Содержание к диссертации
Введение
Структурно-функциональные особенности протон-транспортирующйх мембранных венков 6
I. Бактериородопсин 7
II. Протоннаф А'Шаза (Н+-АТФаза) 18
III. Трансгидрогеназа 29
IV. Цитохромоксидаза 35
Результаты и обсуждение 43
I. Изучение функциональной роли остатков тирозина 43
II. Роль отдельных участков полипептидной цепи бактериородопсина в восстановлении его нативной структуры 59
Экспериментальная часть 65
I. Выделение пурпурных мембран 65
II. Делипидирование бактериородопсина 66
III. Химическая и ферментативная модификация белка 66
1. Восстановительное метилирование 66
2. Сукцинилирование 67
3. Протеолиз бактериородопсина 67
4. Нитрование бактериоопсина 67
5. Восстановление нитрованного бактерио-опсина гидросульфитом натрия 68
6. Радиоактивное сукцинилирование остатков аминотирозина в бактериоопсине 68
7. Радиоактивное динитрофенилирование остатков аминотирозина в бактериоопсине 68
ІV. Аминокислотный анализ белка 69
V. Бромциановый гидролиз и разделение пептидов 69
VІ. Аналитический электрофорез в полиакриламидном геле 70
VII. Определение N-концевых аминокислотных остатков и аминокислотной последовательности пептидов 70
VIII. Иммобилизация нитрованного бактериоопсина на носителе, его бромциановый гидролиз и определение N -концевых аминокислотных остатков пептидов, ковалентно связанных с тиол-стеклом... 72
IX. Реконструкция липопротеинового комплекса бактериоро до псина 73
X. Метод резонансного комбинационного рассеяния (РКР) 75
Выводы 77
Литература 78
- Протоннаф А'Шаза (Н+-АТФаза)
- Роль отдельных участков полипептидной цепи бактериородопсина в восстановлении его нативной структуры
- Определение N-концевых аминокислотных остатков и аминокислотной последовательности пептидов
- Реконструкция липопротеинового комплекса бактериоро до псина
Введение к работе
В современной физико-химической биологии особое место занимают структурно-функциональные исследования интегральных мембранных белков.
Открытый более десяти лет назад, простейший из известных в настоящее время биологический преобразователь энергии света бактериородопсин, в настоящее время стал одним из наиболее хорошо изученных мембранных белков и до сих пор остается предметом интенсивных исследований. Установлено, что этот белок работает в мембране по принципу управляемого светом протонного насоса, создающего значительный рН-градиент, используемый для синтеза АТ и обеспечения других жизненно важных функций бактерий.
К началу настоящей работы, являющейся частью структурно-функциональных исследований бактериородопсина, проводимых в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР, была установлена первичная структура белка и предложена модель организации его полипептидной цепи в пурпурной мембране.
На сегодняшний день накоплено огромное количество данных о структуре и механизме действия бактериородопсина, но вопросы о первичных реакциях переноса протона и о природе протон-. проводящего пути через мембрану остаются открытыми.
• Для понимания молекулярных механизмов трансмембранного переноса протонов важное значение имеет исследование микро-окружения хромофора, а также выявление роли отдельных группировок белковой молекулы, играющих важную роль в процессе функционирования бактериородопсина. Целью настоящей работы явилось исследование функциональной значимости аминокислотных остатков тирозина и лизина в полипептидной цепи бактерио-родопсина с помощью различных физико-химических методов анализа.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю работы академику Ю.А.Овчинникову за предоставленную возможность работать, за постоянную поддержку и внимание.
Глубокую благодарность автор выражает А.В.Киселеву, Н.Г.Абдулаеву, М.Ю.Фейгиной, Н.Н.Хорошиловой, И.Р.Набиеву, Р.Г.Ефремову, Н.М.Чихляевой. за помощь и консультации в процессе работы и обсуждении полученных результатов.
