Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Множественная лекарственная устойчивость 13
1.1.1. Возникновение лекарственной устойчивости 13
1.1.2. Механизмы лекарственной устойчивости... 14
1.2. Транспортные белки семейства ABC 17
1.2.1. Р-гликопротеип 18
1.2.2. MRP1 - белок ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью 23
1.3. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков 26
1.3.1. Семейство глутатион - S - трансфераз 26
1.4. Хронические лимфопролиферативные заболевания 35
1.4.1. Хронический лимфолейкоз 36
1.4.2. Неходжкинскиелимфомы 41
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Реактивы 47
2.2. Материал исследования 47
2.3. Методы исследования 50
2.3.1. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 50
2.3.1.1. Выделение геномной ДНК 51
2.3.1.2. Определение концентрации ДНК в образце 51
2.3.1.3. Полимеразная цепная реакция 52
2.3.1.4. Анализ продуктов ПЦР 54
2.3.1.5. Ферментативный гидролиз 54
2.3.1.6. Анализ продуктов рестрикции 54
2.3.2. Определение функциональной активности Р-гликопротеина и MRP 62
2.3.3. Статистическая обработка 64
Глава 3. Результаты 66
3.1. Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям 66
3.2. Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в формировании устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями 70
3.3. Роль полиморфизмов гена MDR1 в 6 интроне (Ех06+139С/Т), 12 (С1236Т), 21 (G2677T) и 26 (С3435Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям 72
3.4. Роль полиморфизмов гена MDR1 в 6 интроне (Ех06+139С/Т), 12 (С1236Т), 21 (G2677T) и 26 (С3435Т) экзонах в формировании устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями 78
3.5. Роль полиморфизмов reimMRPl в 13 экзоне (Т1684С), 9 (A1218+8G) и 18 (С2461-30G) интронах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям 80
3.6. Роль полиморфизмов гена MRP1 в 13 экзоне (Т1684С), 9 (A1218+8G) и 18 (С2461-30G) интронах в формировании устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями 84
3.7. Функциональная активность Р-гликопротеина в лимфоцитах контрольной группы и у больных неходжкинскими лимфомами и анализ ассоциации с полиморфизмом гена MDR1 86
3.8. Анализ ассоциации полиморфизмов гена MRP1 с функциональной активностью MRP в лимфоцитах контрольной группы и у больных ХЛПЗ 96
Глава 4. Обсуждение результатов 101
4.1. Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям 101
4.2. Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в формировании устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями 105
4.3. Роль полиморфизмов гена MDR1 в 6 интроне (Ех06+139С/Т), 12 (С1236Т), 21 (G2677T) и 26 (С3435Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям 108
4.4. Роль полиморфизмов гена MDR1 в 6 интроне (Ех06+139С/Т), 12 (С1236Т), 21 (G2677T) и 26 (С3435Т) экзонах в формировании устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями 112
4.5. Роль полиморфизмов reHaMRPl в 13 экзоне (Т1684С), 9 (A1218+8G) и 18 (С2461-30G) интронах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям 115
4.6. Роль полиморфизмов renaMRPl в 13 экзоне (Т1684С), 9 (A1218+8G) и 18 (С2461-30G) интронах в формировании устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями 116
4.7. Функциональная активность Р-гликопротеина в лимфоцитах периферической крови контрольной группы и у больных лимфопролиферативными заболеваниями 116
4.8. Анализ ассоциации полиморфизмов генов MDR1 и MRP1 с функциональной активностью белков Р-гликопротеина и MRP1 в лимфоцитах контрольной группы и у больных ХЛПЗ 119
Заключение 122
Выводы: 126
Список литературы 127
- MRP1 - белок ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью
- Определение функциональной активности Р-гликопротеина и MRP
- Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям
- Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия проблема онкологических
заболеваний становится все более актуальной. В структуре смертности населения
Земного шара смертность от злокачественных новообразований занимает 2-4-ое
место, в высокоразвитых странах этот показатель выходит на 1-2-ое место
(Якубовская Р.И., 2000), а по данным Госкомстата за 2005 год в России - 2-ое место,
уступая только заболеваниям системы кровообращения
(, 2006). Число людей с впервые выявленными злокачественными новообразованиями неуклонно растет (Чиссов В.И. и соавт., 1995; Заридзе Д.Г. и соавт, 1998). Новосибирская область и г. Новосибирск входят в число административных территорий, неблагоприятных по заболеваемости злокачественными новообразованиями, в том числе опухолями клеток крови (, 2006). По данным Новосибирского облкомстата за 20 лет число онкологических больных в Новосибирской области возросло вдвое, и в 2005 году заболеваемость злокачественными новообразованиями составила 378 случаев на 100 тысяч населения, тогда как средний показатель по России — 328 человек на 100 тысяч (, 2006). Опережая по темпам общую онкологическую заболеваемость, заболеваемость опухолями клеток крови с 1987 года по 2005 год увеличивалась примерно в 4,5 раза (с 3,2 до 14,2 на 100 тысяч населения), преимущественно за счет лейкозов и лимфом. Одна из особенностей этих опухолей — высокий удельный вес лиц молодого, трудоспособного возраста (57.5% больных имеют возраст до 40 лет) с преобладанием у них высокоагрессивных НХЛ (Ковынев И.Б. и соавт., 2006).
