Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Анализ потенциальной генотоксичности электромагнитных излучений радиочастотного диапазона 9
1.1.1. Преимущества и недостатки методов, применяемых для исследования генотоксических эффектов РЧ ЭМИ 10
1.1.2. Различные частотные поддиапазоны РЧ ЭМИ и вызываемые ими генотоксические эффекты 12
1.1.2.1. УВЧ 12
1.1.2.2. СВЧ 41
1.1.2.3. КВЧ 47
1.2. Влияние физических и химических факторов на ДНК 53
1.2.1. Ионизирующее излучение 53
1.2.2. Алкилирующие агенты 55
1.2.3. Температурное воздействие 58
1.3. Метод «комета-тест» 59
Глава 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Облучение биологических образцов ИЭМИ СВЧ БПМ и ИЭМИ КВЧ БПМ 64
2.1.1. Реактивы 64
2.1.2. Биологические образцы 64
2.1.3. Облучение ИЭМИ СВЧ БПМ 65
2.1.4. Облучение ИЭМИ КВЧ БПМ 72
2.1.5. Воздействие ионизирующего излучения, алкилирующего агента и температуры 72
2.1.6. Щелочной вариант комета-теста 73
2.1.7. Обработка данных и статистический анализ 75
2.2. Облучение водного раствора ИЭМИ КВЧБПМ 75
2.2.1. Реактивы и растворы 75
2.2.2. Облучение образцов фосфатногобуфера 76
2.2.3. Оценка количества образовавшихся АФК 77
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 78
3.1. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ и ИЭМИКВЧ БПМ на ДНК различных типов клеток in vitro 78
3.1.1. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ на ДНК эритроцитов лягушки 78
3.1.2. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ на ДНК лейкоцитов и лимфоцитов крови человека 83
3.1.3. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ КВЧ БПМ на ДНК лейкоцитов цельной крови мыши 90
3.2. Оценка возможности повреждения ДНК активными формами кислорода, образующимися под действием ИЭМИ КВЧ БПМ 91
3.2.1. Определение продукции АФК в водных растворах под действием ИЭМИ КВЧ БПМ 91
3.2.2. Исследование механизмов образования АФК в водных растворах при облучении ИЭМИ КВЧ БПМ 93
Глава 4. Заключение 101
Выводы 103
Список литературы 104
- Преимущества и недостатки методов, применяемых для исследования генотоксических эффектов РЧ ЭМИ
- Облучение ИЭМИ СВЧ БПМ
- Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ на ДНК эритроцитов лягушки
- Определение продукции АФК в водных растворах под действием ИЭМИ КВЧ БПМ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к биологическому действию импульсных электромагнитных излучений с большой пиковой мощностью (ИЭМИ БПМ) возник сравнительно недавно вслед за созданием и распространением радиолокационных излучающих систем, генерирующих высокомощные электромагнитные импульсы (десятки и сотни кВт) с крайне короткой длительностью (десятки не). При действии таких ЭМИ импульсная напряженность электрического поля в облучаемом биологическом объекте приближается к максимально достижимой из-за близости к величине напряженности пробоя [Albanese et al., 1994; Девятков и др., 2000]. В этих экстремальных условиях можно ожидать наличия прямых генотоксических эффектов ИЭМИ БПМ. Опосредованные механизмы действия ИЭМИ БПМ могут быть обусловлены как увеличением температуры облучаемого объекта, так и термоупругим возбуждением в облучаемом объекте акустических колебаний с последующей поляризацией молекул и образованием свободных радикалов [Guy et al., 1975; Olsen & Lin, 1983], потенциальная генотоксичность которых хорошо известна.
На сегодняшний день работы, в которых было исследовано биологическое действие ИЭМИ БПМ на различные объекты, немногочисленны. Обнаружено, что облучение крыс ИЭМИ БПМ приводит к нарушению их оперантного поведения [Akyel et al., 1991], значительному снижению физической выносливости и изменению когнитивных функций [Raslear et al., 1993], что связывают с нагревом тела животных. Воздействие ИЭМИ БПМ вызывает повреждение изолированного хрусталика глаз крыс [Creighton et al., 1987], уменьшает интервал между сокращениями препаратов сердца лягушки [Pakhomov et al., 2000]. Обнаружено уменьшение скорости роста карциномы Walker у крыс и увеличение средней продолжительности жизни животных-опухоленосителей после in vivo облучения ИЭМИ БПМ [Девятков и др., 1994]. Показано увеличение количества деградирующих опухолевых клеток и опухолевых клеток на стадии лизиса после облучения ИЭМИ БПМ in vitro [Девятков и др., 1998]. Воздействие ИЭМИ БПМ прерывало индивидуальное развитие Drosophila [Bolshakov et al., 2000, 200Г], замедляло рост грибов Fusarium sp. и подавляло скорость синтеза РНК и ДНК в опухолевых клетках мастоцитомы Р-815 [Bolshakov et al., 2000, 2001Ь]. Показано отсутствие специфического действия ИЭМИ БПМ на проводниковую функцию нейронов гиппокампа крыс; переходное и обратимое уменьшение амплитуды спайков было вызвано исключительно увеличением температуры при облучении [Pakhomov et al., 2003]. В настоящее время существуют лишь единичные работы, посвященные исследованию генотоксических эффектов ИЭМИ БПМ на клетках человека и животных. Например, Natarajan et al. [2002] показали, что облучение
7 моноцитов человека ИЭМИ БПМ может увеличивать активность связывания фактора транскрипции NF-кВ с ДНК, что приводит к трансактивации экспрессии генов-мишеней, изменяя тем самым структуру хроматина.
