Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 12
Глава I. Строение пероксидазы 12
Глава II. Механизм действия пероксидазы 24
2.1. Пероксидаза в реакциях оксидазного окисления субстратов 25
2.2. Фермент вреакциях пероксидазного окисления субстратов 30
2.2.1. Пероксидаза в реакциях индивидуального окисления субстратов...30
2.2.2. Пероксидаза в реакциях совместного окисления субстратов 36
Глава III. Функциональная роль пероксидазы 39
Глава IV. Использование пероксидазы в аналитических исследованиях ...48
Экспериментальная часть 53
1. Исходные вещества 53
1.1 Сбор лекарственного сырья 53
1.2 Сушка заготовленного сырья 54
2. Использованная аппаратура 55
3. Приготовление рабочих растворов 55
4. Методики проведения экспериментов 55
4.1 Методики исследования пероксидазы 55
4.2. Методики определения реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты 57
4.3. Методики определения ингибирования ИУК пероксидазного окисления, аскорбиновой кислоты, гидрохинона и о-дианизидина 57
4.4 Методики определения пероксидазного окисления аминазина 58
4.5. Методики определения пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина 58
4.6. Определение стероидных гликозидов 59
4.7. Определения аскорбиновой кислоты 59
Результаты и обсуждение 61
Глава I. Регулирование реакций пероксидазного окисления антиоксидантов с помощью индолил-3-уксусной кислоты 61
1.1. Изучение механизма пероксидазного окисления медленно окисляемого субстрата с помощью индолил-3-уксусной кислоты 61
1.2. Влияние индолил-3-уксусной кислоты на пероксидазное окисление быстро окисляемых субстратов 70
Глава II. Исследование реакций пероксидазного окисления функционально активных 82
2.1. Особенности пероксидазного окисления хлорпромазина 82
2.2. Производные фенотиазина являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы 93
2.3. Влияние строфантина G на кинетику пероксидазного окисления фенотиазинов 104
Глава III. Проявление действия функционально активных веществ в биологических системах 118
3.1. Роль пероксидазы и антиоксидантов в прорастании семян 118
3.2. Действие строфантина на прорастание семян 122
3.3. Участие стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в формировании гипобиотических состояний 128
3.4. Роль стероидных гликозидов и аскорбиновой кислоты в онтогенезе растений 136
Заключение 142
Выводы 147
Список литературы 150
- Пероксидаза в реакциях оксидазного окисления субстратов
- Использование пероксидазы в аналитических исследованиях
- Изучение механизма пероксидазного окисления медленно окисляемого субстрата с помощью индолил-3-уксусной кислоты
- Производные фенотиазина являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы
Введение к работе
Для активной жизнедеятельности растениям и животным необходим кислород. Основное количество кислорода расходуется на выработку энергии и участие в окислительном метаболизме. Однако, небольшая его часть около 2% может переходить в активные формы кислорода (АФК): О/, Н202, НО-, НОСІ и др. (Ursini et al., 1989). Для защиты от их разрушительного действия используются компоненты антиоксидантной системы, среди которых высокомолекулярные (СОД, каталаза, пероксидаза) и низкомолекулярные (аскорбиновая кислота, гидрохинон, стероиды, флавоноиды и др.) антиоксиданты.
Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по активности пероксидазы, которая катализирует реакции оксидазного и пероксидазного окисления неорганических и органических соединений (Рогожин, Курилюк, 1998). Последними могут быть функционально активные вещества (ИУК, гидрохинон, аскорбиновая кислота, НАДН, фенотиазины), способные участвовать в оксидазных и пероксидазных реакциях, катализируемых пероксидазой. Среди этих веществ следует выделить антиоксиданты, которые способны подавлять образование свободных радикалов, понижая таким образом уровень ПОЛ в клетках живых организмов.
Таким образом, между пероксидазой и антиоксидантами должна наблюдаться взаимная зависимость, которая недостаточно изучена. Механизм действия пероксидазы в реакциях пероксидазного окисления достаточно сложен. Реакция инициируется перекисью водорода, в результате которой образуются окисленные формы фермента (Еі и Е2).