Такой рост связывают с возрастающим загрязнением окружающей среды чужеродными для организма веществами (ксенобиотиками), и, соответственно, увеличением их поступления в организм человека (Карпенко Л.Г., 1999; Гуляева Л.Ф. и соавт., 2000). Исследование причин повышения заболеваемости опухолями клеток крови показали, что оно обусловлено неблагоприятной экологической ситуацией в г. Новосибирске и Сибирском федеральном округе в целом и совпадает
с пиками промышленных выбросов с отсрочкой эффекта на 7-10 лет (Ковынев И.Б. и соавт., 2006).
Разная предрасположенность к заболеванию может быть обусловлена генетическими факторами, в том числе межиндивидуальными различиями в биоактивации проканцерогенов и выведении канцерогенных веществ из организма. Установление взаимосвязи между определенным генотипом и формой заболевания поможет приблизить к пониманию механизмов развития различных форм рака, а с учетом предрасполагающих факторов (курение, загрязнители окружающей среды) позволит выявить группы риска, обладающие повышенной чувствительностью к данным заболеваниям.
Рост случаев онкологических заболеваний, выводит на передний план проблему их лечения. Основным методом лечения онкогематологических заболеваний является интенсивная полихимиотерапия. Однако несмотря на высокий процент ремиссий (до 80%) после начальной терапии, рецидив бывает очень часто, и только 20% пациентов, достигают долгосрочного выживания (Поддубная И.В., 2001; Thomas X. et al., 2003). Кроме того, интенсивная химиотерапия является причиной тяжёлых побочных эффектов, особенно у пожилых пациентов (Robak Т., 2004). Поэтому, недолгосрочная эффективность химиотерапии и токсичность лечения - главные проблемы, которые необходимо решить. Одним из препятствий для успешной химиотерапии опухолей является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - невосприимчивость популяции клеток опухоли одновременно к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия на клетку. Феномен МЛУ может быть обусловлен различными механизмами: снижением накопления лекарственного препарата в клетке, связанным с функционированием Р-гликопротеина, белка множественной лекарственной устойчивости MRP; изменением мишеней препаратов, определяемым топоизомеразой II; обезвреживанием препаратов в клетке, обусловленным функционированием систем ферментов метаболизма ксенобиотиков, в частности фермента глутатион-S-трансферазы (GST); отменой апоптоза или блокированием клеточного цикла, возникающими в результате мутаций гена р-53 и активации контролирующих апоптоз генов (Ставровская А.А., 2000).
7 Функционирование ферментов первой и второй фаз биотрансформации
ксенобиотиков и выведение чужеродных соединений из клеток с помощью АТФ-
зависимых транспортных белков - основные механизмы метаболизме и
распределении ксенобиотиков (Sipes I.G., Gandolfi A.J., 1986). Фермент второй фазы
биотрансформации ксенобиотиков глутатион S-трансфераза класса Р участвует в
процессах детоксикации широкого спектра электрофильных соединений,
включающих мутагены и канцерогены окружающей среды (например, дихлорметан
(побочный продукт синтеза пластиков), дибромэтан (образуется при сгорании
бензина), галометан и метилбромид (пестициды)) (Tsuchida S. et al., 1992; Clandinin
M.T. et al., 1994; Pemble S. et al, 1994; Salinas A.E. et al, 1999; Hayes J.D. 2000).
Многие цитостатики, такие как алкилирующие агенты, антрациклины, препараты
платины, стероидные гормоны также являются субстратами глутатион S-трансфераз
(Clandinin М. et al, 1994; Pemble S. et al, 1994; Ставровская A.A, 2000; Hayes J.D. et
al, 2000). Ген GSTP1 является полиморфным: в кодирующем регионе обнаружено
две мутации. Известно, что полиморфные варианты глутатион-8-трансферазы Р1 в 5
экзоне проявляют разную каталитическую активность в отношении
полициклических ароматических углеводородов (Zimniak P. et. al, 1994; Coles В. et
al, 2000; Allan et al, 2001). Полиморфизм в 5 экзоне гена GSTP1 приводит к замене
аминокислоты в активном участке Н-сайта, который отвечает за субстратную
специфичность фермента (Katoh Т. et al, 1999). В связи с этим, межиндивидуальные
различия в ферментативной активности GST, опосредуемые полиморфными
вариантами генами, могут лежать в основе различной предрасположенности к
онкологическим заболеваниям, связанным с влиянием окружающей среды (Harries
L.W. et al, 1997; Harris M.J, et al, 1998). Нет данных, связан ли полиморфизм гена
GSTP1 с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным
заболеваниям и устойчивостью к химиопрепаратам.
АТФ-зависимые транспортные белки Р-гликопротеин и MRP1 (белок
ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью) -продукты генов
MDR1 и MRP1 осуществляют транспорт веществ из клетки. Их физиологическая
роль заключается в защите клеток от токсических соединений. Гены MDR1 и MRP1
являются высокополиморфными, но несмотря на то, что Р-гликопротеин и MRP
широко изучаются, пока непонятна функциональная и клиническая значимость
8 открываемых вариантов полиморфизмов этих генов для биодоступности и
распределения лекарств в организме человека и, как следствие, формирования
лекарственной устойчивости опухолей. Функциональная активность MRP изучена
мало и нет сведений о его активности у больных онкологическими заболеваниями.
Целью настоящей работы было исследование полиморфных вариантов генов
GSTP1, MDR1, MRP1 и анализа взаимосвязи полиморфизмов этих генов с
предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям и
устойчивостью к химиотерапии у больных с такими заболеваниями, а также
исследование связи полиморфизмов генов MDR1 и MRP1 с функциональной
активностью кодируемых ими белков Р-гликопротеина и MRP.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать распределение полиморфных вариантов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах у здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями.
