Введение к работе
Актуальность проблемы. Экспериментальные подходы в рамках классической витаминологии, изучающей изменения, происходящие при недостаточности витаминов в организме или при дополнительном их введении, позволили обнаружить широкий спектр биологического действия таких жирорастворимых витаминов, как A. D и Е- Однако, вопрос о молекулярных механизмах их действия остается открытым, что заставляет исследователей применять нетрадиционные методы и подходы. Одниы из новых методологических подходов,подучившим достаточно большое распространение за последние годы, является изучение витаминсвя-зываших белков.
Согласно современным представлениям, процессы всасывания в хззлудочно-кишечном тракте витаминов, их транспорта с кровью и через биологические мембраны, проявление их" коферментной я некоферментной функции осуществляется при участии специфических белков [Хадмурадов А. Г. и др. , 19803. Допускается, что изучение биохимических'свойств и функций виташшсвязываювдх белков и особенности процесса связывания ими лигандов позволит ответить на вопрос о молекулярных механизмах действия жирорастворимых витаминов в клетке.
В 1992 году исполняется 70 лет со времени открытия витамина Е, однако механизм его биологического действия до сих пор окончательно не установлен. В настоящее время накоплен обширный экспериментальный материал о широком спектре биологического действия витамина Е, для объяснения которого привлекается целый ряд гипотез [Афанасьев И, И. и др. , 1987; Бурлакова Е. Б. и др. , 1975; Лонченко Г.К , 1988; Ерин А. Р. и др., 19873. В то ж- время данные о витамин Е-связывающих белках носят поверх-. ностный характер, фрагментарны и касаются а основном вопросов особенностей связывания витамина Е с различными биологическими структурами EHausvfirth et al. , 1972; Nair et al. , 1978; Patnaik et al. , 1975, 1977, 19813. Вопрос о функциях этих белков остается открытым.
Учитывая множественность и разнообразие воздействия на клетку витамина Е, по нашему мнению, лишь исследование токофе-родсвязывакших белков позволит вычленить из большого разнообразия функций витамина Е его специфические функции, проявление
- г -
которых не может быть заменено другими антиоксидантами или веществами-стабилизаторами биологических мембран.
Особую важность для выяснения специфических функций вита
мина Е имеют данные литературы о его способности связываться с
клеточными ядрами и их компонентами CMatsuura et al., 1978;
Patnaik, 1981]. Именно ядро является местом хранения генети
ческой информации клетки, обуславливающей особенности его
Функционирования. Исходя из имеющихся данных о способности
о-токоферола связываться с хроматином [Matsuura et al-, 1978;
Patnaik, 1981] и ядерным матриксом [Колосова и. Г. и др. , 1990]
и влиять на процессы транскрипции [Паливода О. М. и др. , 1981;
Guarnieri et al. , 1980], можно предположить, что исследование
ядерных токоферолсвязывающих белков может, с одной стороны,
быть очень полезным для выяснения специфичности действия «^-то
коферола, а с другой - способствовать более глубокому понима
нию процессов функционирования клеточного ядра, поскольку,
согласно современным представлениям, именно белки хроматина и
ядерного матрикса играют важную роль в. р'егуляции дифференци
альной активности генома [Георгиев Г. Е ,' 1989; Збарский И. Б. ,
1988J. ' : : :
Однако, из имеющихся на настоящий момент данных литературы о способности ^-токоферола взаимодействовать с клеточными ядрами нельзя сделать однозначный вывод о том, является ли оно специфичным. Не выяснены также вопросы, касающиеся особенностей субъядерной локализации (/-токоферола и^токоферолсвязы-ваюших белков, а также выполняемых ими функций в составе клеточного ядра.
Попытка решить указанные проблемы и обусловила цели нашего исследования.
Дель и задачи исследования. Основной целью работы является изучение специфичности взаимодействияе^гтокоферола с изолированными ядрами и внутриядерными структурами печени крыс и выяснение возможности влияния витамина Е и витамин Е-свягьва-кзщих белков на процессы транскрипции. Конкретные задачи исследования были сформулированы следующим образом:
1. Изучить особенности и специфичность связывания ГНЬвС -токоферола с изолированными ядрами печени крыс.
. Исследовать oL-токоферолсвязываюшую способность различ-
них субъядерных фракций и выяснить, какие белки этих фракций участвуют в специфическом связывании витамина Е.
3. З&іяснить возможное влияние ^-токоферола ка РНК-полимеразную реакцию в системе in vitro и участие в этом процессе оС-токоферодсвязываюаздх белков.
Научная новизна. Показано, что связывание свободного [ Ш -/-токоФерола с изолированными ядрами печени крыс имеет неспецифический характер. Специфическое связывание проявляется лишь при при обработке ядер тритоном Х-100 или при до- бавлений в инкубационную среду цитозоля печени.
Несмотря на то," что при инкубации изолированных ядер с меченым лигандом, значительная часть последнего неспецифическим образом сорбируется на гидрофобных компонентах мембраны, в.то ж время в экстракте ядер 1% тритоном Х-100 присутствует белковая фракция, способная специфически связывать [^Ю-/.-токоферол. Эта белковая фракция была выделена и частично очищена с использованием адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите и ионообменной хроматографии на колонке Mono Q.
Обнаружены места специфического связывания [НЗ-/.-токоферола в составе хроматина. При центрифугировании предварительно инкубированного с меченым лигандом хроматика в градиенте плотности сахарозы показано, что для взаимодействия витамина Е с хроматином in vitro необходимо сохранение высших порядков уровня упаковки хроматина.
Установлено достоверное снижение РНК-полимеразной активности в ядрах и ядерном матриксе печени витамин Е-недостаточ-ных крыс по сравнению с контролем. Обнаружены различия во влиянии выделенной нами-фракции 1, специфически связывающей «(гто-коФерол, на РНК-полимеразную активность хроматина'печени нормальных и витамин Е-недостзточных крыс. Показано, что для проявления действия витамина Е на РНК-полимеразную активность in vitro необходимо наличие комплекса «С-токоферол-белок.
Полученные данные позволяют предположить, что витамин Е способен оказывать влияние на функции клеточного ядра, связанные с реализацией наследственной информации.
^ЕШ±Ш9}?^. ШШ9?1Ъ Полученные. результаты. пьк-глл'.г
- 4 -важное теоретическое значение как для понимания функций витамина Е в клетке, так и для выяснения-механизмовфункционирования клеточного ядра, могут быть использованы для исследования процессов, происходящих при недостаточности витамина Ев ' организме. Принимая во внимание тот факт, что с витамин Е-недостаточностью связано значительное число патологий, в дальнейшем полученные данные могут быть использованы в медицине и сельском хозяйстве при разработке методов диагностики и лечения патологий, связанных с дефицитом витамина Е.
Апробация работа Основные положения диссертационной работы, обсуждались на Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Пушино,1984; Черноголовка 1987; Гродно 1990), на III Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1990), на конференции молодых исследователей " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Моск-ва,1990), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторних систем" (Таллин,1990), а также на конференции молодых ученых Института биохимии им. А.В. Палладина„,АЕ,УССР (Киев, 1989).
Цубликации. JbjgjejpnagiM диссертации опубликовано 11 ра
бот. _
Структура и объем работы, диссертационная работа состоит из введения, семи глав, включающих обзор литературы, описание примененных методов исследования, полученных результатов, а также из. заключения, выводов и списка литературы ( 300 наименований, из них 87 отечественных и 213 иностранных авторов). Работа изложена на 148 страницах машинописного текста (без списка литературы) и иллюстрирована з таблицами и 34 рисунками.