Е + Н202 -» Ej Ei + AH2->E2 + AH Е2 + АН2 -> Е + АН
В восстановлении фермента участвуют соединения, являющиеся донорами водорода и донорами электронов.
Многообразие субстратов позволяет предположить, что в реакциях пероксидазного окисления могут реализовываться различные механизмы действия фермента. Все субстраты пероксидазы условно можно разделить на быстро и медленно окисляемые. К быстро окисляемым относят о-дианизидин, гидрохинон, фенолы и амины, а к медленно окисляемым ферроцианид калия, аскорбиновая кислота, НАДН и др. Исследование механизмов пероксидазного окисления органических соединений позволили высказать предположение, что перенос электронов, сопровождаемый переносом протонов происходит с участием функциональных групп белковой глобулы фермента. Показано, что в каталитическом процессе участвует один из остатков гистидина (Гис42). Выявлена функциональная группа с рК 6,5, депротонирование которой приводит к понижению скорости окисления одного из органических субстратов - о-дианизидина. Тогда как модификация трех поверхностных СООН-групп белка пероксидазы, не влияет на кинетические параметры окисления ферроцианида калия, но в 10 раз уменьшает константу скорости реакций Ei с о-дианизидином, что свидетельствует об участии белковой глобулы пероксидазы в окислении органических субстратов. Таким образом, при пероксидазном окислении органических субстратов реализуется периферийные механизмы переноса электронов (Лебедева и др., 1996) и активный центр фермента в этом случае включает функциональные группы белка. Причины широкой субстратной специфичности пероксидазы объясняются тем, что на поверхности белка реализуются несколько различных каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема (Угарова и др., 1984).
В реакциях совместного окисления субстратов наблюдается активация или ингибирование окисления одного субстрата другим, а в реакциях совместного окисления быстро и медленно окисляемых субстратов, наблюдается активация медленно окисляемого субстрата и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (Угарова и др., 1981).
В литературе приводятся данные об активации оксидазного окисления некоторых субстратов пероксидазы (НАДН и ИУК) в присутствие ряда фенолов (Jen et al., 1971; Saikumar et al., 1994; Hon et al., 1994). Отмечается, что механизмы субстрат-субстратной активации различаются для разных субстратов. Так, для р-крезола и аскорбиновой кислоты и люминола и замещенных фенолов методами спектроскопии ЭПР показано, что активация происходит за счет не ферментативных процессов. Тогда как в реакции совместного окисления ферроцианида калия и о-дианизидина предложено, что частицей, эффективно окисляющей ферроцианид, является не свободный радикал о-дианизидина, комплекс пероксидазы с полуокисленным субстратом.
Поэтому механизмы совместного окисления соединений в присутствии пероксидазы во многом зависят от структуры субстратов и способны активно реализовываться в биогенных системах. Знание этих механизмов позволит расширить наши представления о функционировании сложных систем и позволит объяснить многие эффекты действия функционально активных веществ. Поэтому актуальность и значимость изучения строения активного центра пероксидазы и протекание механизмов пероксидазного окисления субстратов, реализуемых в реакциях индивидуального и совместного окисления позволили нам сформулировать цель и задачи данной работы.
Цель настоящего исследования - изучить строение активного центра, механизмы действия пероксидазы в реакциях совместного окисления субстратов и предложить возможности использования выявленных механизмов в биогенных системах.
В этой связи необходимо было решить следующие задачи:
Исследовать влияние индолил-3 -уксусной кислоты на реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и выявить механизмы регуляторного действия.
Изучить механизмы действия индолил-3 -уксусной кислоты на пероксидазные реакции быстро окисляемых субстратов (о-дианизидин и гидрохинон) и проявить места связывания этих субстратов в области активного центра пероксидазы.
Исследовать реакции пероксидазного окисления фенотиазинов и предложить механизмы их участия в этих реакциях.
4. Изучить реакции совместного окисления фенотиазинов с о- дианизидином и выявить проявления их индивидуальных свойств в этих реакциях.
5. Установить роль строфантина в реакциях пероксидазного окисления фенотиазинов и о-дианизидина.