Протоннаф А'Шаза (Н+-АТФаза)
Существенно отметить, что световая изомеризация ретиналя во время фотоцикла является необходимым условием работы бактериородопсина как протонного переносчика 32,ЗЗУ. По-видимому, на стадии фотоизомеризации хромофора световая энергия запасается в форме энергии разделенных внутри белковой глобулы зарядов. Альдимии ретиналя в молекуле бактериородопсина может выполнять своего рода роль "чаиночного" механизма между двумя белковыми проводниками протонов, один из которых сообщается с внешней, другой с цитоплазматической поверхностью пурпурной мембраны. Перенос ионов водорода через мембрану скорее всего осуществляется по цепочке водородных связей, образованной боковыми радикалами гидрофильных аминокислот, а движущей силой этого переноса служит электрическое поле, возникающее в результате фотоиндуци-рованного разделения зарядов в активном центре бактериородопсина. В настоящее время природа протон-проводящего пути бактериородопсина интенсивно изучается. Имеются данные об участии в переносе ионов водорода аминокислотных остатков тирозина и остатков с отрицательно заряженными боковыми радикалами Г 34-39J, в то же время свободные аминокислотные остатки лизина не являются компонентами протон-проводящего пути через пурпурную мембрану / 40_/.
Мембрано-связанный АТФ синтезирующий комплекс митохондрий /"41 У, хлоропластов /"42 У, хроматофоров и цитоплазматических мембран бактерий /"43 J состоит по меньшей мере из двух структурно и функционально различных частей - фактора х и фактора Fo Фактор Fjпредставляет собой наружную часть комплекса со свойствами характерными для периферических мембранных белков и обладает АТФ гидролитической активностью. Полностью погруженный в мембранный матрикс компонент Н+-АТФазы- фактор F - обеспечивает транслокацию ионов водорода через мембрану. Часто выделяют еще одну часть комплекса Н+-АТФазы, называемую "шлюзом", которая обеспечивает присоединение FI к FQ И регулирует направление транспорта протонов / 44_7. В целом структуру комплекса Н+-АТФазы можно представить на примере АТФазы из термофильных бактерий PS3 , которая к настоящему времени является наиболее хорошо изученной f44 J. Схема организации этого комплекса и стадии его реконструкции представлены на рис.6. Вполне вероятно, что Н+-АТФазы выделенные из друтих источников организованы подобным образом, так как все они проявляют значительное сходство в морфологии, в энзиматических и молекулярных свойствах [ 41J,
АТФазы ("насоса") осуществляется, как правило, с применением детергентов. Показано, что наиболее эффективно АТФазный комплекс соллюбилизируется тритоном XI00, лубролом, холатом и дезоксихолатом [ AbJ. Соотношение детергент /белок для холата, дезоксихолата и тритона XI00, составляет обычно 2,5/1. Ионные детергенты также используются для экстракции Н+-АТФазы, однако для сохранения активного комплекса F0FI ИХ концентрация должна быть весьма низкой / 44_7.
Для дальнейшей очистки АТФазног.о комплекса из полученных экстрактов, используются разнообразные методы фракционирования: центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография, гель-фильтрация. Если.комплекс соллюбилизирован в растворах не-ионных детергентов, то выделение проводится ионообменной хроматографией на ДЕАЕ и КМ-целлюлозах /"44_7. В случае холатного экстракта Н+-АТФаза высаливается 45% насыщением сульфата аммония /"46J7. Освобождение от избытка детергента достигается исчерпывающим диализом, либо гель-фильтрацией. Очищенный комплекс FQFJ АТФазы содержит некоторое количество связанных липидов и детергента и, будучи встроенным в липосомы сохраняет свою функциональную активность. Критерием целостного состояния комплекса FQFJ,служит его иммуноспецифичность и чувствительность к антибиотикам /"47./.
Соллюбилизация наружной части Н+-АТФазы - FZ достигается при действии на мембраны ионной силы, рН, хаотропных и хела-тропных агентов. При обработке митохондриальной мембраны хао-тропными агентами (2М NascN; 2М Nacio4; 2,25 М мочевина или 0,5 М гуанидингидрохлорид) освобождается около 40% всех мембранных белков и полностью FjfAQj. Для отделения FI от мембран бактерий и хлоропластов используется отмывание растворами с понижающейся ионной силой или буферами содержащими,ЭДТА /"42, 49./. По-видимому,двухвалентные ИОНЫ - Мд++, Са++ являются необходимыми для образования своеобразного мостика, соединяющего анионные участки х и F0 /"43./.
