН 7,3. Полученными разведениями заполняли стеклянные пятиканальные капилляры (фирмы Стибиум, Санкт-Петербург) на 2/3 высоты, закрывали пластилином и помещали в центрифужные пробирки. Центрифугирование проводили в течение 15 минут при 1000 об/мин, затем капилляры помещали в термостат на 24 часа при
После окончания инкубации под микроскопом с помощью окуляр-микрометра определяли расстояние миграции основной зоны лейкоцитов от границы осадка эритроцитов L и в контроле - L0s после чего рассчитывали индекс миграции
HM = L/L0 (6)
и активность вещества в реакции торможения миграции лейкоцитов
А=1-ИМ (7)
Поскольку при измерении реакции торможения использовали растворы, отличающиеся содержанием белка, то удельную активность препарата рассчитывали в условных единицах (УЕ) на мг белка
УЕ = А/Сб (8).
Из-за малой точности РТМЛ каждое измерение повторяли пятикратно и в расчете использовали усредненное значение ИМ. В таблице представлены результаты протокола измерения активности в РТМЛ стандартных препаратов: КонА, ФГА и УБ.
Таблица 6 Измерение активности митогенов в реакции торможения миграции лейкоцитов, при концентрации 0,01 мг/мл
Следует отметить, что контрольное значение Lo зависит от состояния иммунной системы донора. В данной работе использована кровь здоровых
людей, и в расчет принимали значения L, полученные только для той крови, где L0 превышало 10 мм.
2.2.14. Определение антистрессорной активности НПК
Антистрессорную способность дрожжевых НІЖ определяли по отношению к культуре S. cerevisiae с повреждениями НК, индуцированными действием УФ-лучей и перекиси водорода (Hollaender A. and Emmons С, 1941).
Повреждения НК, вызванные действием УФ-лучей.
УФ-лучи отличаются небольшой проникающей способностью, поэтому в работе ограничивались дрожжевой суспензией с концентрацией клеток в растворе, не превышающей 106 клеток/мл и использовали чашки Петри.
Приготовленную в изотоническом растворе NaCl суспензию клеток разливали по 4 мл в стерильные чашки Петри с ровным дном, диаметром 90 мм. Облучение проводили в затемненной комнате, расположив открытые чашки Петри с суспензией непосредственно под лампой БУВ-15. Клетки облучали в течение 2 минут при непрерывном перемешивании; доза облучения - 32,2 Дж/(м"-мин).
После облучения 0,5 мл суспензии разводили десятикратно жидкой средой Сабуро (4,0 мл) и добавляли 0,5 мл раствора исследуемого препарата (в опытные пробирки) и 0,5 мл раствора NaCl (в контрольную пробирку). В качестве контроля на жизнеспособность исходной культуры использовали необлученную суспензию S. cerevisiae. Культивирование проводили при температуре 24С в темной комнате для предотвращения фотореактивации (Ерохина Л.И., Алиханян СИ., 1956). Через определенные промежутки времени отбирали равные пробы и определяли концентрацию клеток и их морфологические особенности.
Повреждение НК под воздействием перекиси водорода (Методы селекции..., 1978).
В связи с разной чувствительностью штаммов к воздействию мутагена выбор концентрации Н202 и экспозиции осуществляли эмпирически, так чтобы при выбранных дозах Н2О2 выживаемость клеток была 25-30%. Таким образом, для проведения опыта выбрали в качестве действующей 0,1% концентрацию Н2О2 и время экспозиции - 30 минут.
Перекись водорода разводили стерильной дистиллированной водой и смешивали с суспензией клеток дрожжей до получения в растворе конечной концентрации 0,1%> Н202 и 106 клеток/мл и выдерживали при комнатной температуре. После этого по 0,5 мл клеток в перекиси водорода переносили . в отдельные пробирки и добавляли в каждую по 4,0 мл среды Сабуро, затем по 0,5 мл раствора исследуемого препарата в опытные пробирки и 0,5 мл стерильного раствора NaCl - в контрольную пробирку. В качестве контроля на жизнеспособность исходной культуры S. cerevisiae использовали суспензию клеток, не подверженных действию Н2С>2. Культивирование и отбор проб проводили аналогично опытам с УФ-облучением.