6. Выявить влияние аскорбиновой кислоты и сердечных гликозидов в прорастании семян и установить регуляторную роль пероксидазы в этом процессе.
Научная новизна. Исследования влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволили установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты. Тогда как в реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования. Предложено, что местом связывания АК в активном центре фермента является дистальная область. Изучение реакций совместного пероксидазного окисления о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило высказать предположение, что преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы является гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов.
Впервые изучены пероксидазные реакции окисления фенотиазинов (аминазина, трифтазина и тиопроперазина). Показано, что они являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы. При совместном присутствии аминазина и ферроцианида калия, скорость пероксидазного окисления последнего возрастала за счет того, что аминазин связывался в активном центре пероксидазы вблизи места связывания молекулы ферроцианида, стабилизируя промежуточный комплекс фермента с ферроцианидом. Предложено, что при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов, фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы.
Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы реализуются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Причем фермент, не проявляющий избирательность по отношению природы окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.
Практическая значимость работы. В результате исследований разработана научно-обоснованная программа по изучению механизмов пероксидазного окисления биологически активных веществ. Предложено, что выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, катализируемое пероксидазой, имеют важное биологическое значение. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина, служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. При этом ИУК может выполнять роль "триггера" в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ауксина, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания. Исследования механизмов пероксидазного окисления фенотиазинов позволило высказать предположения о возможных сроках нахождения фенотиазинов в организме человека, а также дать предположительную оценку эффективности их действия. Среди изученных фенотиазинов выраженное седативное действие трифтазина можно объяснить за счет того, что поскольку он в присутствии быстро окисляемого субстрата не окисляется пероксидазой, то он должен дольше сохранять свое функциональное действие. Быстрее всех в организме может окисляться аминазин и его действие должно быть за счет этого не продолжительным. Кроме этого обосновано действие фенотиазинов в присутствии строфантина G при их совместном использовании. Поскольку строфантин G ускоряет окисление тиопроперазина, то при их совместном введении пероксидазное окисление тиопроперазина будет возрастать, что приведет к образованию различных продуктов его окисления и к быстрой потере фармакологического действия. Тогда как пероксидазное окисление трифтазина и аминазина в присутствии строфантина G будет замедляться, обеспечивая, таким образом, пролонгированность действия вводимых препаратов.
Защищаемые положения. 1. В области активного центра фермента имеется обширная субстратсвязывагощая площадка, в составе двух специализированных участков связывания субстратов, в действии которых принимают участие две функциональные группы с pKi~5,0 и рК2~6,5.
2. В действии пероксидазы заложены сложные регуляторные механизмы, позволяющие ферменту инициировать процесс пероксидазного окисления широкого спектра субстратов, а в механизмах совместного окисления использовать способы регулирования, ускоряя каталитический процесс за счет улучшения связывания окисляемого субстрата или с участием в окислении комплекса фермента с полуокисленным субтратом.
3. Пероксидаза и антиоксиданты (аскорбиновая кислота и стероидные гликозиды) принимают непосредственное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний и ответственны за поддержание высокой жизнеспособности семян.
Пероксидаза в реакциях оксидазного окисления субстратов
Часть эпитопов локализована в петлях и изгибах пептидной цепи пероксидазы, обладает «нерегулярной» конформацией. В составе полученных антигенных детерминант наиболее часто встречались десять аминокислот - Arg, Ser, Ala, Thr, Leu, He, Val, Phe, Pro, Asn. В состав эпитопов входили заряженные аминокислоты Arg и Asp, неполярные аминокислоты Ala, Leu, Не, Val, Phe, Pro и Trp и незаряженные полярные аминокислоты - Asn, Thr, Ser, Gin, Туг, Gly (составляющие 13,4, 51,2 и 35,4% соответственно от общего состава детерминант). Таким образом, на поверхности белковой глобулы фермента, преимущественно располагаются гидрофобные аминокислотные остатки. Три из восьми пептидов, гликозилированные в нативной молекуле пероксидазы хрена (13-15, 198-200, 268-270), входили в состав эпитопов, остальные же гликозилированные аминокислотные остатки были расположены достаточно далеко от антигенных областей. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: Arg-38, входящий в активный центр пероксидазы хрена и Phe-142, Phe-143, формирующих канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента. Большая часть аминокислотных остатков, участвующих в связывании кальция, в координации железа гемина и в образовании субстратсвязывающего участка, не входили в состав антигенных детерминант, согласуются с предположениями о том, что эти участки являются консервативными и стабильными структурами [Welinder, 1985], расположенными внутри белковой глобулы.