Для экстракции FX применяют и органические растворители, однако их использование может приводить к частичной денатурации белка. Понижение температуры растворителя и уменьшение времени экстракции позволяют в некоторых случаях значительно снизить степень такой денатурации из фотосинтетических бактерий и хлорошгастов легко экстрагируется холодным ацетоном и полученные препараты не обнаруживают отличий от FZ/выделенного другими методами [ 50 _/. Удобным методом получения F! из любого источника является экстракция смесью " вода/хлороформ. Вместо хлороформа могут использоваться диэтилоный эфир, четыреххлористый утлерод и изооктан /" 51 _7.
Дальнейшая очистка FI из полученных экстрактов осуществляется зональным центрифугированием в градиенте плотности, гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией. Очень эффективным методом очистки FI является аффинная хроматография на ДЦФ-сефарозе /"52, 53 7 После отделения F . из АТФазного комплекса, оставшийся в мембране компонент FQ экстрагируется либо растворами детергентов, либо органическими растворителями. FQ из митохондрий и бактериальных мембран экстрагировался системой хлороформчмета-нол /"54-56/, а из хлорошгастов н-бутанолом [ Ы ]. Для отделения FQ от липидного материала проводилось фракционирование полученных экстрактов на сефадексе ьН-20 /"54У,сефарозе сь_4В [ 55 J, ДЕАЕ целлюлозе [ 56 J или КМ-целлюлозе [ 58 J в присутствии органических растворителей.
Роль отдельных участков полипептидной цепи бактериородопсина в восстановлении его нативной структуры
Ранее было показано [ 22 _/, что при восстановительном метилировании формальдегидом и цианоборгидридом натрия модифицируются все свободные -аминогруппы остатка лизина бактерио-родопсина, и при этом суммарный заряд белковой глобулы не изменяется. Напротив, в сукцинилированном белке шесть положительных зарядов заменены на шесть отрицательных, вследствии чего имеет место значительное изменение суммарного заряда бактериоопсина.
Полипептидные цепи бактериородопсина и его модифицированных производных освобождали от липидов и ретиналя, денатурировали 98$ муравьной кислотой, добавляли этанол и после нейтрализации до рН 6.0 концентрированным раствором аммиака диализовали против 1% раствора ДСН.
К растворам бактериоопсина добавляли фосфатидилхолин и ретиналь и инкубировали в темноте при комнатной температуре. Через, два часа в модифицированном и метилированном препаратах наблюдалось образование цветного комплекса, тогда как сукцинили-рованный образец сохранял светло-желтую окраску, характерную для раствора свободного ретиналя.
Исследования спектров поглощения реконструированных комплексов показали, что модифицированный и метилированный препараты практически не отличаются друг от друга (рис.19). Они имеют максимум поглощения при 500 нм и хорошо выраженное плечо при 560 нм. В случае сукцинилированного бактериородопсина также наблюдался максимум при 500 нм, но степень реконструкции составляла лишь приблизительно 10$ от степени реконструкции немодифи-цированного и метилированного препаратов.
Согласно предложенной модели пространственной организации полипептидной цепи бактериородонсина в мембране (см.рие.5,сД7), все аминокислотные остатки лизина, за исключением хромофор-свя-зывающего центра, расположены близко к поверхности мембраны и могут, следовательно, взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными и сульфатными группами липидов, а также кислых аминокислот, стабилизируя структуру пурпурной мембраны. Это предположение нашло экспериментальное подтверждение в настоящей работе, позволяющей заключить, что аминокислотные остатки лизина бактериородонсина выполняют структурную роль. Положительный заряд на -аминогруппе остатков лизина является существенным элементом для процесса самосборки биологически активного бактериородонсина в липопротеиновом комплексе.