Исследовать распределение полиморфных вариантов гена MDR1 в 6 интроне (Ех6+139С/Т), 12 (С1236Т), 21 (G2677T), 26 (С3435Т) экзонах у здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями.
Исследовать распределение полимофрных вариантов гена MRP1 в 13 экзоне (Т1684С), 9 (A1218+8G), 18 (C2461-30G) интронах у здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями.
Проанализировать взаимосвязь полиморфизмов исследуемых генов с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям у европеоидов западной Сибири в исследованиях «случай-контроль».
Провести анализ взаимосвязи полиморфизмов исследуемых генов с риском развития лекарственной устойчивости у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями.
Определить функциональную активность Р-гликопротеина и MRP в лимфоцитах здоровых европеоидов Западной Сибири и больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатами химиотерапии.
9 7. Исследовать роль полиморфизмов генов MDR1 и MRP1 в функциональной
активности Р-гликопротеина и MRP соответственно.
Научная новизна
Впервые охарактеризована частота встречаемости полиморфизмов A313G и С341Т гена GSTP1, С6+139Т, С1236Т, G2677T, С3435Т гена MDR1, Т1684С, A1218+8G и C2461-30G гена MRP1 в популяции европеоидов Западной Сибири. Показано, что распределение частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов GSTP1, MDR1 и MRP1 у европеоидов Западной Сибири соответствуют частотам в других европеоидных популяциях.
Впервые показано, что полиморфные варианты 341СС гена GSTP1 и 3435ТТ гена MDR1 ассоциированы с устойчивостью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям, а 341СТ и 3435СС генотипы - с предрасположенностью.
Впервые показано, что полиморфные варианты 313AG гена GSTP1 и 2677ТТ, 3435ТТ гена MDR1 ассоциированы с устойчивостью, а генотипы 313АА, 3435СТ -с чувствительностью к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Комбинация генотипов 2677ТТ/3435ТТ в 21 и 26 экзонах гена MDR1 у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями увеличивает в 17 раз риск возникновения лекарственной устойчивости к проводимой химиотерапии в сравнении с больными, имеющими другие генотипы.
При исследовании полиморфизмов Т1684С, A1218+8G и C2461-30G гена MRP1 не выявлено достоверно значимых ассоциаций полиморфных вариантов гена с риском возникновения лимфопролиферативных заболеваний и развитием устойчивости к химиотерапии у больных с этими заболеваниями.
Впервые показано, что функциональная активность Р-гликопротеина у больных неходжкинскими лимфомами ассоциирована со степенью злокачественности опухоли: достоверно более высокий уровень активности показан для больных с высокой степенью злокачественности. Показано также, что уровень функциональной активности Р-гликопротеина в лимфоцитах периферической крови
10 не зависит от применяемых химиопрепаратов и не является показателем для
прогноза устойчивости к химиотерапии у больных неходжкинскими лимфомами.
Показано, что уровни функциональной активности Р-гликопротеина и MRP1
не связаны с полиморфизмами С6+139Т, С1236Т, G2677T, С3435Т гена MDR1 и
Т1684С, A1218+8G, C2461-30G гена MRP1 соответственно ни у здоровых
европеоидов Западной Сибири, ни у больных хроническими
лимфопролиферативными заболеваниями.
Научная и практическая значимость работы
Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных знаний о роли полиморфизмов генов MDR1, MRP1, GSTP1 и функциональной активности транспортных белков Р-гликопротеина и MRP1 в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям и в формировании лекарственной устойчивости у больных с такими заболеваниями.
Полученные данные могут быть использованы для оценки как индивидуального, так и популяционного риска развития онкогематологических заболеваний, а так же разработки дифференцированных программ их первичной профилактики.
Выявление полиморфных вариантов генов, ассоциированных с устойчивостью к химиотерапии, позволит выработать рекомендации но оптимизации химиотерапии.
Основные положения, выносимые на защиту:
С предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям связаны полиморфизмы С341Т в 6 экзоне гена GSTP1 и С3435Т в 26 г экзоне гена MDR1.
С формированием устойчивости к химиотерапии у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями связаны полиморфизмы A313G в 5 экзоне гена GSTP1, G2677T в 21 экзоне и С3435Т 26 экзонах гена MDR1.
Уровень функциональной активности Р-гликопротеина в лимфоцитах периферической крови у больных неходжкинскими лимфомами связан со степенью злокачественности опухоли.
Эффективность химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями не зависит от уровня функциональной активности Р-гликопротеина
Уровни функциональной активности Р-гликопротеина и MRP1 у здоровых европеоидов Западной Сибири и у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями не связаны с полиморфными вариантами генов MDR1 (С6+139Т, С1236Т, G2677T и С3435Т) и MRP1 (Т1684С, A1218+8G и C2461-30G) соответственно.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 17th Meeting of Europe Association for Cancer Research, Granada, Spain, 2002; 1 Международный симпозиум «Стресс и экстремальные состояния», Феодосия, Украина, 2002; 18th International Cancer Congress, Oslo, Norway, 2002; European Scientific Conference: Understanding the Genome: Scientific Progress and Microarray Technology, Genova, Italy, 2002; 37thAnnual Scientific Meeting: European society for clinical investigation. The pathophysiology of diseases: from bench to bedside, Verona, Italy, 2003; 8th Congress of the European Hematology Association, Lyon, France, 2003; Российско-Норвежская конференция по вопросам гематологии, Санкт-Петербург, 2003; III Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино, 2004; 9th Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland, 2004; 15th European Students' Conference for future doctors and young scientists, Berlin, Germany, 2004; XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2005; Региональная конференция молодых ученых-окологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2006; 13th International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, the Netherlands, 2006; Совместная российско-американская конференция по проблемам гематологии и трансплантации костного мозга, 2006.
