Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 11
2.1. Культуры клеток кожи млекопитающих и история их получения 11
2.2. Гистологическое строение и эмбриогенез кожи млекопитающих 13
2.3. Методы получения и культивирования кератиноцитов млекопитающих 23
3. Собственные исследования 28
3.1. Материалы исследований 28
3.1.1. Питательные среды и растворы 28
3.1.2. Постоянные линии и диплоидные штаммы клеток 29
3.1.3. Штаммы вирусов 29
3.2. Методы исследований 30
3.2.1. Получение первичной культуры клеток кожи 30
3.2.2. Подсчет концентрации клеток в суспензии 31
3.2.3. Определение доли жизнеспособных клеток и подсчет индекса пролиферации 32
3.2.4. Цитологические методы исследования 32
3.2.5. Кариологическое исследование 33
3.2.6. Электронно-микроскопическое исследование 34
3.2.7. Вирусологические исследования 34
3.2.8. Криоконсервирование и создание банка культур клеток 37
3.3. Результаты исследований 38
3.3.1. Разработка оптимальных условий ферментативного разделения эпидермального и дермального слоев кожи плодов кролика, кошки, собаки 38
3.3.2. Разработка оптимальных условий ферментативной дезагрегации ЭСКП кролика, кошки, собаки 39
3.3.3. Разработка оптимальных условий культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки 48
3.3.4. Определение эффективности ростовых свойств питательных сред для культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки 49
3.3.5. Субкультивирование клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки 53
3.3.6. Сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур с постоянной линией RSK и диплоидным штаммом КЭК 64
3.3.7. Изучение динамики митотической активности в процессе длительного культивирования клеток ЭСКП кролика 71
3.3.8. Сравнительный кариологический анализ культуры клеток ЭСКП кролика и постоянной линии RSK 73
3.3.9. Ультраструктурная характеристика состава клеточной культуры ЭСКП кролика 76
3.3.10. Изучение влияния глубокого замораживания на жизнеспособность клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки 95
3.3.11. Изучение чувствительности культуры клеток ЭСКП кролика к вирусам 96
4. Обсуждение результатов исследований 109
5. Выводы 120
Практические предложения 122
Список литературы 123
Приложение 135
- Культуры клеток кожи млекопитающих и история их получения
- Материалы исследований
- Кариологическое исследование
Введение к работе
Кожа образует внешний покров организма и является одним из наиболее крупных органов. Физиологическую значимость кожи трудно переоценить. Пограничное расположение кожи обусловливает ее непосредственное взаимодействие с внешней средой и ее повреждающими факторами. Поврежденная кожа не способна выполнять возложенные на нее функции, а обширные и долго не заживающие повреждения могут привести к летальному исходу.
Таким образом, кожа представляет собой важный объект для фундаментальных и прикладных исследований в биотехнологии, ветеринарии и гуманитарной медицине.
Первыми практический интерес к культурам клеток кожи проявили врачи-комбустиологи, т.к. одной из главных проблем лечения больных с обширной ожоговой травмой (30-40% поверхности тела) является закрытие раневых поверхностей. Однако закрыть все ожоговые раны при помощи одних лишь аутодермотрансплантатов часто бывает невозможно из-за дефицита донорских ресурсов.
Принципиальная возможность использования для заживления ран аутоклеток кожи, выращенных in vitro, была показана ещё в сороковых годах XX века в работах профессора зоологии Лондонского университета Р.В. Medawar (1948). Тогда же были предприняты первые попытки получения кератиноцитов.
В то же время группа ученых (Robbins F.C., Enders J.F., Weller Т.Н., 1949) в процессе изучения вируса полиомиелита показали возможность использования различных клеточных культур и, в частности, культур клеток кожи в качестве моделей для изучения и накопления вирусов.
Первичные и органные культуры клеток кожи нашли широкое применение в исследованиях дермотропных вирусов, а также в производстве
вакцин против них (Рысмендева К.К., 1992; Животная клетка в культуре, 2000; Wurster D.H., Benirschke К., 1970).