Определение концентрации клеток в суспензии и построение кривых
роста. Концентрацию клеток в растворе определяли стандартным способом, используя для подсчета камеру Горяева (Захаров И.А. и др., 1984).Расчет вели по формуле:
где п - число клеток в пяти больших квадратах камеры Горяева.
Кривые роста строили в координатах времени культивирования и IgN - натурального логарифма концентрации клеток в растворе. По кривым роста рассчитывали константу скорости роста, К:
где No и N - концентрация клеток в начале и в конце логарифмической фазы роста; t - время, за которое протекает логарифмическая фаза роста
Время генерации G вычисляли по формуле:
G=l/K (11).
Среды для культивирования S. cerevisiae, используемые в работе
(Семенов СМ., 1990). Сусло-агар. Готовили из солодового сусла, разводя его водопроводной водой до содержания сухих веществ 7% и добавляли 20 г/л агара.
Среда Сабуро. Для приготовления 1 л питательной среды растворяли 40 г глюкозы и 10 г пептона в 1000 мл дистиллированной воды. Полученный раствор процеживали, разливали по колбам и стерилизовали. Среды стерилизовали при 0,5 ати в течение 30 минут.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ НПК ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
В основу предложенного нами метода выделения НПК положен технологический прием, позволяющий в условиях мягкой водно-солевой экстракции сохранить структурные элементы хроматина, в которых эндогенные белки-регуляторы находятся в естественных комплексах с соответствующими участками нуклеиновых кислот.
3.1.1 Выбор экстрагента и термодинамических условий экстракции
Для экстракции НПК из клеток дрожжей, предварительно разрушенных трехкратным замораживанием-оттаиванием использовали слабоосновной буферный раствор - натриевую соль угольной кислоты, способствующее растворению нуклеопротеиновых компонентов хроматина (Беглов Д.Б., 1991). В тоже время, присутствие в конечном продукте гистонов, часто сопровождающих препараты НК и ядерных белков, не желательно, так как даже после выделения из состава хроматина они сохраняют выраженную биологическую активность. Так, при введении в макроорганизм гистоны оказывают токсическое действие на клеточные мембраны тимоцитов и проявляют коагулянтные свойства в кровяном русле (Абакунин Д.Б., Замулаева И.А., 1999). Поэтому, концентрацию карбоната натрия подбирали таким образом, чтобы в растворе создать условия для полной декомпактизации гистонового октамера и высвобождения молекул ДНК. Гистоны относятся к лабильносвя-занным белкам хроматина и для их диссоциации достаточным является превышение ионной силы 800 мМ раствора хлорида натрия (Хроматин и нук-леосомы..., 1988). Для экстракции выбрали концентрацию карбоната натрия равную 1 % по весу.
Как было отмечено ранее, взаимодействие гидрофильных НК с поли-амфолитами-белками является причиной образования плотно упакованных и плохо растворомьгх надмолекулярных структур хромосом. Однако, состояние плотной упаковки характерно лишь для этапа разделения наследуемого материала между дочерней и материнской клетками. На остальных этапах клеточного цикла происходит потеря жесткой структуры хроматина до полной гомогенизации ядерного материала. В таком состоянии ДНК максимально гидротирована и открыта для взаимодействия с белковыми факторами транскрипции и репликации.
В тоже время известно, что есть определенная связь между солевым микроокружением и конформационными переходами в НК (Manning G.S., 1978). Ионы металлов Mg (П), Са (И), Na (I), К (I), Li (I), Cs (I) содержатся в клетке в миллимолярных концентрациях и обычно существуют в виде комплексов с НК. Увеличение концентрации ионов ведет к компактизации (сворачиванию) НК в следствие взаимодействия ионов с наиболее гидротиро-ванными фосфатными группами НК (Hanlon S.et al., 1975). А при взаимодействии ионов металлов с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями НК происходит дестабилизация двойной спирали, разрушение водородных связей, сопровождающееся увеличением растворимости НК (Nucleic acid..., 1980).
