Содержание к диссертации
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Анализ основных клинико-лабораторных показателей исследованной группы больных 52
Характеристика препаратов, полученных при окрашивании контрольных образцов ткани печени по методу TUNEL 57
Характеристика препаратов печени больных ХВГ В и С при окрашивании по методу TUNEL 60
Результаты иммуногистохимического исследования уровня экспрессии белков Fas и FasL в контрольных образцах ткани печени 65
Результаты иммуногистохимического исследования уровня экспрессии белков Fas и FasL в препаратах биоптатов печени больных ХВГ В и С 67
Обсуждение результатов исследования уровня апоптоза и уровня экспрессии белков Fas и FasL в ткани печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С 75
Исследование динамики спонтанного апоптоза лейкоцитов периферической крови при культивировании in vitro в течение суток 84
Исследование уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С непосредственно после выделения и после культивирования in vitro в течение суток 86
Сравнение уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С со степенью повреждения ДНК этих клеток 92
Анализ взаимосвязи уровня апоптоза свежевыделенных и культивированных in vitro в течение суток мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови и степени повреждения ДНК этих клеток у больных ХВГ В и С 95
Исследование взаимосвязи между уровнем апоптоза ЛПК больных ХВГ В и С и основными биохимическими (лабораторными) характеристиками крови этих больных 102
Обсуждение результатов исследования уровня апоптоза и степени повреждения ДНК
лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С 104
ПРИЛОЖЕНИЕ 126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
APES - aminopropyltriethoxysilane, аминопропилтриэтоксисилан
FADD - Fas-associated death domain, домен смерти, связанный с
рецептором Fas Fas (АРО-1, CD95) - белок клеточной поверхности
FasL - Fas ligand, Fas-лиганд
gld - generalized limphoprolipherative disease, мыши с
мутантным геном FasL, имеющие конститутивные аутоиммунные лимфопролиферативные заболевания НВУ - hepatitis В virus, вирус гепатита В
HCV - hepatitis С virus, вирус гепатита С
ICE - interleukin ip-converting enzyme, протеазы, участвующие в
образовании интерлейкина ip
limphoproliferation, мыши с мугантным геном Fas, имеющие конститутивные аутоиммунные
лимфопролиферативные заболевания major histocompatibility complex, главный комплекс гистосовместимости
transforming growth factor, трансформирующий фактор роста
Т helper lymphocytes, Т-лимфоциты-хелперы
tumor necrosis factor, фактор некроза опухолей
tumor necrosis factor receptor, рецептор фактора некроза
опухолей
TNF receptor-associated death domain, домен смерти, связанный с рецептором TNF
TGF -
Th- TNF - TNFR -
TRADD-
TUNEL-
Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling, метод детекции апоптоза, при котором происходит введение метки - дезоксиуридинтри фосфата - по свободным З'-ОН-концам в ДНК с помощью фермента концевой дезоксирибонуклеотидилтрансферазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы широким кругом специалистов ведется интенсивное изучение проблемы хронических вирусных гепатитов В и С (ХВГ В и С), которая приобретает социальную значимость ввиду широкого распространения этих заболеваний, роста заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, тяжести осложнений в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и отсутствия эффективных методов лечения. Применение современных методов молекулярной и клеточной биологии позволило значительно расширить имеющиеся представления о биологии вирусов гепатита В и С (HBV, HCY). Так, установление факта репликации вирусов гепатита В и С помимо печени в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХВГ В и С объяснило природу ряда внепеченочных проявлений HBV- и HCV-инфекции [32, 100, 135, 161]. Вместе с тем, многие вопросы патогенеза вирусных гепатитов остаются неясными, в частности, механизмы повреждения гепатоцитов - основной мишени действия вирусов. Долгое время основной формой гибели клеток печени при различных заболеваниях считался некроз. Открытие апоптоза [76] стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени, в результате чего было обнаружено, что апоптоз может играть ведущую роль в развитии острых и хронических вирусных гепатитов [61, 96], а также ряда других заболеваний печени, включая аутоиммунные, лекарственные, алкогольные поражения печени.
При вирусном гепатите апоптоз может быть результатом как прямого повреждающего действия вирусной инфекции (цитопатическое действие), так и опосредованного, развивающегося в результате иммунных реакций. Цитопатическая активность вирусов гепатита В и С проявляется в процессе вирусной репликации в клетке. Традиционно считалось, что вирусы вызывают гибель клеток в результате узурпации механизмов транскрипции и трансляции и разрушения клеточной мембраны, однако в настоящее время не вызывает сомнений, что большая часть вирусов индуцирует апоптоз инфицированной клетки [74, 152].^ Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых вирусы гепатита В и С активируют апоптоз: 1) путем непосредственного проапоптотического действия специфических вирусных белков, образующихся в процессе репликации вируса: X белка вируса гепатита В [77, 115] и кор-белка вируса гепатита С [63, 71]; 2) путем повышения на клеточной мембране тех рецепторов, через которые передается сигнал к индукции апоптоза, например, Fas [61], и увеличения чувствительности клеток к различным проапоптотическим стимулам, в частности, к TNF-a [137, 140, 159]. Таким образом, цитопатическая активность вирусов гепатита В и С проявляется в прямом или косвенном проапоптотическом действии вирусов на инфицированные клетки и вносит существенный
вклад в патогенез поражения печени при вирусных гепатитах.