В последние годы большое внимание уделяется оценке генотоксического действия непрерывных и модулированных ЭМИ радиочастотного диапазона (РЧ ЭМИ). В ряде исследований обнаружены индукция повреждений нитей ДНК, увеличение количества дицентрических хромосом, ацентрических участков и микроядер при действии РЧ ЭМИ [Maes et al., 1993; Lai & Singh, 1995; Zotti-Martelli et al., 2000; d'Ambrosio et al., 2002; R.R. Tice et al., 2002]. В то же время, в серии работ показано отсутствие каких-либо прямых мутагенных, генотоксических или карциногенных эффектов РЧ ЭМИ [Brusick, 1998; Verschaeve & Maes 1998; Vijayalaxmi et al., 2000; Li et al., 2001]. Кроме того, в связи с одновременным увеличением содержания в окружающей среде других токсинов очень трудно выделить на их фоне эффекты ИЭМИ БПМ в естественных условиях жизнедеятельности человека. Поэтому обозначенные проблемы должны решаться в условиях контролируемых лабораторных экспериментов.
Из приведенных данных видно, что результаты по оценке генотоксического действия РЧ ЭМИ противоречивы, а работы по исследованию генотоксических эффектов ИЭМИ БПМ практически отсутствуют. Поэтому исследование возможности прямого повреждающего действия ИЭМИ БПМ, не обусловленного нагревом облучаемого объекта, представляет большой научный интерес. Однозначный ответ на вопрос о потенциальной генотоксичности ИЭМИ и знание механизмов действия такого излучения как на клеточном уровне, так и на уровне организма человека и животных позволит разработать научно обоснованные санитарно-гигиенические нормативы для обслуживающего персонала и населения, попадающего в зону действия ИЭМИ.
Цель работы.
Целью диссертационной работы являлось исследование потенциальной генотоксичности импульсных ЭМИ сверхвысоких (СВЧ) и крайне высоких (КВЧ) частот с большой пиковой мощностью (ИЭМИ СВЧ БПМ и ИЭМИ КВЧ БПМ).
Задачи исследования.
1. Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ и ИЭМИ КВЧ БПМ на ДНК различных типов клеток (эритроцитов лягушки, лейкоцитов и лимфоцитов крови человека и лейкоцитов крови мыши) in vitro.
8 2. Оценка возможности повреждения ДНК активными формами кислорода (АФК), образующимися под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.
а) Определение продукции АФК в водных растворах под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.
б) Исследование механизмов образования АФК в водных растворах при облучении ИЭМИ
КВЧ БПМ.
Научная новизна.
Впервые исследовано прямое генотоксическое действие ИЭМИ БПМ на клетках различных биологических объектов. Показано отсутствие индукции повреждений ДНК под действием ИЭМИ для гомойотермних видов (мышь, человек) и увеличение поврежденности ДНК при действии ИЭМИ на клетки животных пойкилотермного вида (лягушка), обусловленное увеличением температуры суспензии облучаемых клеток. В результате модификации метода "комета-тест" была существенно увеличена его чувствительность. Показана возможность применения комета-теста в мониторинговых исследованиях с использованием популяций земноводных на примере эритроцитов лягушки Xenopus laevis.
Установлено, что облучение водных растворов ИЭМИ КВЧ БПМ приводит к образованию в них Н2О2, которая потенциально может вызывать повреждения ДНК в различных клетках. Исследование механизмов образования Н2О2 при облучении показало, что образование Н2О2 в облучаемом ИЭМИ КВЧ БПМ растворе происходит в результате суммарного влияния тепла и возбуждаемых ИЭМИ КВЧ БПМ термоакустических колебаний.
Научно-практическая ценность.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ИЭМИ с параметрами, характерными для современных радиолокационных станций, не обладает прямым генотоксическим действием, что может быть использовано при научном обосновании безопасных санитарно-гигиенических нормативов для обслуживающего персонала и населения, попадающего в зону действия такого излучения.