12 Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту, директору
НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, академику РАМН Ляховичу
Вячеславу Валентиновичу и руководителю Гришановой Алевтине Юрьевне за
руководство работой на всех ее этапах
Автор благодарит Мельникову Евгению Владимировну и Воронцову
Елену Владимировну за помощь в проведении экспериментальной части работы, а
также зав. гематологического отделения с блоком асептических палат для
трансплантации костного мозга Новосибирской областной клинической больницы
Мухина Олега Викторовича и д.м.н., проф. НМГУ Домникову Наталью
Петровну за предоставление клинического материала, а также весь коллектив НИИ
молекулярной биологии и биофизики СО РАМН.
MRP1 - белок ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью
MRP1 (multidrug resistance associated protein) - это белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью, относящийся к суперсемейству ABC-транспортеров к подсемейству АВСС (Dean М. et. al., 2001). Впервые был обнаружен в 1992 году Cole и др. при мелкоклеточном раке легких (Oselin К. et. al., 2003). Ген, кодирующий MRP1, располагается в 16 хромосоме в регионе р13 и состоит из 31 экзона.
Топологически MRP1 можно разделить на 6 главных доменов: 3 политопических MSDs (MSDsl-3), 2 N-трансмембраных домена (NBDhi NBD2) и линкерный регион, соединяющий NBD1 с MSD3 (Ito S. et al., 2001). Белок имеет молекулярную массу 190 кДа и доменную структуру сходную с Р-гликопротеином, но в отличие от него имеет 3 трансмембранных и 2 нуклеотидсвязывающих домена (Cole S.P.C. et al., 1998). Исследования показали, что N-трансмембранный домен у MRP1 не отвечает за транспортную активность (Borst P. et. al., 2000). Субстраты MRP1 Субстратная специфичность MRP1 схожа с таковой у Р-гп. Однако последние работы показали, что основными субстратами для MRP1 являются органические анионы, конъюгирующие с глутатионом, глюкуронатом или сульфатом, в то время как Р-гп имеет низкую афинность к отрицательнозаряженным молекулам. Это объясняет способность MRP1 транспортировать такие противоопухолевые препараты как, метотрексат (Borst P., et. al., 2000), арсенит, мелфалан (Sparreboom Л. et al., 2003). Кроме того, MRP1 транспортирует винка алкалоиды (винкристин, винбластин), а также некоторые алкилирующие агенты, такие как доксорубицин, даунорубицин, хлорамбуцил, этопозид (Lockhart С. A. et. al., 2003). Экспрессия гена MRP1 в нормальных тканях и опухолях и его физиологическая роль Белок MRP1 представлен во всех тканях организма. В отличие от Р-гликопротеина, находящегося в апикальной части энтероцитов, MRP1 локализуется преимущественно в базолатералыюй части. MRP1 экспрессируется на канальцевой мембране гепатоцитов, апикальной мембране проксимальных трубочек почек (Bodo A., et al 2003), а также в клетках пищевода, урогенитального и респираторного тракта, в эндокринных железах (Lockhart A.G. et al., 2003). Было показано, что белок MRP1 транспортирует лейкотриен С4 - мощный хемотаксичекский фактор, контролирующий миграцию дендрических клеток (Dean М. et al., 2001). Помимо этого, белок MRP1 поддерживает окислительно-восстановительный баланс клетки путем выведения окисленного глутатиона. Кроме того, как и все транспортеры, участвует в защите тканей от экзогенных ксенобиотиков. Для MRP1 показана также защитная функция для клеток костного мозга, семенных канальцев, эпителия гортани, клеток мочевыводящих каналов (Borst Р., 2002). MRP1 был открыт в 1992 году, однако до сих пор нет достоверных данных о его клинической значимости. Поскольку MRP1 присутствует во всех тканях, потенциально он присутствует в большинстве опухолей и вполне вероятно может участвовать в лекарственной устойчивости (Borst P. et al., 2000). Несмотря на то, что MRP1 обнаружен почти во всех типах опухолей, тем не менее, не выявлено строгой ассоциации между уровнем MRP1 и клинической лекарственной устойчивостью (Borst P. et al., 2000). Однако повышенная экспрессия MRP1 была показана во многих опухолях и является одним из компонентов при развитии множественной лекарственной устойчивости при раке легкого, толстой кишки, желчного пузыря, а так же при лейкозах (Lockhart С. A. et al., 2003). Существуют достаточно противоречивые данные о вкладе MRP1 в развитие лекарственной устойчивости при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей. Так, в работе Stam R.W. и соавт. было показано, что у детей индийской популяции с ОЛЛ в момент рецидива заболевания уровень экспрессии MRP1 был значительно выше по сравнению с больными в стадии ремиссии или начала болезни (Stam R.W. et al., 2003). Исследования Beck и др. не выявили различий в уровне экспрессии MRP1 в начале заболевания и при первичном рецидиве у больных ОЛЛ, но экспрессия была значительно высокой у больных с повторными рецидивами. По данным литературы повышенный уровень экспрессии MRP1 может иметь прогностическое значение для пациентов с острыми лейкозами, а также с некоторыми солидными опухолями (Шишова Ю.