Другой, и, по-видимому, наиболее существенный, механизм гибели инфицированных гепатоцитов - апоптоз в результате клеточного иммунного ответа, в особенности опосредованного цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Исследования последних лет подтверждают ведущую роль ЦТЛ не только в клиренсе вируса, но и в патогенезе повреждения печени при вирусных гепатитах [26, 80, 119]. ЦТЛ вызывают апоптоз инфицированных клеток с помощью перфорин-гранзимового комплекса и через систему Fas/FasL в результате взаимодействия растворимого или экспрессированного на поверхности активированных лимфоцитов FasL с Fas-рецептором клеток-мишеней, а также нарушают репликацию вируса и экспрессию вирусных белков в инфицированной клетке благодаря секреции ряда цитокинов, в частности интерферона-у и TNF-a [17]. Анализ литературы показал, что система Fas/FasL может играть ведущую роль в повреждении клеток печени при вирусных гепатитах [47, 108], о чем, в частности, свидетельствует обнаружение конститутивной экспрессии белка Fas гепатоцитами и обнаружение в печени пациентов с ХВГ В или С в зонах активного воспаления активированных лимфоцитов, экспрессирующих FasL [55]. Можно полагать, что активация системы Fas/FasL при ХВГ должна приводить к развитию апоптоза значительного числа клеток паренхимы печени. Для подтверждения этого предположения необходимо специальное изучение уровня апоптоза клеток печени в зависимости от уровня экспрессии белков Fas и FasL различными типами клеток в органе.
В понимании патогенеза вирусных гепатитов крайне важным явилось обнаружение репликации вирусов гепатита В и С в лейкоцитах периферической крови (ЛПК) человека. Это позволило рассматривать ЛПК как дополнительную мишень действия вирусов и дополнительный резервуар инфекции. Персистенция HBV и НСУ в этих клетках может стать причиной их поражения в результате индукции апоптоза, что должно привести к нарушению функций иммунной системы. Данные о повреждении при вирусных гепатитах ЛПК как второй мишени действия вирусов практически отсутствуют.
Поэтому целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение роли апоптоза гепатоцитов и системы Fas/FasL взаимодействий в патогенезе ХВГ различной этиологии, а также изучение уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови как показателя инактивации иммунокомпетентных клеток при ХВГ.
В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования:
Исследование уровня апоптоза в ткани печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С in situ.
Исследование уровня экспрессии белков Fas и FasL в ткани печени больных
хроническим вирусным гепатитом В и С.
Изучение взаимосвязи между уровнем апоптоза и уровнем экспрессии белков Fas и FasL в клетках печени больных ХВГ В и С.
Исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХВГ В и С.
Научная новизна. Впервые проведено исследование уровня апоптоза клеток печени и лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С как двух независимых мишеней действия вирусов гепатита В и С.
Впервые изучен уровень апоптоза клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфо- гистиоцитарного инфильтрата) в сравнении с уровнем экспрессии мембранных белков, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL). Выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии FasL лимфоцитов внутрипеченочного инфильтрата и уровнем апоптоза гепатоцитов. Обнаружена защитная роль экспрессии FasL гепатоцитами от апоптоз- индуцирующего действия ЦТЛ.
Впервые проведено одновременное исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК у больных ХВГ В и С. Обнаружено, что у больных ХВГ В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению со здоровыми добровольцами уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК как при изучении апоптоза свежевыделенных клеток, так и спонтанного апоптоза, развивающегося при культивировании клеток in vitro в течение суток. При этом наиболее высокий уровень апоптоза ЛПК наблюдался у больных с виремией и повышенным уровнем сывороточного TNF-a.
Выявлена достоверная корреляционная зависимость степени повреждения ДНК свежевыделенных ЛПК с долей клеток в состоянии апоптоза после их инкубации в культуральной среде в течение 24 часов, что свидетельствует о наличии в периферической крови не только клеток в состоянии апоптоза, но и клеток, коммитированных к нему.
Практическая ценность работы. Обнаруженный высокий уровень апоптоза гепатоцитов при ХВГ В, и особенно ХВГ С, и появление экспрессии FasL на гепатоцитах могут быть использованы в качестве новых критериев для оценки эффективности проводимой противовирусной и иммуномодулирующей терапии ХВГ.
Обнаружено, что регистрация однонитевых разрывов ДНК является тестом для выявления клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза или коммитированных к нему. Показано, что регистрация уровня повреждения ДНК и/или уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных ХВГ В и С является высоко информативным показателем повреждения иммунокомпетентных клеток при этих заболеваниях и может быть использована в клинической практике наряду с исследованием биоптатов печени для оценки тяжести течения ХВГ и оценки эффективности проводимой терапии.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на У-ой и У1-ой Российской конференции «Гепатология сегодня» (март 2000 г., март 2001 г., Москва), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, май-июнь 2000), на III Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, сентябрь 2000), на Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000 г., Санкт-Петербург), межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов (февраль 2001 г., Санкт-Петербург), на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, апрель 2001 г.), Пятой и Шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге » (май 2001 и май 2002 г., Санкт-Петербург), на 8-й Европейской Гастроэнтерологической Неделе (11ЕО\У) (октябрь 2000 г., Брюссель), на Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (октябрь 2001 г., Санкт- Петербург). Апробация работы состоялась на научно-практической конференции кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова 6 февраля 2003 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 1 работа принята в печать.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список цитированной литературы, включающий 161 источник, приложение. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 20 таблицами.
Похожие диссертации на Роль апоптоза в патогенезе заболеваний печени различной этиологии