Следующим этапом работы явилось изучение роли С-концевого участка полипептидной цепи бактериородопсина в восстановлении его нативной структуры. Согласно одной из гипотез о механизме биогенеза мембран, так называемой имембрано-триггернойи гипотезе, сборка мембранной полипептидной цепи осуществляется за счет энергии, выделяемой при изменении конформации макромолекулы в процессе ее перехода из водного окружения в липидное. В рамках этой и других моделей мембранные полипептидные цепи должны обладать специфическими участками аминокислотных последовательностей, которые определяют конформацию белка, благоприятствующую его встраиванию в липидную мембрану»
С этой точки зрения было интересно выяснить, играет ли С-концевой фрагмент бактериородопсина какую-либо роль в формировании нативной структуры белка из полностью денатурированного состояния.
С-концевой фрагмент бактериородопсина, состоящий из семнадцати аминокислотных остатков, обладает весьма специфическими свойствами. Этот участок составляет 7% полипептидной цепи и содержат 25% аминокислотных остатков бактериородопсина с отрицательно заряженными боковыми радикалами.
Изучили процесс реконструкции бактериоопсина и его аналога, полученного в результате отщепления от бактериородопсина в пурпурной мембране папаином ТҐ С-концевых аминокислотных остатков.
Как видно из рис.20, кинетика и степень восстановления нативной структуры липопротеинового комплекса белка и его модифицированного производного были абсолютно идентичны, что позволило с достаточным основанием заключить: С-концевой гидрофильный фрагмент белка не играет роли в процессе формирования третичной структуры бактериродопсина. Функциональная роль С-концевого домена бэктериородопсина на сегодняшний день остается невыясненной. Возможно, этот участок полипептидной цепи является своего рода "якорем" для взаимодействия с ферментами цитоплазмы галофильной бактерии, активность которых может регулироваться светом через создаваемый бактериродопсином трансмембранный электрохимический градиент ионов водорода. Это предположение кажется вполне реальным, так как в литературе имеются указания на существование специфических взаимодействий между белками мембран и цитоплазмы: по крайней мере в случае зрительного родопсина и так называемой "полосы 3" эритроцитов.
Определение N-концевых аминокислотных остатков и аминокислотной последовательности пептидов
Метилированный бактериоопсин подвергали реакции нитрования и восстановления гидросульфитом натрия, как описано в разделе Ш.4 и Ш.5 экспериментальной части диссертации. 200 нмоль белка со степенью модификации 0.2 М аминотиро -зина/м бактериоопсина растворяли в 4 мл ІОмМ фосфатного буфера рН 7.0, содержащего 1% ДСН, затем к белковому раствору добавляли 250 мк Ки 1-фтор-2,4-динитро -;4с - бензола (21 м Ки/ммоль) и реакционную смесь оставляли на 4 часа при комнатной температуре, после чего избыток радиоактивного агента удаляли исчерпывающим диализом против 10 мМ Na-боратного буфера рН 9.5, содержащего 1% ДСН.
Аминокислотный состав (5-Ю нмоль белка) определяли на автоматическом анализаторе Д-500 (Durrum, (Ж) после кислотного гидролиза в 5.7 н HCI, содержащей 0,1$ фенола, в течение 20 часов при Ю5С в вакууме. пептидов Белок высаживали из раствора детергента при добавлении 9-ти кратного объема безводного ацетона, растворяли в 80$ муравьиной кислоте и добавляли пятитысячный мольный избыток cNBr. Гидролизат оставляли в темноте при комнатной температуре на 24 часа. Разделение бромциановых пептидов осуществляй гель-фильтрацией на колонке (1.5 х 100 см) с фракционированным (фракция, оседающаяся за 30 мин при высоте водного столба 18 см) биогелем Р-30 (віо-Rad, США), уравновешенным 80$ муравьиной кислотой. Скорость элюирования составляла 3 мл/час. Детекцию пептидов проводили при 280 нм с помощью unicord її (LKB, Швеция), радиоактивность определяли на счетчике после добавления соответствующей аликвоты в сцинтиллятор. Бактериородопсин