В., 2000). Полиморфизм гена MRP1 Ген MRP1 является полиморфным, в нем выявлено более 90 однонуклеотидных замен (Sparreboom A. et al., 2003), большинство из которых является молчащими мутациями или расположены в интронных областях. Так, при исследовании японской популяции Ito и др. обнаружили 16 мутаций; 12 были локализованы в экзонах, другие в нитронах гена MRP1. Влияние полиморфизмов гена MRP1 на возникновение заболеваний практически не изучено. В связи с этим необходимы дополнительные исследования влияния различных полиморфных вариантов гена MRP1 на развитие предрасположенности к различным формам рака (Lockhart С.А. et al„ 2003). Ферменты метаболизма ксенобиотиков играют основную роль в биотрансформации, метаболизме и детоксификации ксенобиотиков, попадающих в организм человека. В процессах биотрансформации ксенобиотиков выделяют две фазы (Sipes I.G., 1986). К ферментам первой фазы преимущественно относят суперсемейство цитохромов Р450, локализующихся в микросомах клеток печени, желудочно-кишечного тракта, легких и почек. Эти ферменты катализируют реакции окисления, восстановления и гидролиза молекул ксенобиотиков, образуя соединения более водорастворимые, чем исходные. Затем эти вещества могут подвергаться конъюгации с эндогенными лигандами, восстановлению или гидролизу в системе ферментов 2-й фазы, в результате чего образуются полярные, безвредные продукты, которые легко выводятся из организма. (Sipes I.G., 1986, Gonzalez F.J. 1993).К ферментам второй фазы метаболизма относятся ферменты ряда суперсемейств: сульфотрансферазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы, эпоксидгидролазы, глутатион S-трансферазы, N-ацетилтрансферазы. Каждое суперсемейство состоит из семейств и подсемейств генов, кодирующих различные изоформы ферментов с различной субстратной специфичностью, тканевой экспрессией. В основном конъюгация ксенобиотиков с ферментами второй фазы увеличивает их гидрофилыюсть, что способствует выведению через почки и с желчью (Morgenstern R., 1985).
Определение функциональной активности Р-гликопротеина и MRP
Генотипирование проводилось по двум описанным в литературе полиморфным вариантам гена GSTP1 (Board P. et al., 1989). Были исследованы полиморфизмы A313G в 5 экзоне, приводящий к замене Не на Val в 105 кодоне и С341Т в 6 экзоне, который приводит к замене Ala на Val на в 114 кодоне.
Результаты проведенного нами исследования показали, что частоты аллелей и генотипов GSTP1 A313G в 5 экзоне у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями и в группе контроля статистически значимо не отличались.
Частоты аллелей в наших выборках практически совпали с данными, полученными на здоровой популяции детей Новосибирской области, а вот частоты генотипов незначительно отличались за счет повышения частоты дикого генотипа и снижения частоты гетерозиготы (Горева О. и соавт, 2006). При анализе литературных данных, в группе без онкопатологии результаты распределения полиморфных вариантов гена практически не отличались от результатов английских авторов, показавших, что в популяции здоровых доноров 51% обследованных являются гомозиготами дикого типа, 42.5% являются гетерозиготами, и 6.5% являются мутантными гомозиготами (Harries L.W. et al., 1997). Также мы не нашли достоверных отличий в частоте встречаемости генотипов в нашей контрольной выборке от опубликованных в литературе частот в популяциях индийцев, европейских австралийцев, китайцев (Harries L.W. et al., 1997). Однако известно, что между различными популяциями и этническими группами частоты GSTP1 колеблются в очень широких пределах. Незначительные отличия от европеоидов России были выявлены в популяциях афро-американцев, где были повышены частоты гетерозигот и мутантных гомозигот. Достоверные отличия от нашей выборки в частоте встречаемости генотипов были найдены для австралийских аборигенов %2=15Л5, р=0.0005 за счет повышения частоты дикого генотипа (0.82) и снижения частоты гетерозиготы (0.13) (Harries L.W. et al., 1998) и для африканцев X =22.50, р=0.00001 за счет увеличения частот дикого и мутантного генотипов (0.77 102 и 0.09, соответственно) и снижения частоты гетерозигот (0.14) (Dandara С. et al., 2002). Среди тайванцев носителями мутантной гомозиготы являются лишь 3 % (Watson М. A. et al., 1998).
Таким образом, частота мутантного аллеля в нашей контрольной группе была сопоставима с описанными частотами для других европеоидов 0.28-0.36 (Harries L.W. et al., 1997; Landi, 1998), ниже, чем у афро-американцев 0.42-0.45, но выше, чем у африканцев (х2=8.89, р=0.003), азиатов в Индии и других азиатов 0.14-0.27 (Harries L.W.etal., 1997).