Используя методику ренатурации рекомбинантной пероксидазы хрена, были получены формы фермента с точечными мутациями F41H и Н143Е [Газарян и др., 1995]. При этом известно, что Phe-41 локализован между остатками дистальных His-40 и His-42. Последний координирует атом железа гемина в активном центре пероксидазы хрена. Тогда как, остаток Phe-143 расположен в проксимальной области гемина вблизи входа в гемс вязы вага щую полость и совместно с Phe-142, способен формировать субстратсвязывающий участок активного центра пероксидазы. Данные мутации приводили к падению удельной ферментативной активности более чем в 40 раз, с проявлением влияния на различные стадии каталитического механизма. Замена F41H вызывала понижение каталитической константы скорости по перекиси водорода на два порядка и на один порядок по АБТС. При окислении иодида мутация приводила к смене каталитического механизма. Тогда как замена Н143Е влияла преимущественно на стадию окисления АБТС и отщепление продукта его окисления. При этом в реакции окисления иодида данный мутант имел на порядок меньшие константы скорости как по перекиси водорода, так и по йодиду. На основании проведенных исследований высказаны предположения, что роль замещенных остатков фенилаланинов (Phe-41 и Phe-143) состоит в формировании гидрофобной полости, обеспечивающей прочное нековалентное связывание порфиринового цикла гемина [Газарян и др., 1995].
Таким образом, активный центр пероксидазы представляет область на поверхности белковой глобулы, расположенной с дистальной стороны гемина, образованной из спиралей А, В, С, D (рис. 4). Активную роль в каталитическом процессе пероксидазного окисления субстратов принимает участие Fe3+, координирующее с четырьмя атомами азотов пирролов протопорфирина, проксимальным лигандом которого является остаток имидазола гистидина белка (His-170). Шестым лигандом является молекула воды. В процессе восстановления перекиси водорода участвуют His-42 и Arg-38, расположенные в спирали В (Schuller et al., 1996; Gajede et all., 1996; Аммосова и др., 1997; Газарян и др., 1998).
В координации гемина принимают участие остатки фенилаланинов (Phe-41 и Phe-143), роль которых заключается в формировании гидрофобного окружения нековалентносвязанного гемина и обеспечении его прочного встраивания в белковую глобулу [Газарян и др., 1995].
Субстратевязывающая площадка для соединений органической природы представлена протяженной гидрофобной областью, включающей Arg-38, Phe-142, Phe-143. Местом связывания для оксидазных субстратов пероксидазы, в частности ИУК, может быть дистальный субдомен, включающий спирали А (целиком), В (середина), С (начало), D (целиком) и переход спирали D к D (Упоров, Егоров, 1997; Савицкий и др., 1998).
Пероксидаза способна катализировать реакции оксидазного, пероксидазного и оксигеназного окисления субстратов (рис. 5). Не обладая специфичностью в реакциях индивидуального окисления, фермент способен приобретать избирательность в реакциях совместного окисления субстратов. Хотя участие фермента в оксигеназных реакциях мало исследовано.
Широкое распространение пероксидазы в растительных и животных тканях позволяет говорить, что этот фермент выполняет многогранную работу в биогенных системах. Поэтому исследование структуры и механизма действия пероксидазы представляет не только теоретический интерес для понимания физиологической роли и принципов функционирования фермента, но и имеет важное практическое значение, поскольку пероксидаза широко используется в аналитических исследованиях [Угарова и др., 1981]. Поэтому мы рассмотрели механизм действия пероксидазы как в оксидазных, так и в пероксидазных реакциях окисления субстратов.