В таблице 7 приведены результаты измерения растворимости препаратов НПК в солевых растворах различного состава. Видно, что ионы лития способствуют более полному переходу НК в раствор, в то время как катионы аммония снижают растворимость НПК.
Учитывая способность ионов металлов влиять на растворимость НК, представлялось интересным исследовать возможность увеличения выхода НПК на стадии содовой экстракции. Для этого при экстрагировании в 1 % раствор карбоната натрия добавляли в одном случае хлористый литий до получения 0.05 М раствора, а в другом - хлористый магний и кальций до 0.025
Таблица 7 Влияние состава буферного раствора на растворимость НПК
- состав использованных растворов:
№l-0.17MNa2CO3
№ 2 - 0.17 MNa2C03 + 0.10 М LiCL
№ з - 0.17 MNa2C03 + 0.10 M CH3COONH4
№ 4 - 0.10 M UCL+ 0.10 М СНЗСООШ4
**
- значение оптической плотности растворов выражено в долях от оп
тической плотности НПК в растворе № 1.
М и 0.02 М растворов соответственно. Затем проводили выделение
НПК по выше описанной схеме, определяли для них выход и содержание НК
и белков. Полученные результаты представлены в таблице 8, а на рисунке 6
- выходные гелъ-хроматографические кривые полученных препаратов.
Таблица 8 Сравнительные характеристики компонентного состава препаратов НПК
(представлены средние значения по б экспериментам)
Оказалось, что использование различных экстрагирующих растворов существенно влияет на на соотношение НК и белков в комплексе и их распределение по молкулярным массам. Добавление в экстрагент солей кальция и магния снижало количество НК в НПК. Вероятно это связано со стабилизацией в растворе эндогенных гидролаз дрожжей ионами Са + и Mg + и сопровождается увеличением их активности. Действительно, в таких препаратах преобладает низкомолекулярная фракция (Vnp от 80 до 100 мл), содержащая отдельные нуклеотиды и аминокислоты, как результат энзиматиче-ского гидролиза (рисунок 6 а). Напротив, использование экстракции с добавлением хлорида лития повышало суммарное содержание НК в препаратах (рисунок 6 б), что хорошо согласуется с проведенными исследованиями растворимости НПК в различных буферных растворах. Однако, в этом случае наблюдали снижение количества белков в НПК. Кроме того, добавление солей в растворы для экстракции значительно повышает зольность конечных препаратов. Исходя из полученных результатов, заключили, что оптимальным методом является содовая экстракция.
Несмотря на то, что клетки дрожжей предварительно разрушали и выбрали для ведения экстракции высокую ионную силу экстрагента, не все НК
a)
260 нм 280 нм
б)
в)
Ve , мл
0.2
0.4
— 0.2
0.3
0. 1
1 '
Рисунок 6. Гель-хроматография НПК, полученных с использованием различных экстрагирующих растворов. Содовая экстракция с добавлением CaCL2+MgCL2 (а). Содовая экстракция с добавлением LiCL (б). Содовая экстракция (в).
переходят в раствор. Часть ДНК в комплексе с РНК и белками, являясь структурным элементом крепления петель ДНК к ядерному скелету, довольно прочно связана с ядерной оболочкой (Чернохвостов В.В. и др., 1986). Такой комплекс устойчив к действию ионных детергентов, высоким концентрациям солей и обработке мочевиной. Поэтому, при извлечении НПК требуется дополнительная интенсификация процесса экстракции.
С физической точки зрения переход НК с белками из биомассы дрожжей в щелочной раствор может быть рассмотрен, как экстракция в коллоидной суспензии. Известно, что массопередача при экстракции может быть выражена следующим уравнением (Броунштейн Б.И., Железняк А.С., 1966):
~7"FcpAC (12),
где M/t - количество вещества, растворяющееся в единицу времени;
D - коэффициент молекулярной диффузии;
5 - толщина диффузионного пограничного слоя;
Fcp - средняя во времени поверхность растворения;
Дс - движущая сила диффузии, равная разности концентраций
целевого компонента в пограничном слое твердой фазы и в
растворе.