Преимущества и недостатки методов, применяемых для исследования генотоксических эффектов РЧ ЭМИ
Интенсивное техническое развитие средств связи и телекоммуникаций в последние 10-15 лет привело к резкому возрастанию количества различных источников неионизирующих РЧ ЭМИ. Основные источники РЧ ЭМИ с частотами от 300 МГц до 300 ГГц получили широкое распространение в телерадиовещании, беспроводной связи (в том числе в сотовой телефонии), бытовых областях (СВЧ печи), радиолокации, в медицине и в ряде специальных военных и промышленных отраслей. На сегодняшний день имеются убедительные научные доказательства влияния РЧ ЭМИ на многие биологические процессы, в том числе, на биохимические реакции, процессы синаптической передачи, поведенческие реакции человека и животных, иммунный статус организма [Leonard etal., 1983; Saunders etal., 1991; Григорьев, 1996; Pakhomov etal., 1998; Лушников и др., 2002 и др.]. Вопрос о потенциальной генотоксичности РЧ ЭМИ, несмотря на свою принципиальную важность, до сих пор остается открытым. Опубликованные обзорные работы [Verschaeve & Maes, 1998; Крюков, 2000; Heynick et al., 2003; Meltz, 2003; Vijayalaxmi & Obe, 2004а и др.] отражают скорее субъективную точку зрения авторов, чем направлены на объективную оценку экспериментальных и эпидемиологических исследований генотоксического действия РЧ ЭМИ. Представленный в диссертации анализ более чем 100 экспериментальных работ по исследованию генотоксических эффектов РЧ ЭМИ, опубликованных в рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях в период 1990-2005 гг., показывает, что результаты большинства этих работ ( 55%) свидетельствуют об отсутствии каких-либо генотоксических, мутагенных или канцерогенных изменений в биологических системах после облучения РЧ ЭМИ.
Таким образом, учитывая крайнюю противоречивость опубликованных экспериментальных данных, целью обзора литературы является определение круга проблем, решение которых позволило бы выявить границы параметров РЧ ЭМИ, обладающих потенциальной генотоксичностью. В обзоре будут рассмотрены вопросы о возможности прямого генотоксического действия РЧ ЭМИ и опосредованного, через образование свободных радикалов. Основное внимание будет уделено индукции одно- и двунитевых разрывов цепи ДНК, повреждению хромосом (микроядра и хромосомные аберрации), обмену сестринскими хроматидами, индукции репарационного синтеза ДНК и фенотипических мутаций под действием РЧ ЭМИ. Представленная информация будет систематизирована в соответствии с рассматриваемыми диапазонами частот РЧ ЭМИ: ультравысокочастотный (УВЧ) (0.3-3 ГГц), сверхвысокочастотный (СВЧ) (3-30 ГГц) и крайневысокочастотный (КВЧ) (30-300 ГГц).
Исследования генотоксическнх эффектов РЧ ЭМИ ведутся уже более 30 лет (начиная с работ [Hamrick, 1973; Chen et al., 1974]) на разных уровнях сложности биологических объектов с помощью различных методов. Покажем преимущества и недостатки этих методов. 1. Тест денатурации ДНК позволяет оценить состояние вторичной структуры полинуклеотида iv vitro [Семин и др., 1995]. Недостатком данного метода является то, что анализ проводится на изолированной ДНК. Для работы необходим либо комерческий препарат полинуклеотида, либо необходимо выполнять процедуру выделения ДНК с оценкой качества полученного препарата. 2. Микроядерный (МЯ) тест позволяет дать оценку цитогенетических повреждений клеток гемопоэтического ряда [Schmid, 1975]. Данный метод используется при исследовании потенциальной генотоксичности РЧ ЭМИ как in vitro, так и in vivo. Подсчет количества МЯ и оценка их типов ведется визуально и практически не поддается автоматизации, что требует проведения длительной рутинной работы. 3. Анализ хромосомных аберраций (ХА), таких как транслокации, инсерции, дицентрики, кольца, фрагментации, и анализ обмена сестринскими хроматидами (OCX), т.е. обмена маленькими участками плечей между соседними плечами хромосом, позволяют зафиксировать и оценить степень повреждения хромосом [Olivieri et al., 1984]. Сложностью является необходимость синхронизации клеточного цикла. 4. Относительно недавно разработанный метод "комета-тест" способен регистрировать прямое повреждение ДНК (одно и двунитевые разрывы ДНК, щелочелабильные сайты (апуриновые и апиримидиновые), участки с незавершенной эксцизионной репарацией, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок) [Ostling & Johanson, 1984]. Важно отметить, что для анализа не требуется выделение ДНК, достаточно использовать любые ядросодержащие клетки. Комета-тест высокочувствителен, прост, позволяет одновременно оценивать повреждение ДНК нескольких объектов и быстро (4-5 ч) получать конечный результат. 5. Оценка индукции репарационного синтеза ДНК. Репарационный синтез ДНК может происходить после повреждения основания генотоксическим агентом. Репарационный синтез -это медленный процесс, длящийся 20 ч или более, в зависимости от количества начальных повреждений в клетках, подвергшихся воздействию. Такой репарационный процесс, оцененный по размеру репарационной репликации (repair replication) в уже имеющихся нитях ДНК, предположительно происходит после повреждения оснований ДНК. Отсутствие индукции репарационного синтеза косвенно означает, что агент не повреждает основания ДНК [Meltz et al., 1987]. Поскольку репарационный синтез - это сложный ферментативный процесс, то недостатком данного метода является необходимость строго контролировать условия проведения эксперимента с целью исключить дополнительное, постороннее влияние на активность ферментов. 6. Некоторые исследователи используют нераспространенные методы, например, метод аномальной временной зависимости вязкости (АВЗВ) [Belyaev et al., 1990, 1999]. Этот метод позволяет по изменению коденсации хроматина после воздействия судить об изменении конформации хроматина. Основную сложность при использовании метода АВЗВ представляет необходимость сравнительного анализа полученных результатов с другими широко распространенными методами. 