Использование пероксидазы в аналитических исследованиях
Оксидазными субстратами фермента, как было сказано выше, служат индолил-3-уксусная кислота, диоксифумаровая кислота и др. Продуктами окисления в оксидазных реакциях являются супероксид анион-радикал (02) и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола. Радикалы скатола могут реагировать в дальнейшем с молекулярным кислородом, образуя перокси-радикалы и далее перекись скатола (Савицкий и др., 1998). Поэтому генерация свободных радикалов пероксидазой в оксидазных реакциях фермента может быть условием для его участия в процессах свободнорадикального окисления в семенах пшеницы, а фермент может осуществлять роль инициатора образования свободных радикалов в семенах.
В круг пероксидазных субстратов фермента входят различные функционально активные вещества, в том числе и антиоксиданты [Рогожин, Верхотуров, 1998]. В реакциях индивидуального окисления эти соединения чаще всего являются медленно окисляемыми субстратами, однако, при совместном окислении с быстро окисляемым субстратом, скорость их пероксидазного окисления может возрастать в 100 и более раз [Лебедева, Угарова, 1996]. Пероксидаза способна, осуществлять контроль за уровнем перекиси, восстанавливая ее до воды и при этом окислять низкомолекулярные антиоксиданты. В процессе каталитической реакции могут образовываться свободные радикалы, которые в начальный момент прорастания семян, способны инициировать реакции свободнорадикального окисления, активируя при этом протекание перекисного окисления липидов [Владимиров, Арчаков, 1972]. Высокие концентрации антиоксидантов ингибируют пероксидазу как в реакциях индивидуального, так и совместного окисления, осуществляя таким образом регуляторную функцию [Рогожин, Верхотуров, 1997; 1998; 1999; 2000]. Следует выделить ряд особенностей в проявлении активности пероксидазы в покоящихся и прорастающих семенах. Так, например, в сухих семенах выявляется высокая пероксидазная активность, коррелирующая с уровнем их жизнеспособности. Тогда как низкая активность фермента свидетельствует о понижении жизнеспособности и всхожести семян [Рогожин, Егорова, 1991].
В условиях искусственного гипобиоза, вызванного длительным затоплением семян в воде, у них так же отмечается увеличение содержания антиоксидантов, сопровождающееся уменьшением уровня ПОЛ. Тогда как использование низких концентраций перекиси водорода, при набухании семян, в них повышается пероксидазная активность, коррелирующая с возрастанием их всхожести [Нариманов, Корыстов, 1998].
Набухание и прорастание семян сопровождается активированием ПОЛ, изменением в составе антиоксидантов и повышением активности пероксидазы в десятки и более раз [Рогожин, Егорова, 1991]. У непроросших семян отмечается повышение содержания антиоксидантов, при пониженном уровне ПОЛ и пероксидазной активности. В прорастающих семенах происходит переключение дегидрогеназных реакций на аэробные, которые могут осуществляться с помощью эндогенных функционально активных веществ. При этом активность дегидрогеназ может регулироваться различными концентрациями АТФ, а пероксидазы - ИУК.
Предварительное УФ-облучение семян проявляется в резком увеличении активности пероксидазы, повышении уровня ПОЛ и компенсаторным выбросом высоких концентраций антиоксидантов в период проклевывания. Причем наиболее активное возрастание содержания антиоксидантов и уровня ПОЛ отмечается в зародыше семян пшеницы, тогда как в щитке увеличение ПОЛ сопровождается понижением антиоксидантной активности. Возможно, в этом проявляется регуляторний механизм, обеспечивающий нарушение избирательного транспорта функционально активных веществ через щиток. При этом из эндосперма в зародыш начинают активно поступать регуляторы роста, обеспечивающие прорастание зерен пшеницы [Рогожин, Курилюк, 1996; 199; Рогожин и др., 1997; 1999].