Сравнение частот генотипов GSTP1 С341Т в нашей контрольной выборке с различными популяциями и этническим группами показало, что полученное нами распределение практически не отличалось от такового для индийской популяции, где частота гомозигот дикого типа, гетерозигот и мутантных гомозигот составила 0.85, 0.15, 0.01, соответственно. Аналогичное распределение генотипов выявлено и у австралийских европеоидов, где, однако, не было найдено гомозигот мутантного типа (Harries L.W. et al., 1998). Дальнейший анализ литературных данных выявил, что наши результаты для контрольной группы отличались (х =7.55, р=0.02) от результатов Harries L.W. и соавт.,, полученных для здоровых индивидуумов китайской популяции, которые показали более высокую частоту дикого генотипа 0.98, и значительно более низкую частоту для гетерозигот 0.02 и не выявили ни одного носителя мутантной гомозиготы (Harries L.W. et al., 1998). Также достоверные отличия в частоте встречаемости генотипов было найдено для австралийских аборигенов (х2=10.19, р=0.006), где гетерозигота и мутантные гомозиготы не встречались (Harries L.W. et al., 1998). Отсутствие гетерозигот и мутантных гомозигот наблюдалось также и для японской популяции (Ishii et al., 1999).
Частота мутантного аллеля 341Т в контрольной группе (0.11) была сопоставима с таковой у австралийских европеоидов (0.07) и индийцев (0.05), но значительно выше, чем у других среди азиатов (0.0-0.01) (Harries L.W. et al., 1997; Ishii et al., 1999).
Многие исследования, посвященные установлению взаимосвязи между полиморфизмом генов и патологическими процессами, показывают существование такой корреляции. Это может говорить о влиянии того или иного варианта данного гена на процесс возникновения этих патологий, причем этот процесс может вовлекать один или несколько механизмов. Фермент второй фазы метаболизма ксенобиотиков глутатион S-трансфераза класса Р выполняет в организме множество функций. Он участвует в процессах детоксификации чужеродных соединений, таких как органофосфаты (включая пестициды), полициклические ароматические углеводороды (например, бензопирен) (Tsuchida S. et al., 1992; Salinas A.E. et al., 1999), способен вызывать эффекты множественной лекарственной устойчивости, играет немаловажную роль в ответе организма на оксидативный стресс. Однако наибольшее внимание этот фермент вызывает в связи с его участием в процессах канцерогенеза. Из литературных данных известно, что различные полиморфные варианты гена GSTP1 могут обладать различной субстрат-специфичной каталитической активностью (Allan J. et al., 2001). В 5 экзоне гена GSTP1 кодируется либо валин, либо изолейцин. Замена происходит в активном участке Н-сайта, который отвечает за субстратную специфичность фермента. Изменения в данном участке могут влиять на каталитическую эффективность гена GSTP1, что в свою очередь может оказывать значительное влияние на детоксификационные свойства фермента GSTP у индивидуумов. Аллельные варианты фермента GSTP1 различаются по своим активностям по отношению к разным субстратам. К (+)-анти-БПДЭ (бенз[а]пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид) и (+)-анти-ХДЭ (хризен-1,2-диол-3,4-эпоксид) валиновый вариант фермента проявляет большую активность. Изолейциновый вариант напротив более активен по отношению к субстрату 1-хлоро-2,4-динитробензол. Эти данные показывают, что вариант GSTP1 НеЮ5/А1а114 более эффективен в метаболизме диоловых эпоксидов ПАУ. Показано, что риск образования рака легкого при воздействии на организм ПАУ повышен у людей с формой GSTP1 Vail05. Предполагалось, что это связано с меньшей активностью этого варианта GST. Однако оказалось, что различия в активностях двух вариантов этого фермента незначительны по отношению к диоловым эпоксидам ПАУ, а в некоторых случаях активность GSTP1 Vail05 даже выше, чем GSTP1 Ие105 (Coles В., 2000). В связи с этим, межиндивидуальные различия в ферментативной активности GST, опосредуемые полиморфными вариантами генами, могут лежать в основе различной чувствительности к онкологическим заболеваниям, связанным с влиянием окружающей среды.
Среди исследованных онкологических заболеваний различного происхождения, данные об ассоциации мутантного аллеля в 105 кодоне с риском возникновения заболевания неоднозначны Полиморфизм GSTP1 в 105 кодоне как важный фактор чувствительности показан при раке мочевого пузыря (0111=3.6, р 0.006), при тератоме (0111=3.4, р 0.005) и при семиоме (0111=3.3, р 0.002) (Harries L.W. et al., 1997) и раке прямой кишки (Houlston R.S. et al., 2001). Однако другие авторы описывают отсутствие ассоциации наличия Val аллеля с риском развития рака прямой кишки. (Harries L.W. et al., 1997, Welfare M. et al., 1999). При исследовании ассоциации наличия Val аллеля с риском развития рака легкого также были получены противоречивые данные. Только в двух (Ryberg, 1997) из девяти исследований нашли достоверно значимые ассоциации возникновения заболевания (To-Figueras J., 1999). Также не показано достоверных ассоциаций полиморфных вариантов гена с раком простаты, молочной железы (Harries L.W. et al., 1997, Helzlsoueret K.J. al., 1998).
Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям
Продукт гена MDR1 Р-гликопротеин является АТФ-зависимым ферментом, осуществляющим трансмембранный транспорт из клетки эндогенных соединений и ксенобиотиков и таким образом защищающим организм от многих токсических соединений, в том числе и противоопухолевых лекарств (Chen C.J. et al., 1990; Gottesman M.M. et al., 1996). В связи с этим, функционирование Р-гликопротеина может быть одним из механизмов множественной лекарственной устойчивости, являющейся причиной неудач при химиотерапии злокачественных новообразований (Taniguchi S. et al., 2003).