Из уравнения 12 видно, что количество вещества, растворяющегося при экстракции обратно пропорционально толщине диффузионного слоя 5, который, в свою очередь, зависит от интенсивности перемешивания. Чем быстрее движение жидкости относительно разрушенных клеток, тем тоньше диффузионный слой и тем больше коэффициент массоотдачи. Поэтому, использовали интенсивное перемешивание для уменьшения 8 и ускорения извлечения целевых компонентов.
Другим фактором, ускоряющим выщелачивание, является температура процесса. С повышением температуры увеличивается движущая сила экстракции Ас. Кроме того, с увеличением температуры снижается вязкость раствора и, как следствие - возрастает значение эффективного коэффициента диффузии. Это также способствует повышению скорости экстракции (Касаткин А.Г., 1971).
Однако, температура ведения экстракции оказывает значительное влияние на компонентный состав выделяемых нуклеопротеинов. С одной стороны, повышение температуры увеличивает процесс массоотдачи и выход НПК. Но с другой стороны, на стадии экстракции протекает частичный щелочной гидролиз хроматина и энзиматический гидролиз сопутствующими эндогенными ДНКазами и РНКазами по свободным расплетенным участкам НК (Альтман С, 1991; Бабыкин, 1992). Прогревание клеток при 85-90С приводит к денатурации ферментов, входящих в НПК и более полному выделению НК (Крылов И.А. и др., 1996).
Основываясь на известных литературных данных, теоретически подобрали температуру экстракции t=80C для денатурации гидролитических ферментов - протеиназ и РНК-аз и соответствующую максимально возможному содержанию НПК в экстракте. Экстракт прогревали при заданной температуре в течение 20 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры.
Следует отметить, что степень разрушения клеток оказывает значительное влияние на скорость выщелачивания. Измельчение биомассы приводит к увеличению поверхности соприкосновения фаз, а также позволяет сократить путь вещества из более глубоких слоев к поверхности. В случае выделения НПК полностью разрушать клетки механической дезинтеграцией было невозможно, так как это приводило бы к потере нативной структуры НК. Следовательно, для более полного высвобождения целевых компонентов увеличивали время экстракции.
Охлажденный до комнатной температуры экстракт переносили в холодную камеру (t=+4C) и исследовали влияние времени низкотемпературной содовой экстракции на кинетику дополнительного выделения НІЖ. На рисунке 7 приведена зависимость величины оптической плотности экстракта от времени проведения экстракции. Видно, что за первые сутки экстракции происходит резкое увеличение оптической плотности раствора, что свидетельствует о переходе в экстракт белков и НК. В течение последующих семи суток эксперимента наблюдали незначительное изменение оптической плотности. Полученная кривая является типичной изотермой экстракции с насыщением, когда достигается равновесие между концентрациями раствореных НК и НК, находящихся в клетках. Ведение длительного процесса экстракции с насыщением является малоэффективным, так как при приближении к состоянию насыщения падает движущая сила процесса и выщелачивание замедляется. Для предохранения целевых НПК от ферментативного гидролиза ограничивали время экстракции одними сутками.
В тоже время, выход НПК на стадии экстракции может быть увеличен с использованием дробной экстракции (Сандер Ю.К., 1956). Действительно, при проведении дробной экстракции с полной заменой экстрагента на вторые сутки экстракции, значение оптической плотности вновь используемого экстрагента было сравнимо с экстрактом первых суток (рисунок 8). То есть, достигалось более полное извлечение из клеток НК и белков.
260 нм
12.00 —
8.00 —
16.00
4.00
0.00
Рисунок 7. Влияние времени проведения содовой экстракции на высвобождение НК из клеток дрожжей, t - продолжительность экстракции, Е - оптическая плотность экстракта.
замена экстрагента
'і
260 нм
280 нм
t, час
Рисунок 8. Дробная содовая экстракция.
t - время экстракции, Е - оптическая плотность экстракта.