7. Потенциально для оценки генотоксичности может применяться метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладающий высокой чувствительностью и специфичностью. Метод позволяет проводить генодиагностику и генетическую дактилоскопию, генотипировать микроорганизмы, оценивать их вирулентность, определять устойчивость микрофлоры к антибиотикам, диагностировать инфекционные заболевания, в том числе вызванные агентами, трудно поддающимися культивированию и др. ПЦР основан на амплификации геномной ДНК исследуемого объекта с помощью специально подобранного праймера [Welsh et al., 1991]. На сегоднящний день применение метода ПЦР для оценки генотоксического действи РЧ ЭМИ ограничивается высокой себестоимостью метода и наличием сложного этапа подбора и создания праймеров для конкретной задачи. 8. Обнаружение фенотипических мутаций с помощью селекции является важным методом для определения действия генотоксических агентов [Большаков и др., 2002]. К фенотипическим мутациям относятся изменения в морфологии, изменения в свойствах мембраны, изменения ферментативной активности и т.д. Возможности данного метода ограничены диапазоном выбора объекта исследования. При исследовании потенциальной генотоксичности РЧ ЭМИ используются практически все выше указанные методы. Они оценивают как прямые (разрывы ДНК), так и отдаленные последствия воздействия (аберрации, мутации). Исследования выполняются как in vitro, так и in vivo. Генотоксический эффект РЧ ЭМИ оценивается на различных уровнях биологической сложности объекта: изолированная ДНК, клетка (комета-тест, МЯ тест, анализ ХА и OCX), целый организм (фенотипические мутации). Таким образом, сравнение имеющихся в литературе результатов не всегда представляется возможным.
Облучение ИЭМИ СВЧ БПМ
Работы Phillips et al. [1998] и Hook et al. [2004] - это не единичный случай, когда при использовании исследователями одинаковых экспериментальных протоколов, результаты оказывались противоположными. Так, оценка генотоксического потенциала РЧ ЭМИ (837 и 1909.8 МГц) представлена в [Hook et al., 1999; Тісе et al., 2002]. Для обнаружения повреждений ДНК авторы использовали метод комета-тест, а для детекции структурных (ацентрические участки) и количественных повреждений хромосом (запаздывание хромосомы) - МЯ тест. На лимфоцитах крови человека показано, что при РЧ облучении в клетках происходит достоверное увеличение количества МЯ. Оно зависит от времени воздействия, УПМ ( 5 Вт/кг) и типа модуляции. В этих же экспериментальных условиях, но на лейкоцитах, показано отсутствие достоверного увеличения степени повреждения ДНК (ОН), следовательно, в увеличении частоты клеток с МЯ участвуют количественные хромосомные аберрации. Однако подобные процессы в основном происходят, когда агент, индуцирующий повреждения, присутствует при делении клеток, а в работах [Hook et al., 1999; Тісе et al., 2002] облучению подвергались неделящиеся клетки. Авторы предположили, что индукция МЯ является следствием гипертермии, вызванной облучением. Влияние непрерывного и импульсномодулированного РЧ ЭМИ (1.9 ГГц) на изолированные лимфоциты человека было исследовано McNamee et al. [2002a b, 2003], но генотоксический эффект обнаружен не был. Возможно, помимо параметров облучения на результат может влиять и тип колебаний, возбуждаемых в системе, используемой для облучения: поперечная электромагнитная камера у [Phillips et al., 1998; Hook et al., 1999; Tice et al., 2002], радиальная линия трансмиссии у [Hook et al., 2004] и цилиндрический волновод у [McNamee et al., 2002а ь, 2003]. Полученные противоположные результаты могут быть следствием некорректно проведенной дозиметрии.
Способность ЭМИ (830 МГц) вызывать анеуплоидию была оценена в работе [Mashevich et al., 2003]. Анеуплоидия или неравное разделение хромосом во время клеточного деления приводит к присутствию дополнительных хромосом или делеции хромосом в дочерних клетках. Это, в свою очередь, приводит к изменению большого числа генов, обуславливая множественные изменения в экспрессии и функциях генов. Например, присутствие и последствие дополнительной хромосомы известно для людей с синдромом Дауна. Mashevich et al. [2003] показали линейное и УПМ-зависимое увеличение анеуплоидии 17-й хромосомы (6 24 10% при 2.0 - 8.2 Вт/кг УПМ) в облученных РЧ ЭМИ (24 ч) лимфоцитах крови человека по сравнению с «ложно»-облученными ( 4%). Для клеток, содержавшихся при 34.5 - 38.5С, увеличение доли анеуплоидии не показано (4%), в то время как повышение температуры до 40С увеличивало процент анеуплоидных клеток до 8%. Авторы утверждают, что «эти данные показывают, что генотоксический эффект ЭМИ проявляется через нетепловой путь». Vijayalaxmi & Obe [2004а] высказали мнение, что «если 72-ч облучение РЧ излучением может вызывать увеличение анеуплоидии одной хромосомы в 2.5 раза, предположение, которое может быть выведено для остальных 22 пар хромосом чудовищно; основное большинство клеток должно содержать 46+ хромосом и должно содержать МЯ, возникающие при анеуплоидии». Однако результаты нескольких исследований показали отсутствие достоверного увеличения ХА или МЯ в облученных РЧ излучением клетках [Antonopoulos et al., 1997; Maes et al., 1997, 2001; Vijayalaxmi et al., 2001, 2001a b; Skarfi et al., 2002; Zeni et al., 2003, 2005]. В тоже время, работа Mashevich et al. [2003] выполненная на модельной системе, показывает наличие эффекта только для одной хромосомы, причем в конкретных экспериментальных условиях. Экстраполировать данные результаты на остальные хромосомы в клетке и на все клетки в организме некорректно, так как и для разных хромосом, и для различных типов клеток может быть характерна разная чувствительность к действию РЧ ЭМИ.