Развитие методической базы для получения и культивирования кератиноцитов произошло благодаря изучению биологии дерматофитов и патогенеза дерматофитозов, т.к. жизнедеятельность этих грибов тесно связана с кератином эпидермиса (Ни F., Livingood C.S. et al., 1954; Alteras 1., Gavrilescu M., 1965).
Культуры кератиноцитов хорошо зарекомендовали себя не только как основной компонент для создания трансплантационного материала, но также как чувствительная модель для вирусологических исследований, ценный инструмент в биотехнологическом производстве и фармакологии (Prunieras М., 1984; Livingood C.S., Ни F., 1954), доступный источник стволовых клеток (Papini S., Cecchetti D., Сатрапі D. et al., 2003, Radu E., Simionescu 0., Regalia Т., 2003; Спичкина О.Г., Калмыкова H.B., Кухарева Л.В. и др., 2006) и генетического материала (De Luca М., Pellegrini G., 1997).
К 1975 г. были достигнуты определенные успехи в культивировании трипсинизированных кератиноцитов (Rheinwald J.G., Green Н., 1975). Преимуществом данного метода является предварительное разделение кожи по базальной пластинке на дерму и эпидермальный слой с последующей дезагрегацией отделенного эпидермиса.
Использование фидерных слоев клеток и питательных сред с физиологически высоким содержанием кальция позволило решить техническую задачу получения эпидермальных пластов с целью их трансплантации.
Но разработанные еще в 1975 году методики выделения и последующего субкультивирования кератиноцитов сопряжены с рядом трудностей, а именно использование специфических, дорогостоящих реактивов, применение сложных и длительных приемов культивирования, ряд которых накладывает ограничения на возможности дальнейшего применения полученных культур.
У большинства известных перевиваемых линий клеток эпидермального слоя кожи при длительном пассировании снижается чувствительность к вирусам, ухудшается пролиферативный потенциал, меняются культурально-морфологические свойства. Всегда может возникнуть потребность оперативного получения новых перевиваемых линий кератиноцитов от различных видов животных.
Поэтому, представляется актуальной в научном и практическом отношениях разработка легко воспроизводимых, оперативных и унифицированных для различных видов животных методик получения культур кератиноцитов с их детальной культурально-морфологической, кариологической и ультраструктурной характеристикой.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в получении культур кератиноцитов кожи плодов кролика, собаки, кошки, изучение их культурально-морфологических свойств и чувствительности к вирусам.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
получить первичные культуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки;
получить субкультуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки с преобладанием в составе монослоя клеток эпителиоподобной морфологии;
провести сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур со стабильной клеточной линией RSK и диплоидным штаммом КЭК;
провести сравнительный кариологический анализ полученных культур со стабильной клеточной линией RSK;
провести ультраструктурное исследование полученных культур клеток;
изучить чувствительность полученных культур к различным вирусам;
отработать метод глубокого замораживания (-196С) полученных культур;
депонировать полученные культуры клеток в криобанк ВИЭВ;
на основе проведенных исследований разработать методические
рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи
плодов кролика, кошки, собаки.
Научная новизна. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки с использованием различных диспергирующих агентов.
Получен диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр. Изучены их культурально-морфологические и кариологические свойства. Представлена ультраструктурная характеристика полученных клеточных культур.
Показано, что субкультуры клеток ЭСКП кролика на 20 и 38 пассажах, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика на 45 пассаже, а также ЭККПКр обладают высокой чувствительностью к вирусу ВД-БС и слабой чувствительностью к вирусу ИРТ.
Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы методы получения первичных культур и субкультур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получены и заложены в криобанк ВИЭВ субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получен и заложен в криобанк ВИЭВ диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр и показана возможность их использования в вирусологических исследованиях.
Разработаны и опубликованы методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки.
Апробация. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:
Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Москва, ВИЭВ, 2006 г.);
3-ем Всемирном конгрессе регенеративной медицины (Лейпциг, 2007
г.);
Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2008 г.).
Секции «Ветеринарной биотехнологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 1 работа находится в печати.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 63 рисунками. Список литературы включает 105 публикаций, в том числе 67 иностранных.