3.1.2. Фракционирование экстракта по молекулярным массам НПК
мембранной микрофильтрацией
Использованный метод дробной экстракции значительно увеличивал конечный объем экстракта, что осложняло дальнейшую процедуру выделения НПК. Трудность обработки больших объемов подобных экстрактов, как и любых физиологических жидкостей, заключается в том, что они не только содержат коллоидные частицы и макромолекулы различной величины и формы, но и обладают высокой вязкостью.
Известно, что для разделения смесей биологически активных веществ с успехом может применяться метод мембранной фильтрации. Этот метод позволяет разделять высоко- и низкомолекулярные компоненты смесей, проводить фракционирование и концентрирование высокомолекулярных веществ, что повышает качество конечных продуктов (Карпов A.M. и др., 1989; Современная технология фильтрации, 1989). К сожалению, у традиционно применяемых в биотехнологии мембран и мембранных установок есть ряд крупных недостатков, ограничивающих область их использования. Прежде всего, в таких установках преимущественно используются мембраны из целлюлозы и ее эфиров (Начинкин О.И., 1985). Особенности структуры поверхности и расположение на ней заряженных групп материала приводит к адсорбции белковых молекул и возникновению явления концентрационной поляризации. Происходит снижение удельной производительности мембран и потеря целевых продуктов (Брок Т., 1987), что не позволяет фракционировать вязкие растворы. Кроме того, эти мембраны склонны к биодеструкции, так как сама ацетатная мембрана служит хорошим субстратом для микроорганизмов (Кураков В.В., Свитцов А.А., 1987).
В промышленных условиях разделение смесей с различной молекулярной массой чаще всего достигается ультрафильтрацией, где жидкость продавливается под избыточным давлением через мембраны с порами от 0.001
до 0.1 мкм в тупиковом режиме (Петров СВ. и др., 1989). При работе установок в тупиковом режиме их производительность падает в 2-10 раз (в зависимости от физико-химических свойств разделяемой смеси) из-за образования и уплотнения слоя осадка у поверхности мембраны. Подобный эффект наблюдали, например, при ультрафильтрации дезинтеграта хлебопекарных дрожжей (Цапюк Е.А. и др., 1993).
Описанных выше недостатков лишены микрофильтрационные модули на основе лавсановых трековых мембран, впервые использованные в работе для разделения по молекулярным массам и концентрирования НК и НІЖ.
Теоретической предпосылкой использования метода микрофильтрации для выделения молекул с размерами, заведомо меньшими, чем диаметр пор фильтра, является известный факт гидродинамической ориентации жестко-цепных линейных полимеров в потоке с продольным напряжением сдвига (Цветков В.Н., 1986).
Общая характеристика и структурно-функциональная организация хроматина дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae - одна из самых популярных и хорошо изученных биотехнологических культур. Область использования дрожжей простирается от традиционных технологий пивоварения, хлебопечения и виноделия до генетической инженерии. В настоящее время известно более 300 видов дрожжей.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются типичным представителем сумчатых грибов класса Ascomycetes. Размножаются почкованием, но имеют и половой процесс развития. Мицелия не образуют. Клетки дрожжей обычно сферической или круглой формы с диаметром от 7 до 10 мкм. Имеют оформленное ядро с диаметром около 2 мкм (Блинов Н.П. 1984). Ядро окружено двухслойной ядерной оболочкой, соединенной с одной стороны с сетью эндоплазматического ретикулума, а с другой - с белками ядерного мат-рикса. Ядерноя оболочка защищает и предохраняет ДНК от внешних неблагоприятных воздействий. Связь между ДНК и цитоплазмой клетки осуществляется через ядерные мембраные белки - порины, через которые способны проникать молекулы РНК, регуляторные белки и гормоны стероидной природы. Число молекул ДНК (хромосом), приходящееся на одну клетку является важным токсономическим признаком организма. В интервале между двумя последующими делениями клетки не имеют четко выраженных хромосом. В этот период ДНК расплетена. Ядро заполняет гетерохроматин -комплекс ДНК, РНК и ядерных белков (van Holde К.Е, 1989) (Табл. 1).