Методом АВЗВ было выполнено исследование влияния GSM - модулированного РЧ ЭМИ (895 - 915 МГц) на конформацию хроматина в лимфоцитах человека [Sarimov et al., 2004; Belyaev et al., 2005]. Изменение конформации хроматина, которое оценивалось по изменению конденсации хроматина, не является специфическим ответом клеток на раздражитель и может быть вызвано действием различных факторов: температурой, интеркалирующими в ДНК агентами, ингибиторами ДНК-топоизомераз, ЭМИ и ионизирующим излучением. Авторы обнаружили, что в ответ на GSM облучение в зависимости от времени воздействия и от донора происходит конденсация или деконденсация хроматина. Увеличение конденсации подобно, но не идентично ответу на тепловой шок (41С). Деконденсация вызывается ослаблением доменов ДНК, что подтверждено методом комета-тест и анализом ореолов [Belyaev et al. 1999]. Методом иммуноокрашивания показано четкое уменьшение фонового уровня белка 53ВР1, который локализуется по месту двунитевых (ДН) разрывов ДНК [Belyaev et al., 2005], что может быть индикатором отсутствия ДН разрывов ДНК и снижения доступности белка для антител в результате конденсации хроматина, вызванной стрессом. Увеличения температуры при тестируемых параметрах РЧ облучения не происходило, следовательно, обнаруженный эффект нельзя отнести к вызванному нагревом. Результаты, полученные в работах [Sarimov et al., 2004; Belyaev et al., 2005], демонстрирующие отсутствие ДН разрывов ДНК после РЧ облучения, хорошо согласуются с данными других авторов [Maes et al., 2001; Scarfi et al., 2002; Zeni et al., 2003, 2005], которые также не выявили генотоксического действия ЭМИ с частотой 0.9 ГГц. Несмотря на то, что облучение РЧ ЭМИ с параметрами, использованными в работах [Sarimov et al., 2004; Belyaev et al., 2005], не обладает генотоксическими эффектами, делать вывод об отсутствии генотоксичности ЭМИ вообще преждевременно. Результаты Sarimov et al. [2004], в которых продемонстрирована зависимость эффекта от частоты: эффект был наиболее выражен при 905 МГц, представляют особый интерес. Выявление частот РЧ ЭМИ, при которых генотоксический эффект проявляется сильнее, может послужить стимулом к исключению данных частот из использования в современных средствах связи и других технологиях.
Показано, что облучение РЧ ЭМИ (1.8 ГГц, УПМ 1-2 Вт/кг, 24 ч) вызывает увеличение частоты МЯ и нитевых разрывов ДНК в лейкозных промиелоцитах человека (HL-60) [Schlatterer et al., 2002, 2003]. Эффект колоколообразно зависел от УПМ. Большая группа работ [d Ambrosio et al., 2000а, 2001; McNamee et al., 2000 a,b, 2003; Komatsubara et al., 2004; Zeni et al., 2004], проведенная на здоровых лимфоцитах человека, никакого генотоксического действия данного частотного диапазона (1.7-2.1 ГГц) не выявила. Schlatterer et al. [2002, 2003] делают вывод, что РЧ ЭМИ с параметрами, описанными в их работе, может оказывать кластогенное влияние на линии клеток человека и, что опухолевые клетки более чувствительны к действию ЭМИ. Авторы связывают эти эффекты с возможным изменением способности репарировать повреждения ДНК. Результаты Schlatterer et al. [2002, 2003] противоречат данным работы [Komatsubara et al., 2004], в которой показано отсутствие генотоксического действия РЧ ЭМИ на здоровые и опухолевые клетки принепрерывном или модулированном сигнале. Авторы сделали вывод, что РЧ ЭМИ (2.14 ГГц) с УПМ до 0.8 Вт/кг не является генотоксикантом. Результаты работ [Schlatterer et al., 2002, 2003; Komatsubara et al., 2004] свидетельствуют о том, что опухолевые клетки могут быть более чувствительны к воздействию РЧ ЭМИ с определенными частотами.