Анализ ассоциаций генетических вариантов MDR1 с ответом на химиотерапию показал, что практически для всех полиморфизмов гена MDR1 наблюдается достоверное отличие частоты аллелей. Анализ ассоциаций между генетическими вариантами в интроне 6 и экзоне 12 у больных ХЛПЗ и результатами химиотерапии не выявил статистически достоверной связи.
Выполненный анализ ассоциаций между генетическими вариантами в экзонах 21 и 26 и эффектом от лечения показал, что для больных с генотипом 2677ТТ вероятность быть устойчивыми к химиотерапии в 6.8 раза выше в сравнении с больными, имеющими один или оба G-аллеля в положении 2677. Аналогичная связь прослеживается для больных с генотипом Т3435Т: вероятность устойчивости к химиотерапии у них в 6.3 раза выше, чем у больных с генотипом С3435С и еще более высокая по сравнению с больными, имеющими один или оба С-аллеля в генотипе (ОШ=10.08). Все выявленные ассоциации были статистически достоверны.
Кроме того, если больной имеет гаплотип 2677ТТ/3435ТТ, то риск быть устойчивым к лечению у него в 10.5 раз выше, чем у больного с комбинацией генотипов 2677GG/3435CC, а по отношению к больным со всеми остальными комбинациями генотипов - в 17 раз. Все полученные различия были статистически достоверными. Таким образом, исследование генетического полиморфизма MDRl в сопоставлении с лекарственной устойчивостью новообразований лимфоидного происхождения показало, что G2677T и С3435Т полиморфизмы гена MDRl влияют на результат терапии у пациентов с хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Поэтому знание генотипа MDRl таких больных важно для прогноза течения болезни и выбора терапии.
Полученные результаты могут быть связаны с измененной экспрессией и функцией Р-гликопротеина. Результаты некоторых исследований показывают ассоциацию Т3435Т генотипа с увеличением уровня Р-гликопротеина и снижением плазматического уровня субстрата фексофенадина у европеоидов Америки и афро 114 американцев (Drescher S. et al., 2002). Однако для европеоидов Германии уровень фексофенадина в плазме не отличался (Kim R.B., 2002). Hoffmeyer и соавт. показали, что мутация в С3435Т гена MDR1 ассоциирована с низким уровнем экспрессии MDR1 и повышенным уровнем дигоксина в цитоплазме (Hoffmeyer S. et al., 2000).
В тоже время в литературе имеются данные о том, что у больных эпилепсией устойчивость к лечению была связана с 3435СС генотипом MDR1. Авторы объясняют это ассоциацией такого генотипа с увеличенным уровнем и повышенной активностью Р-гликопротеина (Siddiqui et al., 2003). Действительно, в литературе имеются данные о том, что у европеоидов генотип 3435ТТ в энтероцитах (Hoffmeyer S. et al., 2000), СБ56+клетках (Hitzl М. et al., 2001) и мононуклеарах периферической крови вязан с низким уровнем Р-гликопротеина. У больных раком молочной железы также выявлена значимая корреляция между клинически полным ответом на химиотерапию с 3435ТТ генотипом (Kafka A. et al., 2003).
Однако исследование выживаемости больных ОЛЛ показало, что полиморфизм в 26 экзоне гена MDR1 не является прогностическим параметром исхода заболевания у взрослых (Jamroziak К. et al., 2005), что противоречит аналогичным исследованиям этих же авторов ОЛЛ, где была показана статистически значимая ассоциация Т3435Т генотипа и более длительной выживаемостью (Jamroziak К. et al., 2004). В последнее время появилось много исследований, демонстрирующих важную функциональную, фармакокинетическую и прогностическую значимость этого полиморфизма, однако все эти данные являются противоречивыми (Ambdukar SV et al., 1999; Hitzl M. et al., 2001; Jamroziak K. et al., 2004; Jamroziak K. et al., 2005).
Таким образом, концепция регуляции экспрессии Р-гликопротеина С3435Т полиморфизмом, изначально описанная Hoffmeyer и соавт. (Hoffmeyer S. et al., 2000) и с большим энтузиазмом воспринятая научным сообществом, привела к получению множества противоречивых данных. Вероятно, это обусловлено тем, что большинство исследований посвящено изучению влияния одного полиморфизма на экспрессию гена, изменение активности Р-гликопротеина. Более того, механизм возможного функционального эффекта молчащей мутации С3435Т все еще остается неясным. В последнее время появляются данные о ко-сегрегации этой молчащей мутации с другими полиморфными вариантами в этом же гене, например, миссенс мутацией G2677T или С1236Т. Таким образом, противоречивые данные могут частично быть зависимыми от неполного сцепления с полиморфизмами, изменяющими структуру белка. Возможно, изучение гаплотипов гена MDR1 будет более полезно в предсказании функции Р-гликопротеина, чем независимый анализ одного С3435Т полиморфизма.
Роль полиморфизмов гена GSTP1 в 5 (A313G) и 6 (С341Т) экзонах в предрасположенности к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям
В настоящей работе был изучен вклад полиморфизма генов GSTP1, MDR1 и MRP1 в возникновение хронических лимфопролиферативных заболеваний и формирование устойчивости к химиотерапии у больных с этими патологиями, а также исследовано влияние полиморфизмов на функциональную активность Р-гликопротеина и MRP.