и продукт его ферментативного расщепления анализировали с помощью электрофореза на пластинках с экспоненциальным ГраДИеНТОМ ГЄЛЯ РАА 4/30 (Farmacia, Швеция) , В 0.05 М натрий фосфатном буфере рН 7.0 в присутствии 0.1$ ДОН. Время электрофореза - 3,5 часа, v-ЮО вольт, і - 80 мА. Перед нанесением на гель, мембраны растворяли в 0.005 м натрийфосфатном буфере рН 7.0, содержащем 1% ДСН, 0,1$ меркаптоэтанола, Ъ% сахарозы 0.01% бромфенолового синего. Обычно на гель наносили 1-Ю мкл раствора, содержащего 1-Ю мкг исследуемого белка. Окрашивание пластинок проводили 0.25$ раствором Куммаси R-250 в системе метанол-уксусная кислота - вода (23:23:4) в течении 12-24 часов. Отмывание красителя осуществляй в той же среде. Раствор 1-5 нмоль пептида помещали в ампулу, уперивали в вакууме при 40С и добавляли 15,мкл 0.1 н раствора иансо3 и равный объем дансилхлорида в ацетоне / 6 мг/мл /. Реакционную смесь выдерживали I ч. при 37С. По окончании реакции содержание ампулы высушивали в вакууме, к сухому остатку добавляли 50 мкл 5.7 н неї, раствор замораживали, из ампулы откачивали воздух на масляном насосе, запаивали и проводили гидролиз в течении 12-13 часов при Ю8-П0С. Гидролизат упаривали при 60С, к сухому остатку добавляли воду и упаривали досуха. Остаток растворяли в ацетоне и использовали для хроматографического анализа. Данеильные производные аминокислот идентифицировали двумя способами: двумерной микротонкослойной хроматографии на силика-геле марки КСК / Салават / и на полиамиде G1700 (Schleicher & Schull, ФРГ). Двумерную хроматографию на пластинках с закрепленным слоем силикагеля / 6 х 6 см / проводили в следующих системах: І.аце-тон-изопропанол-25# ш4он /9:7:0.5/ и /9:7:0.7/, первое направление; хлороформ-бензиловый спирт-этилацетат-уксусная кислота /6:4:5:0.2/, второе направление; П. ацетон-изопропанол-25# NH4OH /9:7:2/ и /9:7:3/, первое направление; хлороформ-бензиловый спирт-метанол-уксусная кислота /5:4:1:1/, второе направление. Двумерную хроматографию в тонком слое полиамида проводили в следующих системах: 1.5$ муравьиная кислота, первое направление; бензол-уксусная кислота /9:1/ и этилацетат-уксусная кислота-метанол /20:1:1/, второе направление. Деградацию пептидов проводили по методу Эдмана ( идентификацией аминокислот в виде дансильных производных / 179 / К 5-Ю нмоль пептида добавляли 30 мкл 50$ водного пиридина и такой же объем 5% раствора фенилизотиоцианата в пиридине.Реакционную смесь охлаждали смесью сухого, льда и ацетона, или жидким азотом, вакуумировали, заполняли инертным газом и термо-статировали при 45С в течение часа, затем упаривали в вакууме 30 мин. при 60С. К сухому остатку добавляли 40 мкл трифтор-уксусной кислоты и после заполнения реакционной ампулы аргоном выдерживали 30 мин. при 45С. По окончании реакции кислоту отгоняли в вакууме, остаток растворяли в 30 мкл воды и дважды экстрагировали етилацетатом по 50 мкл. Водную фазу высушивали, добавляли 50 мкл 50$ водного пиридина и отбирали аликвоту для дансилирования. Остаток высушивали и подвергали следующему циклу деградации.
Реконструкция липопротеинового комплекса бактериоро до псина
После модификации метилированного бактериоопсина ТНМ (13 мг белка со степенью модификации 0.3 М нитротирозина/м бактериоопсина) и восстановления остатков нитротирозина до аминотирозина гидросульфитом натрия, белок переводили в 0.5 м натрийборатный буфер рН 8.5, содержащий 1% ДСН. Далее проводили амидирование остатков аминотирозина добавлением 50 мг диметил--3,3 дитиобиспропионоимидата, растворенного в том же буфере. Модифицированный бактериоопсин освобождали от избытка реагента диализом против буфера и s-s группу бифункционального имидата восстанавливали двадцатикратным избытком дитиотретола. После восстановления белок обессоливали на колонке с биогелем Р-2, уравновешенным 0.1 М Na-ацетатным буфером рН 4.0, содержащим I % ДСН и 3 мМ натриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты.