Исследование прямого повреждающего действия ИЭМИ СВЧ БПМ на ДНК эритроцитов лягушки
Взаимодействие ионизирующего излучения с веществом приводит к ионизации атомов и молекул вещества. Этот процесс рассматривают как «прямое» действие радиации. Его результатом является изменение макромолекул, в первую очередь такой громадной структуры, как ДНК (основная молекулярная мишень действия ионизирующей радиации в клетке), а также образование нескольких высокореакционных продуктов из молекул воды, составляющей основную (80-90% вещества) массу клетки. Продукты радиолиза воды (НгО+, ОН , Н , НО 2» Н2О2, е аЧ) реагируют как между собой, так и с органическими компонентами клетки, приводя к разрушению их молекул. Радикалы ОН ответственны более чем за половину радиационных поражений молекул ДНК, так как они способны к диффузии на расстояние около 1 нм, а радиус двойной спирали молекулы ДНК близок к 1 нм. Второй описанный путь поражения жизненно-важных структур клетки носит название косвенного механизма действия излучения. Итак, под прямым действием понимают такие изменения, которые возникают в результате утери или приобретения электрона самими рассматриваемыми молекулами («мишенями»). Под косвенным действием понимают изменения этих мишеней, вызванные продуктами радиационного разложения окружающей эти молекулы воды и растворенных в ней низкомолекулярных соединений, а не энергией излучения, поглощенной самими исследуемыми молекулами. На долю «прямого» действия излучения приходится 10-20% лучевого поражения ДНК, а за оставшиеся 80-90% ответственно «косвенное» действие радиации [Ярмоненко и Вайнсон, 2004].
Как показывают многие исследования, повреждения ДНК существенно различаются как количественно, так и по качественному составу, в зависимости от условий облучения. На радиационный выход повреждений ДНК могут влиять различные клеточные факторы. К ним относятся степень взаимодействия ДНК с белками и геометрия ее укладки в клеточных органеллах (структура хроматина), уровни оксигенации (или гипоксии) и эндогенных антиоксидантов, активность ферментативных систем репарации ДНК в клетке. Помимо неравномерного формирования повреждений в ДНК, структура хроматина определяет и большую или меньшую доступность повреждений для ферментов репарации, поэтому степень повреждения отдельных доменов определяется балансом между количеством индуцируемых повреждений и скоростью их репарации [Филиппович, 1990]. Наличие кислорода во внутренней среде способствует повышению выхода АФК и соответственно усилению радиационных эффектов. Повреждения ДНК, индуцируемые ионизирующим излучением, можно условно разделить на две группы. Первая группа - одиночные, или односайтовые, повреждения - такие, как ОН разрывы, модификации оснований, АП-сайты (апуриновые/апиримидиновые). Вторую группу составляют локальные множественные повреждения - такие, как мультисайтовые кластерные повреждения, ДН разрывы ДНК, а также межмолекулярные сшивки типа ДНК-белок, ДНК-ДНК. В образовании одиночных повреждений ДНК превалируют механизмы косвенного действия радиации, и большинство этих повреждений быстро и эффективно репарируется в организме в пострадиационный период. В результате всех указанных видов повреждений ДНК возникают мутации разных типов: разрывы хромосом, транзиции, трансверсии и др. [Гершензон, 1990].
Главный компонент радиационных повреждений ДНК в количественном отношении -химическая модификация оснований. Примерно 70-85% этих модификаций, образующихся в ДНК клеток, облученных у-лучами, являются результатом действия АФК, генерируемых радиацией в среде окружения ДНК. Больше всего окислительных модификаций оснований в ДНК возникает в результате взаимодействия с ней ОН-радикалов и !Ог. Поэтому на количественный выход и качественный состав поврежденных оснований в составе ДНК оказывает влияние уровень кислорода и антиоксидантов в облучаемых клетках. В водном окружении основания ДНК более подвержены действию радикалов, чем сахар, и поэтому в облученной ДНК количество поврежденных оснований гораздо больше, чем повреждений сахара, из расчета на определенную длину полинуклеотидной цепи. Отметим также, что радиационный выход модифицированных оснований в двунитевой ДНК в 2-3 раза выше по сравнению с таковым в однонитевой ДНК. Наиболее стабильными радиационными модификациями пуринов, остающимися в составе ДНК, являются 8-оксо-7,8-дигидроаденин и 8-оксо-7,8-дигидрогуанин [Fuciarelli et al., 1990]. 8-оксогуанин (8-ОГ) может спариваться с аденином, вызывая высокий уровень трансверсий типа Г— Т. Этот тип повреждения играет важную биологическую роль в мутагенезе, канцерогенезе и старении. Высокий уровень удаления 8-ОГ из организмов млекопитающих с мочой указывает на то, что это повреждение ДНК - постоянно и неизбежно. Возможно, это наиболее существенный процесс эндогенного повреждения ДНК, играющий важнейшую роль в старении и канцерогенезе. Репарация 8-ОГ осуществляется специальным ферментом ОГ-гликозилазой, которая специфически удаляет 8-ОГ, расположенный напротив Ц, Г или Т [Ленинджер, 1985]. Появление хромосомных аберраций отражает образование разрывов молекулы ДНК и дефекты ее репарации [Ярмонеико и Вайнсон, 2004]. Из ацентрических фрагментов хромосом, которые из-за отсутствия центромер не были распределены по ядрам дочерних клеток и остались в цитоплазме, образуются так называемые микроядра, представляющие собой фрагменты хроматина, располагающиеся в цитоплазме интерфазной клетки. Наличие микроядер, служит индикатором повреждения ДНК ионизирующим излучением.