Субстратами пероксидазы могут быть и фитогормоны (абсцизовая кислота, гибберелловая кислота, ауксины и др.), поэтому фермент имеет большое значение в регуляции состава функционально активных веществ. Причем окисление БАВ ферментом способствует генерации свободных радикалов в семенах, а как следствие этого процесса является активизация ПОЛ. Причем вслед за этими процессами в семенах возрастает дыхание, повышается общий уровень метаболических процессов, что проявляется в ускоренном прорастания семян, активно выходящих из состояния покоя.
Для повышения всхожести семян можно предложить разработанный нами метод использования УФ-облучения и низких концентраций антиоксидантов, в предпосевной обработке семян пшеницы. При этом всхожесть семян пшеницы может повышаться на 20-30% [Рогожин и др., 1999]. При обработке семян высокими концентрациями антиоксидантов наблюдается понижение всхожести семян, за счет, вероятно, ингибирования перекисного окисления липидов и активности пероксидазы, проявляемое в углублении их покоя. Тогда как при действии малых доз УФ-излучения и низких концентраций антиоксидантов наблюдаются эффекты активирования процессов свободнорадикального окисления и пероксидазы в прорастающих семенах, что позволяет высказать предположение об участии ПОЛ и пероксидазы в активировании пусковых механизмов прорастания семян. Возможно, эти же методы могут быть использованы для активизации прорастания семян дикорастущих видов растений.
Изучение механизма пероксидазного окисления медленно окисляемого субстрата с помощью индолил-3-уксусной кислоты
Пероксидаза катализирует окисление индолил-3-уксусноЙ кислоты как в присутствии, так и в отсутствие перекиси водорода [Metodiewa et al., 1992; Park, Park, 1987; Pieres, 1992]. В процессе оксидазного окисления ИУК образуются супероксид анион-радикал и катион-радикал ИУК, последний в кислой среде декарбоксилируется, превращаясь в радикал скатола [Gazarian, 1998; Савицкий и др., 1998]. Предложено, что пероксидаза способна одновременно связывать как перекись скатола, так и молекулу ИУК. Высказывается предположение, что на поверхности белка существует центр специфического связывания ауксина, отличающийся от активного центра, расщепляющего перекись водорода или органическую гидроперекись [Савицкий и др., 1998]. С помощью компьютерных методов показано, что пероксидазы растений и ауксин-связывающие белки содержат участки сходной структуры. При этом эти участки формируют основную часть дистального домена пероксидаз растений, и один из них непосредственно соответствует последовательности, координирующей гем с дистальной стороны активного центра [Савицкий и др., 1998]. По данным антигенного картирования пероксидазы хрена установлено, что в состав активного центра фермента входят несколько функционально важных аминокислотных остатков: Arg 38, Phe 142 и 143, которые формируют канал доступа ароматических субстратов к активному центру пероксидазы хрена [Аммосова и др., 1997]. Установлен молекулярный механизм расщепления перекиси водорода в активном центре пероксидаз растений [Schuller et al, 1996;.Gajede et al, 1996]. Показано, что в катализе фермента участвуют железо (III) протопорфирина IX и два дистальных аминокислотных остатков - His 42 и Arg 38. Однако до сих пор существуют сложности в предсказании субстратной специфичности пероксидазы хрена, недостаточно изучены механизмы пероксидазного окисления быстро и медленно окисляемых органических субстратов фермента. Поэтому нами было изучено участие индол ил-3-уксусной кислоты в механизме пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, а также, по возможности, мы постарались раскрыть основные закономерности этого каталитического процесса.
Из рисунка 8 видно, что ИУК ингибирует пероксидазу в реакциях окисления аскорбиновой кислоты. Поэтому нами был исследован характер ингибирования пероксидазы ИУК при связывании одной молекулы АК в активном центре фермента. Показано, что зависимости обратных начальных скоростей (v0) пероксидазного окисления АК имеют вид семейства прямых, пересекающихся на оси ординат, что соответствует конкурентному типу ингибирования (рис. 9,а). Данный тип ингибирования указывает на то, что ингибитор и субстрат могут связываться в одном и том же месте активного центра фермента. При этом между субстратом и ингибитором наблюдается конкуренция за центр связывания. При связывании ауксина в активном центре фермента процесс пероксидазного окисления АК замедляется. Аналогичные зависимости были получены и при других значениях рН (4,5-7,0).