У всех эукариотических организмов выделяют два крупных класса белков хроматина: белки основной природы - гистоны и негистоновые белки хроматина (НГБ). К НГБ хроматина относятся кислые, основные белки и нейтральные пептиды, называемые факторами (van Holde К.Е, 1989). Гистоны являются основными структурообразующими белками хроматина, на которые наматывается нить ДНК (Нуклеиновые кислоты, 1966). В то же время, обширный класс негистоновых белков включает различные белки, как структурные (белки крепления хромосом к ядерной мембране и матриксу), так и регуляторные (белки, активирующие удвоение ДНК и транскрипцию, а также ферменты, участвующие в этих процессах) (Структура и генетическое значение..., 1985). Гистоны и негистоновые белки хроматина регулируют клеточный цикл на всех этапах - от деления до завершения существования клетки и утилизации ее соседними молодыми клетками популяции (Гиней-тис А., 1988; Куций М.П.и др., 1999;: - Fraser A. and Jemes С, 1998; Ink В. et al., 1997; Modeo F. et al., 1999).
Содержание и характеристика нуклеиновых кислот дрожжей Saccharomyces cerevisiae
С физико-химической точки зрения нуклеиновые кислоты (НК) представляют собой линейные полиэлектролиты, состоящие из мономеров-мононуклеотидов, которые включают азотистое основание (пуриновое или пиримидиновое), пентозу и остаток фосфорной кислоты. ДНК составляют дезоксирибоза и азотистые основания аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т). в состав РНК входят рибоза и те же основания за исключением тимина, который заменен урацилом (У). Перечисленные азотистые основания относятся к главному ряду. Характерной особенностью дрожжей является отсутствие минорных оснований (6-метиладенина, 1-метилгуанина, 5-метилцитозина, 5-оксиметилцитозина), встречающихся в следовых количествах у высших эукариот в тРНК и рРНК (van Holde К.Е., 1989; Нуклеиновые кислоты..., 1957).
Количество нуклеотидов четырех типов, входящих в состав ДНК, мо жет охарактеризовать видовую принадлежность организма. Доказано, что соотношение (А+Т)/(Г+Ц) представляет собой показатель специфично сти ДНК. и может быть использовано при установлении положения, зани маемого организмом в общей классификации микроорганизмов. Так для S. cerevisiae величина (А+Т)/(Г+Ц) соответствует 1,80 - 1,79 (Нуклеиновые ки слоты, 1962).
Материалы исследования
НПК получали из клеток пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae производства ОАО "Комбинат пищевых продуктов" (ГОСТ 171-81. Перед выделением НПК дрожжи суспендировали в дистиллированной воде и отмывали от низкомолекулярных примесей, остатков питательной среды и бактериальных клеток микрофильтрацией в режиме рециклинга. Объемное соотношение дрожжевой суспензии и дистиллированной воды для промывки варьировало от 1:10 до 1:20 в зависимости от исходного микробного обсеменения культуры. Чистоту подготовленной дрожжевой суспензии контролировали по остаточным белкам промывной воды (значение оптической плотности не превышает 0,1-0,2 при длине волны 280 нм) и содержанию бактериальных клеток - не более 1-2 клеток в поле зрения при микроскопии суспензии (Новаковская С.С., Шишацкий Ю.И., 1990).
Для определения биологической активности НПК использовали культуру дрожжей S. cerevisiae (штамм ВКМ У-379), имеющий порядковый номер 239 в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии.
Рибонуклеиновая кислота
В работе использовали дрожжевую РНК (Koch-Light), представляющую собой смешанную фракцию рибосомальных, матричных и транспортных РНК, полученных из клеток дрожжей методом щелочной экстракции с последующей депротеинизацией. Растворы РНК готовили в ОД М фосфатном буфере рН 8,2. Концентрацию РНК в растворе определяли по поглощению в УФ-области при длине волны 260 нм (Фердман Д.Л. , 1966) и орцино-вым методом.
Убикитин
Убикитин - универсальный ядерный регуляторный белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков с молекулярной массой 8500 Да. В клетке находится как в виде мономера, так и образует полимерные цепочки по Lis48 (Oxford dictionary of..., 1997). В работе использовали лиофилизированный препарат убикитина, полученного из эритроцитов быка (Sigma). Чистота -репарата - 90% по данным электрофореза в додецилсульфате натрия.