Еще одним проявлением лучевого- поражения клетки является «генетическая нестабильность», под которой понимается длительное сохранение в строении и функционировании генетического аппарата, в конечном счете, ДНК-белкового комплекса [Ярмонеико и Вайнсон, 2004]. Механизмы индукции и поддержания генетической нестабильности не ясны. Имеются данные, как о роли прямого поражения ДНК, так и о влиянии на генетическую нестабильность измененного клеточного метаболизма [Газиев и др., 1998].
В 1944-1948 годах отечественный генетик И.Ф. Рапопорт нашел новый класс химических мутагенов - алкилирующие агенты, способные добавлять к взаимодействующим с ними молекулам алкильные (метиловые, этиловые, пропиловые, бутиловые) боковые группы [Сойфер, 1997]. Аналогичный результат был получен английским генетиком Шарлоттой Ауэрбах [Ауэрбах, 1978]. В конце 60-х годов стало ясно, что эти мутагены алкилируют пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК, препятствуя комплементарному спариванию оснований [Благой, 1998].
Любая модификация основания может приводить сразу ко многим изменениям в свойствах молекулы и ее биологическом функционировании, поскольку основания нуклеиновых кислот являются сопряженными системами, и любое изменение электронной плотности на одном участке меняет электронную плотность по всей молекуле. Наиболее сильные изменения взаимодействия оснований происходят при замене, блокировании или дополнительном введении гидрофильных групп, поскольку эти группы могут участвовать в образовании Н-связей и вносят основной вклад в молекулярное узнавание. Пример такой модификации -замена лабильного водорода на алкильную группу. Такие замены мало изменяют электронную плотность на других атомах, но существенно меняют способность оснований образовывать Н-связи, а следовательно, и пары при биосинтезе [Полтев и др., 1993].
Определение продукции АФК в водных растворах под действием ИЭМИ КВЧ БПМ
Диапазон измеренных нами концентраций Н2О2, образующейся в результате облучения фосфатного буфера ИЭМИ КВЧ БПМ, совпадает с таковым (5-Ю нМ), полученным при облучении воды интенсивным ЭМИ СВЧ [Вакс и др., 1994]. Гипотеза авторов цитируемой работы о кинетическом возбуждении структур жидкой воды, приводящем к вязким потерям при поглощении электромагнитной энергии и, как следствие, к частичному необратимому распаду воды с образованием перекиси водорода, нашла частичное подтверждение в результатах диссертации. Однако в главе 7 напрямую показано, что образование Н2О2 в облучаемом ИЭМИ КВЧ буфере в основном связано с действием возбуждаемых в нем термоакустических колебаний. С другой стороны, полученные нами результаты находятся в некотором противоречии с данными работы [Поцелуева и др., 1998], в которой показано значительное образование перекиси водорода (около 400 нМ) при облучении натрий-карбонатного буфера (50 мМ, рН 10.2) низкоинтенсивным ЭМИ КВЧ (41 ГГц, 0.5 мВт/см2). В наших экспериментах зависимость образования Н2О2 под действием ИЭМИ КВЧ БПМ от ППМ излучения имела выраженный S-образный характер и при низких ППМ образования Н2О2 не наблюдалось. Однако следует отметить, что образование перекиси водорода в растворах под действием различных факторов сильно зависит от ионного состава и величины рН раствора [Брусков и др., 2003]. В отдельной серии экспериментов при использовании натрий-бикарбонатного буфера (2.33 мМ ЫаНСОз, рН 8.5), содержащего хлорид анионы (0.53 мМ NaCl), через 10 мин облучения ИЭМИ КВЧ БПМ (400 не, 500 Гц) было зарегистрировано существенное увеличение образования Н2О2 (94.0+2.8 нМ), почти в 14 раз превышающее количество Н2О2, образующейся при облучении 1 мМ фосфатного буфера. При облучении раствора Хенкса (рН 7.5), наиболее близкого по ионному составу к плазме крови, в нем образовывалось меньшее количество Н2О2 (около 16 нМ), что может быть связано с присутствием в этом физиологическом растворе сульфат анионов, подавляющих образование Н2О2 [Брусков и др., 2003]. Полученные результаты представлены на Рис. 19.