Пероксидазное окисление АК, при связывании двух и более молекул субстрата, сопровождалось неконкурентным характером ингибирования пероксидазы индолил-3-уксусной кислотой. При этом типе ингибирования точка пересечения прямых лежит на оси абсцисс (рис. 9,6), т.е. ингибитор связывается вдали от участка связывания второй молекулы АК, однако его связывание на поверхности белка нарушает нормальное взаимодействие субстрата с активным центром фермента [Уайт и др., 1981]. Связывание ИУК с пероксидазой в реакциях конкурентного ингибирования достаточно прочное и составляет 5,4-20,5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания аскорбиновой кислоты и о-дианизидина, для которых константы Михаэлиса при рН 4,5-7,0 равны 6,1-11,5 и 5,5-20 мкМ соответственно [Рогожин, Верхотуров, 1997;.Лебедева и др., 1977]. В реакциях неконкурентного ингибирования ИУК связывается с пероксидазой в 3,2-10,2 раза лучше, чем связывание второй молекулы АК. При этом величины констант ингибирования в реакциях неконкурентного ингибирования при рН 4,5-7,0 для ИУК равны 27,3-34,6 мкМ. Таким образом, связывание ингибитора практически не зависит от рН. Тогда как значения величин Кт2 для АК изменяются в пределах от 88 до 353 мкМ [Рогожин, Верхотуров, 1997].
В активном центре пероксидазы имеется несколько функциональных групп, принимающих участие в ферментативном катализе. Однако природа этих групп пока не установлена [Андреева, 1988]. Предполагается, что в области связывания ароматических субстратов могут располагаться аминокислотные остатки: Arg 38, Phe 142 и 143 [Аммосова и др., 1997]. При этом место связывания ИУК может находиться в структуре субдомена ауксин-связывающего участка вблизи Тгр 117, который может принимать участие в связывании ИУК пероксидазами растений [Савицкий и др., 1998].
Исследование зависимостей lgkcat/Km от рН для пероксидазного окисления одной молекулы аскорбиновой кислоты и двух молекул АК не позволяет определить природу функциональных групп активного центра, принимающих в катализе АК (рис. 10). Аналогичная закономерность отмечается и на кривых IgK; от рН для констант конкурентного и неконкурентного ингибирования (рис. 11).
Производные фенотиазина являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы
Трифтазин и тиопроперазин относятся к нейролептическим препаратам. Основной особенностью препаратов этой группы является их седативное, успокаивающее действие при аффективных расстройствах и состояниях возбуждения. Они оказывают также антипсихотическое действие, снимая или уменьшая бред, галлюцинации, психические автоматизмы [Машковский, 1972].
Трифтазин по химическому строению отличается от аминазина тем, что вместо атома хлора в положении 2 фенотиазинового ядра содержит группу CF3, а в боковой цепи - ядро пиперазина, замещенное при атоме азота в положении 4 группой СНз [Машковский, 1972, Беликов, 1985]. У тиопроперазина в положении 2 фенотиазинового ядра в отличии от трифторметильной группы трифтазина располагается димети л сульфамидная группа. Ультрафиолетовые спектры 10-алкилпроизводных фенотиазина в этаноле имеют по два максимума поглощения в области 290-330 нм; у 10-ацилпроизводных наблюдается гипсохромное смещение обоих максимумов [Азамасцев, Яскина, 1975]. Производные фенотиазина легко окисляются кислородом воздуха. Реакции эти в большинстве своем мало специфичны и почти не изучены. Предполагается, что при окислении продукты реакции имеют нестабильную розовую окраску за счет окисления атома серы, а также за счет окисления ядра фенотиазина в положении 3 и 6. [Беликов, 1985]. Пероксидазное окисление трифтазина и тиопроперазина не изучено. Возможно, что исследование этого процесса позволит разобраться в динамике их превращений в живых организмах и раскрыть особенности специфичного действия препаратов фенотиазинового ряда. На рис. 22 показаны спектры трифтазина и тиопроперазина в 0,1 М натри й-ацетатном буфере при рН 4,5. Видно, что в спектрах производных фенотиазина проявляются три