2. Обзор литературы
Культуры клеток кожи млекопитающих и история их получения
Культура кожной ткани является одной из первых полученных органных культур. Еще в 1898 г. С.А. Ljungren культивировал в асцитной жидкости кусочки человеческой кожи, которые переживали в течение нескольких суток. Позднее многие исследователи культивировали эксплантаты кожи, применяя различные способы.
Развитие общих методов культивирования клеток способствовало совершенствованию приемов культивирования клеток кожи (Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.Н., 1988).
Одним из первых кто добился успеха в длительном культивировании клеток кожи, сохраняющих диплоидный кариотип, были Т.Т. Puck, S.J. Ciecura, A. Robinson (1958). В качестве исходного материала они использовали кусочки кожи людей различного возраста. Два штамма из полученных удалось поддерживать на протяжении девяти месяцев.
В 1960 году Т.С. Hsu и D.S. Kellogg Jr. опубликовали данные о культуре RPMI-1846, полученной из меланомы золотого сирийского хомячка, чувствительной к вирусу везикулярного стоматита.
В 1962 году L. Hayflick и P.S. Moorhead разработали метод выделения и поддержания культур диплоидных клеток различных тканей человека и с его помощью получили штаммы WI-2, WI-5, WI-8, WI-12, WI-14, WI-20 из кожно-мышечной ткани эмбриона человека. Впервые в нашей стране, с использованием методики, предложенной L. Hayflick и P.S. Moorhead (1962), Л.Л. Миронова, Н.Е. Гольдфарб, О.Ф. Сарычева (1963) получили из кожи и мышцы эмбриона человека диплоидные штаммы ЧЭ-1, ЧЭ-2 и ЧЭ-3, которые были представлены фибробластоподобными клетками с высокой пролиферативной активностью. M.F. Coria (1969) получил из кожи эмбриона коровы клеточный штамм BES-CM, состоящий из фибробластоподобных клеток. Штамм удалось поддерживать на протяжении 48 пассажей. В 1970 году D.H. Wurster и К. Benirschke опубликовали описание постоянной культуры клеток кожи индийского мунтжака, чувствительной к ВД-БС, вирусам везикулярного стоматита, простого герпеса и коровьей оспы. Эта культура широко используется учеными в молекулярно-генетических исследованиях. О.Г. Анджапаридзе, Д.Ф. Осидзе, С.А. Витина (1973) получили из кожно-мышечной ткани эмбриона коровы диплоидный штамм ДККМЭК пригодный для широкого спектра вирусологических исследований. Л.Л. Миронова, И.В Стобецкий, Г.П. Крючкова и др. (1987) сообщили о получении из кожно-мышечной ткани 7-8 недельных эмбрионов человека десяти диплоидных линий клеток: М-7, М-10, М-19, М-21, М-22, М-23, М-24, М-26, М-27, М-28. Трипсинизацию осуществляли по методу L. Hayflick и P.S. Moorhead (1962) с модификацией Мироновой Л.Л. Культура клеток М-19 широко применяется для исследования интерферонового статуса человека (Орлова Т.Г., Минткевич Г.Л., Миронова Л.Л., 2006). В.К. Сологубом, Б.К. Бахаревым и Л.И. Прониной (1987) получена культура клеток ЭК Л, чувствительная к вирусу инфекционной анемии лошадей и герпесвирусу лошадей 2-го типа, что позволяет использовать ее для диагностики и накопления вирусов этих опасных заболеваний (Животная клетка в культуре, 2000). Культуры клеток кожи плодов овцы (КЭО) и крольчихи (КЭК), полученные К.К. Рысмендеевой (1992), нашли свое применение для культивирования возбудителя контагиозной эктимы овец и коз, а также для получения вакцины против этих заболеваниий.
Для диагностики вируса инфекционного ринотрахеита и вируса ринопневмонии лошадей нашла свое применение культура клеток кожи кролика RSK (Животная клетка в культуре, 2000).