Известно, что концентрация перекиси в организме человека в норме может достигать 35 мкМ (плазма крови) или даже 100 мкМ и выше (ротовая полость, пищевод и желудок, дыхательная система, почки, мочевыводящие пути и мочевой пузырь, ткани глаза) [Halliwell et al., 2000]. Потенциальная генотоксичность АФК и, в частности, Н202 хорошо известна [Тронов и Константинов, 2000; Petersen et al., 2000]. Методом комета-тест было показано, что генотоксическое действие на изолированные лимфоциты крови человека оказывает перекись водорода в концентрации 25 мкМ [Тронов и Константинов, 2000], а на лимфоидные клетки человека линии ТК6 - в концентрации 1 мкМ и выше [McName et al., 2000]. В наших экспериментальных условиях за 10 мин облучения ИЭМИ КВЧ БПМ концентрация образовавшейся Н2О2 не превышала 100 нм, т.е. была ниже той, которая обладает генотоксическими свойствами in vitro. Возможно, при других условиях воздействия, параметрах и временах экспозиции объекта ИЭМИ БПМ скорость образования Н2О2 и соответственно ее количество будут выше. В этом случае нельзя отрицать возможного генотоксического действия ИЭМИ БПМ, опосредованного свободно-радикальными процессами.
В настоящей работе представлены результаты исследования возможности прямого повреждения ДНК в различных типах клеток после облучения ИЭМИ БПМ (СВЧ и КВЧ), также исследована возможность повреждения ДНК активными формами кислорода, образующимися под действием ИЭМИ КВЧ.
В части 3.1. работы, методом комета-тест, показано увеличение поврежденное ДНК в эритроцитах лягушки Xenopus laevis при действии ИЭМИ СВЧ БПМ. Обнаруженный эффект был обусловлен увеличением температуры суспензии облучаемых клеток на 3.5±0.1С, что подтверждено в экспериментах по имитации облучения и в экспериментах с инкубацией клеток в течение 40 мин в соответствующих температурных условиях [Chemeris et al., 2004]. В условиях такого повышения температуры увеличение уровня повреждения ДНК может быть связано с усилением депуринизации/депиримидинизации ДНК, протекающей в физиологических условиях. При облучении лейкоцитов цельной крови и изолированных лимфоцитов крови человека изменение уровня повреждения ДНК в клетках не наблюдалось. На основании проведенных экспериментов можно -заключить, что ИЭМИ СВЧ БПМ при выбранном режиме воздействия (8.8 ГГц, длительность импульса 180 не, пиковая мощность в импульсе до 65±5 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, средняя УПМ 1.6 кт/кг, длительность экспозиции 40 мин) не оказывает специфического генотоксического действия на ДНК нативных эритроцитов лягушки, лейкоцитов цельной крови и изолированных лимфоцитов крови человека in vitro [Chemeris et al., 2006]. Исследование действия ИЭМИ КВЧ БПМ при выбранном режиме воздействия (37 ГГц, длительность импульса 60 не, импульсная мощность 20 кВт, частота следования импульсов 50 Гц, интенсивность 0.24 Вт/см2) показало, что излучение не оказывает прямого генотоксического действия на ДНК нативных лейкоцитов цельной крови мыши [Гудкова и др., 2004].
Таким образом, первоначальная гипотеза о том, что ИЭМИ БПМ могут вызывать генотоксические эффекты путем прямого действия на ДНК клеток, например, из-за высокой напряженности электрического поля в облучаемом объекте, не подтвердилась. Следовательно, можно предположить, что ИЭМИ БПМ могут оказывать не прямое, а опосредованное генотоксическое действие за счет других механизмов, изучение которых представляет особый интерес.
Механизмы действия, например, ИЭМИ КВЧ БПМ могут быть обусловлены увеличением температуры облучаемого объекта, высокой наведенной в объекте напряженностью электрического поля, термоупругим возбуждением в облучаемом объекте акустических колебаний с последующей поляризацией молекул и образованием свободных радикалов.
На основании результатов, полученных в части 3.2., можно заключить, что облучение водных растворов ИЭМИ КВЧ БПМ приводит к образованию в них АФК с участием тепловых механизмов и термоупругого возбуждения акустических колебаний, приводящих к активации растворенного кислорода и частичному распаду воды, возможно, в результате кавитационных процессов, происходящих в газовых пузырьках воздуха [Гудкова и др., 2005]. В пользу кавитационного механизма действия тепла на водные растворы свидетельствует тот факт, что под действием тепла, помимо АФК, происходит образование окислов азота [Bruskov et al., 2002; Черников и Брусков, 2005], аналогично тому, как это происходит под действием ультразвука [Didenko & Suslick, 2002; Степуро и др., 2004]. Следует отметить существование известного физико-химического механизма трансформации энергии слабых воздействий в высокоэнергетические процессы с помощью газовых пузырьков атмосферного воздуха в воде, как это происходит при соиолюминесценции [Маргулис, 2000; Липсон и Кузнецов, 2002; Didenko & Suslick, 2002]. Растворенный в воде воздух состоит из микропузырьков, что обусловлено гидрофобностью растворенных газов в такой полярной жидкости, как вода. При соиолюминесценции в газовых пузырьках растворенного в воде воздуха происходит концентрирование энергии ультразвукового поля на несколько порядков величины и преобразование ее в видимое или УФ-излучение. Газовые пузырьки являются усилителями и трансформаторами относительно слабой энергии ультразвукового поля в гигантские флуктуации - в высокоэнергетические "сгустки" энергии ЭМП. По всей видимости, аналогичным образом в результате кавитационных процессов в газовых пузырьках воздуха может происходить активация растворенного кислорода и частичный распад воды под действием ИЭМИ КВЧ БПМ.