Растворы убикитина заданной концентрации готовили в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,2. Концентрацию убикитина определяли по методу Лоури.
Рибонуклеаза
Для энзиматического гидролиза РНК в работе использовали рибонуклеазу кристаллическую (РНК-азу), представляющую собой гидролазу альбуминового типа (Мосолов В.В. , 1971) из поджелудочной железы крупного рогатого скота, коммерческий препарат производства завода медицинских препаратов АО "Самсон" (Россия).
Митогены (лектины)
В реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в качестве веществ сравнения использовали препараты конконовалина А (КонА) и фито-гемагглютинина пшеницы (ФГА), производства Sigma. Белки КонА и ФГА относятся к классу лекгинов. Они агтлютинируют клетку, взаимодействуя с остатками Сахаров клеточных мембран (Sharon N. and Lis Н., 1972). КонА и ФГА являются митогенными лектинами, то есть индуцируют репликацию КК и размножение лимфоцитов (Concanavalin А..., 1976). Единицы мито-генной активности КонА и ФГА, использованных в работе составляли 500 мг/мл и 20 мг/мл соответственно.
Растворы КонА и ФГА для РТМЛ готовили, растворяя расчетные навески препаратов в изотоническом растворе NaCl (см. раздел 2.1.4.) до получения концентрации 10 мкг/мл.
Разработка метода выделения НПК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Для экстракции НПК из клеток дрожжей, предварительно разрушенных трехкратным замораживанием-оттаиванием использовали слабоосновной буферный раствор - натриевую соль угольной кислоты, способствующее растворению нуклеопротеиновых компонентов хроматина (Беглов Д.Б., 1991). В тоже время, присутствие в конечном продукте гистонов, часто сопровождающих препараты НК и ядерных белков, не желательно, так как даже после выделения из состава хроматина они сохраняют выраженную биологическую активность. Так, при введении в макроорганизм гистоны оказывают токсическое действие на клеточные мембраны тимоцитов и проявляют коагулянтные свойства в кровяном русле (Абакунин Д.Б., Замулаева И.А., 1999). Поэтому, концентрацию карбоната натрия подбирали таким образом, чтобы в растворе создать условия для полной декомпактизации гистонового октамера и высвобождения молекул ДНК. Гистоны относятся к лабильносвя-занным белкам хроматина и для их диссоциации достаточным является превышение ионной силы 800 мМ раствора хлорида натрия (Хроматин и нук-леосомы..., 1988). Для экстракции выбрали концентрацию карбоната натрия равную 1 % по весу.
Как было отмечено ранее, взаимодействие гидрофильных НК с поли-амфолитами-белками является причиной образования плотно упакованных и плохо растворомьгх надмолекулярных структур хромосом. Однако, состояние плотной упаковки характерно лишь для этапа разделения наследуемого материала между дочерней и материнской клетками. На остальных этапах клеточного цикла происходит потеря жесткой структуры хроматина до полной гомогенизации ядерного материала. В таком состоянии ДНК максимально гидротирована и открыта для взаимодействия с белковыми факторами транскрипции и репликации.
В тоже время известно, что есть определенная связь между солевым микроокружением и конформационными переходами в НК (Manning G.S., 1978). Ионы металлов Mg (П), Са (И), Na (I), К (I), Li (I), Cs (I) содержатся в клетке в миллимолярных концентрациях и обычно существуют в виде комплексов с НК. Увеличение концентрации ионов ведет к компактизации (сворачиванию) НК в следствие взаимодействия ионов с наиболее гидротиро-ванными фосфатными группами НК (Hanlon S.et al., 1975). А при взаимодействии ионов металлов с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями НК происходит дестабилизация двойной спирали, разрушение водородных связей, сопровождающееся увеличением растворимости НК (Nucleic acid..., 1980).
В таблице 7 приведены результаты измерения растворимости препаратов НПК в солевых растворах различного состава. Видно, что ионы лития способствуют более полному переходу НК в раствор, в то время как катионы аммония снижают растворимость НПК.