выраженных максимума поглощения в УФ-области (ТФ - 215, 257, 310 нм; ТП - 235, 265, 310 нм). В процессе пероксидазного окисления в спектре поглощения трифтазина появляются три максимума поглощения при 232, 303, 350 нм, а тиопроперазина - 243, 305, 355 нм. В течение первых минут проведения реакции спектры трифтазина и тиопроперазина изменялись - максимумы поглощения при 257 и 265 нм полностью исчезали. Поэтому определение скорости пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина в присутствии пероксидазы хрена проводили, регистрируя уменьшение поглощения светопоглощения для трифтазина при 257 нм, а тиопроперазина - при 265 нм. В отсутствие фермента реакции не наблюдались. На рис. 23 показаны зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии различных концентраций тиопроперазина. Графики в двойных обратных координатах при рН 4,0-5,5 имели вид параллельных прямых, что указывает на бесконкурентный или антиконкурентный характер ингибирования, различить которые можно построением в координатах Диксона [Березин, Клесов, 1976]. Линеаризация в координатах Диксона свидетельствовала об антиконкурентном типе ингибирования. Величины константы ингибирования в зависимости от рН изменялись от 0,98 до 2,08 мМ. При рН 6 и выше наблюдалось последовательное окисление субстратов, причем вначале окислялся тиопроперазин, а затем происходило окисление о-дианизидина. Показано, что в исследуемом диапазоне рН трифтазин не оказывал влияния на пероксидазное окисление о-дианизидина. При рН 4,5-7,5 окисление о-дианизидина и аминазина протекает последовательно. Причем вначале преимущественно окисляется аминазин, а затем начинает окисляться о-дианизидин. Последовательность реакций, по-видимому, задается доступностью функциональных групп аминазина к каналам электронного транспорта активных центров окисленных форм пероксидазы (Е1 и Е2). Реакции пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина характеризуются низкими значениями каталитических констант 0,3-124 и 0,12-9,8 с"1 соответственно, что позволяет отнести их к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы, таких как NADH [Лебедева, Угарова, 1997] и ферроцианид калия [Угарова и др., 1977]. На основании полученных данных индивидуальное окисление трифтазина и тиопроперазина можно описать следующей схемой 5. Величины Кт для трифтазина и тиопроперазина мало различаются и составляют соответственно 10-330 и 22-196 мкМ в зависимости от рН. Значения Km трифтазина и тиопроперазина при рН 6,0 примерно такие же, как у о-дианизидина [Лебедева и др., 1977]. Из рН-зависимостей lgkm/ и lgk ;u,/Km реакций пероксидазного окисления трифтазина (рис. 24) и тиопроперазина (рис. 25) определяются ионогенные группы с рК 4,89, 5,64 и 5,43, 4,71 соответственно, депротонирование которых ухудшает каталитический процесс пероксидазного окисления соответственно трифтазина в 413 раз, а тиопроперазина в 82 раза. Аналогичные ионогенные группы была выявлены в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и n-аминобензойной кислоты [Dunford, Stillman, 1976].
При значениях рН 6,0 имеет место отклонение опытных кривых рН-зависимостей для 1 а//Кт от теоретической для реакций пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина, что, возможно, вызвано проявлением действия еще одной ионогенной группы свободного фермента, принимающей участие в связывании субстрата. Влияние аналогичной группы было выявлено в реакциях пероксидазного окислении о-дианизидина в работе [Лебедева и др., 1977].
В отличие от аминазина, у трифтазина и тиопроперазина, с увеличением рН Кт понижается. В кислых рН (4,5-5,5) трифтазин окисляется быстрее аминазина в 1,5-3 раза и в 9-12 раз эффективнее тиопроперазина. Константа Михаэлиса трифтазина в 2-2,5 раза больше, чем у аминазина и в 1,5-3,5 раза - тиопроперазина. Однако при рН 6,0 Кт трифтазина и тиопроперазина понижаются и становятся соизмеримы с Кт для быстро окисляемого субстрата пероксидазы - о-дианизидина [Угарова и др., 1981].