Для иммобилизации ІЗ мг белка с селективно введенными по остаткам аминотирозина SH -группами было взято 250 мг активированного тиол-стекла. Иммобилизацию проводили во вращающемся флаконе в атмосфере азота в течение 12 часов при 25С.
Стекло с иммобилизованным белком последовательно промывали буфером, метанолом, раствором хлорофом:метанола (2:1 по объему), метанолом, концентрированной муравьиной кислотой, водой, метанолом и высушивали на воздухе. Расщепление иммобилизованного белка по остаткам метионина проводили в 80% муравьиной кислоте в темноте, в течение 24 часов при 20С с помощью 500-кратного мольного избытка сывг. После окончания реакции стекло последовательно промывали 80% муравьиной кислотой, водой, метанолом и высушивали на воздухе N-концевой анализ иммобилизованных на стекле пептидов проводили следующим образом: 20 мг сухого носителя, содержащего около 3 нм иммобилизованных пептидов, обрабатывали дансилхлори-дом в соответствии /"177, 1787. После дансилирования избыток реагента удаляли промыванием носителя ацетоном, метанолом, после чего высушивали на воздухе. Сухой материал подвергали кислотному гидролизу и даисиламинокислотн идентифицировали тонкослойной хроматографией (см.раздел УП Экспериментальной части). Реконструкция липопротеинового комплекса бактериородопоина Реконструкция бактериородопоина и его модифицированных производных проводили по методике [ 172 _/. Пурпурные мембраны (см.рис.2І), содержащие бактериородопсин і или его модифицированные онсдаа определяли по данным аминокислотного анализа и спектрометрически до поглощению при 280 нм/ 280 65«IG3 / 176 / Далее к раствору добавляли L - -фосфатидилхолин и полно-стьвьтранс-ретиналь в соотношении 0.4 мг бактериоопсина : 27 мг ливдда, растворенного в 1,35 мл 2% холата натрия : 4 х Ю 3мг ретішаля, растворенного в абсолютном этаноле. Смесь инкубировали в темноте при комнатной температуре в течении двух часов. Реконструкцию различных образцов сравнивали по поглощению при 500 нм на спектрофотометре (весктап, АВСТРИЯ). аналоги,делипвдировали как описано раньше (см.раздел П). Полученный бактерио-опсин растворяли в концентрированной муравьиной кислоте, добавляли два объема этанола, нейтрализовали до рН 6,0 концентрированным водным аммиаком и диализо-вали в течение двух суток против 10 мМ Na-фосфатного буфера рН 6.7, содержащего 1% ДСН. Концентрацию бактерио Спектры РКР нитрованного бактериоопсина с различными степенями модификации и кинетические спектры РКР липопротеино-вых комплексов были получены на лазерном Раман спектрометре ("Bruket" RTI 30-06, Франция) с тройным монохроматором на вогнутых галографических решетках. Для возбуждения спектров ЕКР использовались ЛНВЯИ 454.5, 457.9 и 488.0 им дг+-лазера "spectraphysics" модели 164-03 /США/. Спектры FKP накапливались в аналоговом режиме и обрабатывались с помощью компыо/ тера "Apple" її /США/. При получении кривых титрования нитрованного бактериоопсина по рН в качестве внутреннего репера интегральной интенсивности в спектрах РКР использовалась полоса 1460 см" 1 этиленгликоля. Концентрация белка составляла 1-Змг/мл. Резонансную метку-нитротирозин изучали из анализа частот и интенсивностью полос симметричных колебаний нитрогруппы -1340 см" 1 в спектрах РКР. При получении кинетических спектров РКР липопротеиновых комплексов реконструированного бактериородопсина и нативных мембран использовалась конструкция установки, описанная в работе Г173 У. При вращении кюветы о внешним диаметром 2 см со скоростью 100 об/с и фокосировке лазерного луча до диаметра 100 мкм (см.рис.22) получаются кинетические спектры с временным разрешением 10 мкс. Такое временное разрешение позволяет изучать зависимость скорости образования формы M4j2 от Рн и получать величины рК светоиндуцированного депротонирования альди-мина ретиналя бактериородопсина,