Материалы исследований
В качестве питательных сред для культивирования использовали среды производства ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова (РАМН): Игла MEM, Игла, модифицированную Дюльбекко (ДМЕМ), Игла с двойным набором аминокислот, 199, ГЛА. Питательные среды дополняли фетальной сывороткой КРС (HyClone (США)), сывороткой КРС (ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (РАСХН)), а также растворами антибиотиков: гентамицина или энросепта. Для дезагрегации тканей при получении первичной культуры использовали 0,25% раствор трипсина (ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова (РАМН)), 0,02% раствор версена (производства ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (РАСХН)) и их смеси в различном соотношении, диспазу стерильную лиофилизированную (Sigma, США), коллагеназу (тип IV) стерильную лиофилизированную (Sigma, США). Для снятия клеток с субстрата при пассировании применяли смесь из 0,02% раствора версена (ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (РАСХН)) и 0,25% раствора раствор трипсина (ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова (РАМН)) в соотношении 1:9. Для промывания исходного биологического материала и разведения дезагрегирующих ферментов использовали стерильный раствор Хенкса без 94- 94- ионов Са и Mg или стерильный физиологический раствор (ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (РАСХН)). При криоконсервации в качестве криопротектора применяли раствор ДМСО (Sigma, США).
В качестве объектов исследований использовали следующие длительно-культивируемые постоянные клеточные линии из криобанка ВИЭВ (РАСХН):
RSK - монослоиная культура клеток кожи кролика с однородной эпителиоподобной морфологией клеток. Кариотип культуры представлен диплоидным набором хромосом (2п=44). Модальный класс культуры - 44 хромосомы, интервал изменчивости 12-66 хромосом. Культура чувствительна к вирусам ИРТ и РПЛ.
КСТ - монослоиная культура клеток коронарных сосудов сердца плода КРС с однородной эпителиоподобной морфологией клеток. Модальный класс культуры - 58-60 хромосом, интервал изменчивости 58-61 хромосома. Культура чувствительна к вирусам ВД-БС и ИРТ.
MDBK — монослоиная культура клеток почки быка с однородной эпителиоподобной морфологией клеток. Модальный класс культуры - 42 хромосомы, интервал изменчивости 40-75 хромосом. Культура чувствительна к вирусам ВД-БС, ИРТ, ПГ-3.
КЭК - диплоидный штамм клеток кожи эмбриона кролика, состоящий из монослойно растущей смешанной популяции фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток. Модальный класс культуры — 44 хромосомы. Культура чувствительна к вирусу контагиозной эктимы овец.
Кариологическое исследование
Хромосомные препараты готовили по методу P.S. Moorhead, Р.С. Nowell, W.J. Mellman et al. (1960) с небольшими модификациями. На 3 сутки культивирования в культуру вносили колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл на 2 ч. Культуральную жидкость с колхицином сливали, на клетки наслаивали теплый раствор (37С) 0,25% трипсина и 0,02% версена в соотношении 1:9. В момент отслаивания клеток от стекла (через 3-5 мин.), взвесь клеток собирали в центрифужные пробирки и центрифугировали 10 мин., при 1000 об/мин, надосадочную жидкость сливали и ресуспендировали в гипотоническом растворе, состоящем из смеси раствора Хенкса и дистиллированной воды в соотношении 1:4 и оставляли на 20 мин. при 37С. Затем суспензию клеток пипетировали, и центрифугировали 10 мин. при 1000 об/мин, надосадочную жидкость удаляли, а к осадку осторожно добавляли свежеприготовленную (охлажденную до 4С) фиксирующую смесь, состоящую из трех частей метилового спирта и одной части ледяной уксусной кислоты. Фиксацию проводили при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем клетки ресуспендировали, центрифугировали и осадок клеток заливали следующей порцией фиксатора. Эту процедуру повторяли два раза.
После фиксации раскапывали клеточную суспензию на мокрое охлажденное обезжиренное стекло с высоты 40-50 см с последующим высушиванием под струей теплого воздуха.
Препараты окрашивали азур П-эозином по Романовскому-Гимза в разведении 1:10 при рН=7,0-7,2 в течение 30 мин. Кариологический анализ проводили при световой микроскопии (увеличение х900) с масляной иммерсионной системой путем подсчета числа хромосом в 1000 метафазных пластинок.