Проведено исследование распределения полиморфных вариантов генов MDR1, MRP1, GSTP1 у здоровых людей и больных гематологическими онкопатологиями (хроническими лимфопролиферативными заболеваниями, включающими хронический лимфолейкоз и неходжкинские лимфомы). Исследованы наиболее часто встречающиеся однонуклеотидные замены в генах GSTP1(A3\3G, С341Т), MDR1 (С6+139Т, С1236Т, G2677T, С3435Т), MRP1 (Т1684С, A1218+8G, C2461-30G). Показано, что частоты генотипов и аллелей изученных генов в здоровой популяции европеоидов Западной Сибири значимо не отличаются от частот в других европеоидных популяциях. Исследование распределения однонуклеотидных замен выявило достоверные отличия частот генотипов. во всех группах больных от частот в контрольной группе для полиморфизма С341Т в 6 экзоне гена GSTP1, а в гене MDR1 для полиморфизма С3435Т в 26 экзоне показаны различия в частотах аллелей всех групп больных по сравнению с группой контроля. Частоты встречаемости генотипов и аллелей гена MRP1 в группах больных не отличались от частот в контрольной группе.
Проанализированы ассоциации исследованных генотипов с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям. Показано, что полиморфизмы гена GSTP1 (С341Т) в 6 экзоне и гена MDR1 (С3435Т) в 26 экзоне ассоциированы с риском развития этих заболеваний. При этом протективными генотипами для хронических лимфопролиферативных заболеваний и неходжкинских лимфом являются С341С и Т3435Т генотипы, а для хронических лимфолейкозов - только Т3435Т. Генотипы С341Т и С3435С являются факторами чувствительности к хронических лимфопролиферативным заболеваниям, в частности неходжкинским лимфомам; для развития хронического лимфолейкоза критичным является наличие только С341Т генотипа. Анализ распределения полиморфных вариантов гена MRP1 не выявил статистически достоверных ассоциаций с предрасположенностью к хроническим лимфопролиферативным заболеваниям.
Выполнен анализ ассоциаций между исследованными полиморфными вариантами генов и формированием лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями. Показана значимость полиморфизмов гена GSTP1 (A313G) в 5 экзоне и гена MDR1 (G2677T) в 21 экзоне и (С3435Т) в 26 экзоне для формирования устойчивости к химиотерапии. При этом риск устойчивости выше для больных с генотипами A313G, Т2677Т, Т3435Т, и ниже при наличии А313А и С3435Т генотипов. Кроме того, 17-ти кратное повышение риска устойчивости к химиотерапии имеют больные хроническими лимфопролиферативными заболеваниями с комбинацией генотипов Т2677Т Т3435Т по сравнению с больными, имеющими иные комбинации полиморфных вариантов гена MDR1 в 21 и 26 экзонах. Также было выявлено, что все изученные полиморфизмы гена MRP1 (Т1684С, A1218+8G, C2461-30G) не вносили вклад в формирование лекарственной устойчивости.
В лимфоцитах здоровых людей и больных опкогематологическими заболеваниями исследован уровень функциональной активности Р-гликопротеина и MRP. Сравнение уровня функциональной активности Р-гликопротеина и MRP в контрольной группе и у больных неходжкинскими лимфомами показало достоверно более высокий уровень активностей этих белков у больных. Проведеный анализ связи уровня активности Р-гликопротеина и MRP с исследованными полиморфизмами генов MDR1 (С6+139Т, С1236Т, G2677T, С3435Т) и MRP1 (Т1684С, A1218+8G, C2461-30G), соответственно, не выявил достоверных ассоциаций ни в контрольной группе, ни у больных лимфопролиферативными заболеваниями.
Проведенный анализ зависимости уровня активности Р-гликопротеина от применяемых химиопрепаратов не выявил достоверных различий между группами, получающими химиотерапию разной степени агрессивности. Показано, что функциональная активность Р-гликопротеина ассоциирована со степенью злокачественности опухоли: достоверное более высокий уровень активности показан для больных НХЛ с высокой степенью злокачественности.
Было обнаружено, что у больных чувствительных к химиотерапии наблюдается более низкий уровень функциональной активности по сравнению с уровнем активности у больных устойчивых к химиотерапии. Однако эти различия был недостоверными, поэтому уровень функциональной активности Р-гликопротеина в периферической крови не является показателем для прогноза устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями.
Таким образом, результаты исследований показали, что генетический полиморфизм может быть важным фактором, определяющим чувствительность к лекарственной терапии. Выделение групп риска по устойчивости к химиотерапии в соответствии с полученными данными поможет разработать альтернативные схемы фармакологической терапии с учетом известной устойчивости к используемым лекарственным средствам. Однако было бы неверно пытаться объяснить все взаимосвязи только участием фермента GSTP1 и АТФ-зависимых транспортных белков в метаболизме ксенобиотиков. Возможен вклад других генетических маркеров в развитие лимфопролиферативных заболеваний и формирование лекарственной устойчивости. Поэтому необходим поиск факторов риска среди других полиморфизмов изучаемых генов, а также других генов (в первую очередь CYP3A4), участвующих в процессах биотрансформации ксенобиотиков, с целью расширения перечня потенциальных генов-кандидатов и выявления сочетания генотипов, которые будут основой для формирования групп риска.
Помимо этого, различные однонуклеотидные замены в гене могут приводить к изменению уровня экспрессии генов, структуры и функции белков. Поэтому важно продолжить изучение совместного влияния полиморфизмов генов GSTP1, MDR1 и MRP1, уровня экспрессии белков и их функциональной активности как на предрасположенность к заболеваниям, так и на формирование лекарственной устойчивости.
